Reconstrução de assinaturas de fluorescência inata de células únicas por microscopia confocal

Resumo

Aqui, é apresentado um protocolo para extração óptica e catalogação de assinaturas de fluorescência celular inata (ou seja, autofluorescência celular) de cada célula viva individual distribuída em um espaço tridimensional. Este método é adequado para estudar a assinatura de fluorescência inata de diversos sistemas biológicos em uma resolução unicelular, incluindo células de bactérias, fungos, leveduras, plantas e animais.

Resumo

Descrito aqui é a análise de fluorescência unicelular assistida por microscopia de reflexão confocal (CRIF), um método minimamente invasivo para reconstruir a assinatura de fluorescência celular inata de cada célula viva individual em uma população distribuída em um espaço tridimensional (3D). A assinatura de fluorescência inata de uma célula é uma coleção de sinais de fluorescência emitidos por várias biomoléculas dentro da célula. Estudos anteriores estabeleceram que as assinaturas de fluorescência inata refletem várias propriedades celulares e diferenças no estado fisiológico e são uma rica fonte de informação para caracterização e identificação celular. As assinaturas de fluorescência inata têm sido tradicionalmente analisadas no nível populacional, necessitando de uma cultura clonal, mas não no nível de célula única. O CRIF é particularmente adequado para estudos que requerem resolução 3D e/ou extração seletiva de sinais de fluorescência de células individuais. Como a assinatura de fluorescência é uma propriedade inata de uma célula, o CRIF também é adequado para a previsão livre de tags do tipo e/ou status fisiológico de células intactas e únicas. Este método pode ser uma ferramenta poderosa para análise celular simplificada, onde o fenótipo de cada célula em uma população heterogênea pode ser diretamente avaliado por sua assinatura de autofluorescência sob um microscópio sem marcação celular.

Introdução

Diversas biomoléculas dentro de uma ^célula1 emitem sinais de autofluorescência, e a assinatura de fluorescência inata de uma célula consiste na montagem desses sinais. Essa fluorescência de assinatura reflete várias propriedades celulares e também diferenças no estado fisiológico. A análise da fluorescência inata é minimamente invasiva e pode complementar sondas microbiológicas tradicionais e mais invasivas que deixam uma gama de vestígios desde modificações metabólicas leves até destruição celular completa. Enquanto técnicas tradicionais como extração de DNA ou conteúdo ^celular2,3, hibridização fluorescente in ^situ4, e a introdução de genes repórteres fluorescentes ao genoma são eficazes na determinação do tipo celular ou status fisiológico, eles geralmente requerem manipulação das células ou marcação invasiva.

Estudos da fluorescência inata de várias colônias microbianas vivas e intactas, incluindo suspensões de cultura microbiana a ^granel5,6, lodo ^ativo7, tecidos ^{mamíferos8,9} e células mamíferas1,10, mostraram que a análise de fluorescência inata facilita a análise livre de etiquetas de tipos celulares e status fisiológico. As assinaturas de fluorescência inata têm sido tradicionalmente analisadas no nível populacional e não no nível de célula única, e, portanto, necessitam de uma cultura clonal. Em contraste, a técnica de análise de fluorescência unicelular assistida por microscopia confocal (CRIF) ^descrita aqui reconstrói e cataloga a assinatura de fluorescência celular inata de cada célula microbiana viva individual. Além disso, o CRIF pode sistematicamente reunir a assinatura de fluorescência inata de uma única célula microbiana dentro de uma população que é distribuída em um espaço tridimensional (3D).

Protocolo

1. Preparação da amostra

1. Coloque uma junta de silicone de 1 mm de espessura com poços em uma lâmina de vidro.
2. Coloque uma laje de 1 mm de espessura de 0,8% (w/v) no poço da junta de silicone.
3. Diluir a densidade celular de uma cultura celular microbiana arbitrária para uma densidade óptica a 600 nm (_OD660) = 1,0.
4. Coloque uma alíquota de 5 μL de suspensão celular na laje agarose.
5. Cubra delicadamente com uma mancha de vidro.

2. Configuração de um microscópio

NOTA: A técnica CRIF combina microscopia de reflexão conocal (CRM) e microspectroscopia confocal multicanal. O CRM serve como fonte de informação para morfologia celular e localização espacial, que é independente da fluorescência inata celular. A microespectroscopia confocal multicanal fornece as informações espectrais da fluorescência inata celular. No protocolo a seguir, qualquer imagem adquirida com crm ou microspectroscopia de fluorescência conocal é referida como uma imagem DE CRM ou imagem microspectroscópcional multicanal, respectivamente.

1. Conecte um microscópio confocal com canais espectrais descanned a um tubo fotomultiplier (PMT) ou detector GaAsP.
   NOTA: Estas configurações estão disponíveis em vários fabricantes.
2. Equipar o microscópio com um objetivo de alta abertura numérica (NA) com ampliação adequada.
   NOTA: Recomenda-se um objetivo de 63x com na > 1,4 para análise de células bacterianas.
3. Equipar o microscópio com um espelho de meio reflexo (por exemplo, NT 80/20) para acomodar o CRM, que conta com a dispersão celular da luz incidente para visualizar a morfologia celular.
4. Para microespectroscopia confocrática multicanal, equipar o microscópio com espelhos dicroicos. Por exemplo, use os divisores de feixe MBS InVis405, MBS458, MBS458/514, MBS488/543 ou MBS 488/543/633 para 405, 458, 488, 514, 543 ou 633 nm de excitação, respectivamente.
5. Ajuste a intensidade de iluminação para cada comprimento de onda de excitação usando um medidor de alimentação laser. Mantenha a saída sob o microscópio constante através de comprimentos de onda de excitação (por exemplo, use 50 μW com o objetivo de 63x).

3. Aquisição de imagens

1. Ajuste o tamanho do pinhole para 1 UA usando o software de microscópio.
2. Defina o tempo de habitante do pixel (ou seja, velocidade de varredura) para cada comprimento de onda de excitação.
   NOTA: Um tempo de sono de pixels excessivamente longo pode danificar as células. Evite o tempo de consumo excessivamente longo de pixels para minimizar a fotodamagem para as células. Para amostras bacterianas, um tempo de moradia de pixel < 55,6 μs/^μm2 (quando a saída de irradiação sob o microscópio é ~17 μW/^cm2) é geralmente adequado para evitar a inibição do crescimento. Este parâmetro pode variar dependendo dos organismos e configurações experimentais.
3. Defina a resolução de digitalização. Para células pequenas, como bactérias, use uma área de varredura de 1.024 x 1.024.
4. Defina a faixa de varredura Z para que a região de interesse seja coberta.
   NOTA: Para amostras de células bacterianas e leveduras distribuídas em uma laje de agarose, uma faixa de varredura Z de ~15 μm é geralmente suficiente.
5. Defina o detector descaned para capturar a faixa de comprimento de onda visível (por exemplo, 416-691 nm). Use uma janela espectral de 8-10 nm.
6. Adquira imagens de microspectroscopia confocrática multicanal em uma sequência de comprimentos de onda de excitação mais longos e mais curtos para criar pilhas de Z de imagens de fluorescência.
7. Adquira imagens de CRM.
8. Salve as imagens adquiridas como arquivos de tiff de 16 bits em um diretório. Nomeie os arquivos usando a convenção de nomeação XXXcYYzZZ.tif, onde XXX é o comprimento de onda de excitação, YY é o número do canal do detector, ZZ é o número de fatia Z e "c" e "z" são prefixos para o número do detector e o número da fatia Z, respectivamente.
   1. Por exemplo, se uma imagem de microespectroscopia confocal multicanal for tirada com um comprimento de onda de excitação de 405 nm, ^1º canal detector da matriz do detector, e for a ^5ª fatia da pilha Z, nomeie-a como "405c01z05.tif". Para imagens de CRM, use a string "CRM" no lugar de XXX (por exemplo, "CRMc01z05.tif").
      NOTA: Decida se a segmentação 2D ou 3D é mais adequada para os dados de imagem. Use um método de segmentação 2D em situações em que pequenas células são restritas a um plano 2D (por exemplo, população bacteriana aderindo a uma superfície de vidro). Use o método de segmentação 3D em situações em que a população celular é distribuída em um espaço tridimensional (por exemplo, biofilmes e amostras de tecido) ou os tamanhos celulares são maiores que a espessura da fatia óptica (por exemplo, células de levedura, células de mamíferos). Para segmentação 2D consulte a seção 4; para segmentação 3D, consulte a seção 5.

4. Análise de imagem 2D

1. Equipar uma estação de trabalho com software de análise de imagem (por exemplo, MATLAB).
2. Realizar segmentação celular e reconstrução de assinaturas de fluorescência inata de células únicas.
   1. Abra o software de análise de imagens.
   2. Clique duas vezes e abra um dos scripts fornecidos "Script2D.m".
   3. Vá para a guia Editor e clique em Executar. Uma janela de seleção de pastas deve aparecer.
   4. Selecione o diretório criado na etapa 3.8 e clique em Abrir para prosseguir. Uma caixa de diálogo que solicita a entrada do parâmetro de segmentação aparecerá automaticamente.
      NOTA: Para fins de teste selecione o conjunto de dados fornecido ("Sample_2D"). O conjunto de dados da amostra é fornecido como um arquivo comprimido e deve ser extraído com antecedência.
   5. Insira os parâmetros de segmentação: Limiar de binarização de imagem (0−1) para binarização de imagem = 0,45, Limiar Superior para Uma Região celular (em pixels) = 200, Limiar Inferior para uma Região celular (em pixels) = 10, e O Número de Detectores = 32. Clique em OK para prosseguir.
      NOTA: Esses parâmetros podem exigir ajuste dependendo da qualidade da imagem.
   6. Uma nova janela de imagem apresentando uma imagem de CRM deve aparecer. Selecione uma região de fundo arbitrária (ou seja, área onde as células estão ausentes) para usar para subtração de fundo. Desenhe um retângulo dentro da imagem CRM por arrastar o mouse. Clique duas vezes na região selecionada para confirmar a seleção.
   7. Encontre um novo diretório chamado Signature no mesmo diretório selecionado na etapa 4.2.4.
      NOTA: O código fornecido cria automaticamente este diretório. O diretório "Signature" armazena a assinatura de fluorescência inata de cada célula microbiana dentro de uma população, à medida que .png arquivos que são numerados em série após um prefixo comum "Signature".

Análise de imagem .3D 5

1. Equipar uma estação de trabalho com o software de análise de imagens (Tabela de Materiais).
2. Realizar segmentação celular e reconstrução de assinaturas de fluorescência inata de células únicas.
   1. Abra o software de análise de imagens.
   2. Clique duas vezes e abra o script fornecido "Script3D.m".
   3. Vá para a guia Editor e clique em Executar. Uma janela de seleção de pastas deve aparecer.
   4. Selecione o diretório criado na etapa 3.8 e clique em Abrir para prosseguir. Uma caixa de diálogo que solicita a entrada dos parâmetros de segmentação aparecerá automaticamente.
      NOTA: Para fins de teste, selecione o conjunto de dados fornecido ("Sample_3D"). O conjunto de dados da amostra é fornecido como um arquivo comprimido e deve ser extraído com antecedência.
   5. Insira os parâmetros de segmentação: Limiar de binarização de imagem (0-1) para binarização de imagem = 0,01, Limiar superior para um volume de célula (em pixels) = 1.000, Limiar inferior para uma região celular (em pixels) = 20, X Tamanho do Pixel [μm/pixel] = 0,26, Y Pixel Size [μm/pixel] = 0,26, tamanho do pixel Z [μm/pixel] = 0,42, e O Número de Detectores = 32. Clique em OK para prosseguir; uma caixa de diálogo que solicita a entrada para o número de comprimentos de onda de excitação aparecerá.
      NOTA: Esses parâmetros podem exigir ajuste dependendo da qualidade da imagem.
   6. Insira o número de comprimentos de onda utilizados para aquisição de imagens (por exemplo, se 405, 488, 561, 630 forem utilizados, digite 4 na caixa de diálogo). Clique ok.
   7. Digite os comprimentos de onda de excitação em uma sequência do mais curto (ou seja, nome da caixa: Excitação nº 1) ao comprimento de onda mais longo nas caixas de diálogo. Clique em OK para prosseguir; uma nova janela de imagem que apresenta uma imagem de CRM deve aparecer.
   8. Selecione a região de fundo arbitrária (ou seja, área onde as células estão ausentes) para ser usada para subtração de fundo. Desenhe um retângulo dentro da imagem CRM por arrastar o mouse. Clique duas vezes na região selecionada para confirmar a seleção.
   9. Encontre o diretório chamado Assinatura no diretório selecionado na etapa 5.2.4.
      NOTA: O código fornecido cria automaticamente este diretório. O diretório "Signature" armazena a assinatura de fluorescência inata de cada célula microbiana dentro de uma população como .png arquivos que são numerados em série após um prefixo comum "Signature".

6. Análise estatística

NOTA: Realizar técnicas de redução dimensional (por exemplo, análise de componentes principais [PCA]) para visualizar a distribuição de hiperespectrums das populações celulares. O script fornecido (PCA.py) executa PCA para duas populações celulares (ou seja, duas classes).

1. Equipar uma estação de trabalho com a linguagem de programação e bibliotecas e módulos de acompanhamento (Tabela de Materiais).
2. Crie um diretório vazio na unidade C (ou equivalente) e nomeie o diretório "Parent_directory" (ou seja, C:/ Parent_ diretório).
3. Armazene as assinaturas de fluorescência (por exemplo, os arquivos .png gerados na etapa 4.2.7) de cada uma das duas populações celulares em dois diretórios separados.
   NOTA: Os dois diretórios devem estar localizados no "Parent_directory".
   
   C:/Parent_directory/
   putidaKT2440/
    Assinatura01.png
    Assinatura02.png
    :
   putidaKT2442/
    Assinatura01.png
    Assinatura02.png
    :
4. Baixe PCA.py no "Parent_directory".
5. Abra a interface da linha de comando da estação de trabalho.
6. Digite "python C:/Parent_directory/PCA.py" na interface da linha de comando.
7. Selecione o "Parent_directory" após a exibição da mensagem 'Selecionar diretório de destino'.
8. No "C:/Parent_directory", encontre "PCA.png", que contém um enredo PCA resultante.

Resultados

A Figura 1A mostra a assinatura típica de fluorescência unicelular de uma célula bacteriana apresentada como uma trama de espectro tradicional (superior) e como um mapa de calor (meio). A Figura 1B mostra o resultado de uma segmentação de células 2D precisa sobreposta à imagem original de CRM de uma população de bactérias do solo (Pseudomonas putida KT2440)¹². As assinaturas de fluorescência inata resultantes para a po...

Discussão

Existem dois pontos críticos neste método que precisam ser acompanhados de perto para obter resultados reprodutíveis: 1) manter a saída de energia laser sob o objetivo do microscópio consistente através de comprimentos de onda e experimentos de excitação, e 2) realizar segmentação celular precisa.

O primeiro ponto é particularmente importante quando se compara a assinatura de fluorescência inata entre diferentes experimentos. Evite simplesmente aplicar as mesmas configurações de ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Wako Chemicals	312-01193
Beam splitters	Carl Zeiss, Nikon		MBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543, or MBS 488/543/633 beam splitters (Carl Zeiss)
Confocal microscope	Carl Zeiss, Nikon		Model LSM 880 (Carl Zeiss), Model A1R (Nikon)
Cover slips	Matsunami Glass	C024601
Glass slides	Matsunami Glass	S011120
Half-reflection mirror	Carl Zeiss, Nikon		NT80/20
Laser power meter	Thorlabs		PM400 (power meter console) and S175C (sensor)
LB Broth	Nacalai tesque	20066-95	For bacteria culture
Image analysis software	The MathWorks		MATLAB version 2019a or later, Image Processing Toolbox is needed
Microscope objective	Carl Zeiss, Nikon	440762-9904	e.g. 63x plan Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss)
Microscope software	Carl Zeiss, Nikon		ZEN (Carl Zeiss),NIS-elements (Nikon)
PBS(-)	Wako Chemicals	166-23555
Programming language			Python and libraries, modules (numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter) are rquired to run the supplied PCA script.
Silicone gasket	ThermoFisher Scientific	P24744
Workstation			A high-performance workstation with discrete GPUs is recommended.
Yeast extract-peptone-dextrose (YPD) agar medium	Sigma-Aldrich	Y1500-250G	For yeast culture
YPD medium	Sigma-Aldrich	Y1375-250G