JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь представлен протокол для оптического извлечения и каталогизации врожденных клеточных флуоресцентных сигнатур (т.е. клеточной автофлуоресценции) от каждой отдельной живой клетки, распределенной в трехмерном пространстве. Этот метод подходит для изучения врожденной флуоресцентной сигнатуры различных биологических систем с одноклеточным разрешением, включая клетки бактерий, грибов, дрожжей, растений и животных.

Аннотация

Здесь описан конфокальный отражательный микроскопический анализ одноклеточной врожденной флуоресценции (CRIF), минимально инвазивный метод реконструкции врожденной клеточной флуоресцентной сигнатуры от каждой отдельной живой клетки в популяции, распределенной в трехмерном (3D) пространстве. Врожденная флуоресцентная сигнатура клетки представляет собой набор флуоресцентных сигналов, излучаемых различными биомолекулами внутри клетки. Предыдущие исследования установили, что врожденные флуоресцентные сигнатуры отражают различные клеточные свойства и различия в физиологическом статусе и являются богатым источником информации для характеристики и идентификации клеток. Врожденные флуоресцентные сигнатуры традиционно анализируются на популяционном уровне, что требует клональной культуры, но не на уровне одной клетки. CRIF особенно подходит для исследований, которые требуют 3D-разрешения и / или селективного извлечения флуоресцентных сигналов из отдельных клеток. Поскольку флуоресцентная сигнатура является врожденным свойством клетки, CRIF также подходит для безметочного прогнозирования типа и/или физиологического статуса интактных и одиночных клеток. Этот метод может быть мощным инструментом для упрощенного анализа клеток, где фенотип каждой отдельной клетки в гетерогенной популяции может быть непосредственно оценен по ее автофлуоресцентной сигнатуре под микроскопом без маркировки клеток.

Введение

Разнообразные биомолекулы внутри ячейки1 излучают автофлуоресцентные сигналы, и врожденная флуоресцентная сигнатура клетки состоит из сборки этих сигналов. Эта сигнатурная флуоресценция отражает различные клеточные свойства, а также различия в физиологическом статусе. Анализ врожденной флуоресценции является минимально инвазивным и может дополнять традиционные, более инвазивные микробиологические зонды, которые оставляют ряд следов от легкой метаболической модификации до полного разрушения клеток. Хотя традиционные методы, такие как извлечение ДНК или содержимого клеток2,3, флуоресцентная гибридизация in situ4 и введение флуоресцентных репортерных генов в геном, эффективны в определении типа клеток или физиологического статуса, они обычно требуют либо манипуляций с клетками, либо инвазивной маркировки.

Исследования врожденной флуоресценции различных живых и интактных микробных колоний, включая объемные суспензии микробных культур5,6, активные ила7, ткани млекопитающих8,9 и клетки млекопитающих1,10, показали, что анализ врожденной флуоресценции облегчает анализ типов клеток и физиологического статуса без меток. Врожденные флуоресцентные сигнатуры традиционно анализируются на уровне популяции, а не на уровне одной клетки, и, таким образом, требуют клональной культуры. В отличие от этого, метод анализа одноклеточной флюоресценции (CRIF) с помощью конфокальной рифлекционной микроскопии11, описанный здесь, реконструирует и каталогизирует врожденную клеточную флуоресцентную сигнатуру каждой отдельной живой микробной клетки. Кроме того, CRIF может систематически сопоставлять врожденную флуоресцентную сигнатуру одной микробной клетки в популяции, которая распределена в трехмерном (3D) пространстве.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Подготовка образца

  1. Поместите силиконовую прокладку толщиной 1 мм с лунками на стеклянную горку.
  2. Поместите в лунку силиконовой прокладки агарозовую плиту толщиной 1 мм толщиной 0,8% (мас./об.).
  3. Разбавьте плотность клеток произвольной культуры микробных клеток до оптической плотности при 600 нм (OD660) = 1,0.
  4. Поместите 5 мкл аликвоты клеточной суспензии на агарозную плиту.
  5. Аккуратно накройте стеклянной крышкой.

2. Настройка микроскопа

ПРИМЕЧАНИЕ: Метод CRIF сочетает в себе конфокальную отражательную микроскопию (CRM) и многоканальную конфокальную микроспектроскопию. CRM служит источником информации для клеточной морфологии и пространственной локализации, которая не зависит от клеточной врожденной флуоресценции. Многоканальная конфокальная микроспектроскопия обеспечивает спектральную информацию клеточной врожденной флуоресценции. В следующем протоколе любое изображение, полученное с помощью CRM или конфокальной флуоресцентной микроспектроскопии, называется изображением CRM или многоканальным конфокальным микроспектроскопическим изображением соответственно.

  1. Подключите конфокальный микроскоп с десканированными спектральными каналами к фотоумножительной трубке (PMT) или детектору GaAsP.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти настройки доступны от нескольких производителей.
  2. Оснастите микроскоп объективом с высокой числовой апертурой (NA) с адекватным увеличением.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объектив 63x с NA > 1.4 рекомендуется для анализа бактериальных клеток.
  3. Оснастите микроскоп зеркалом полуотражения (например, NT 80/20) для размещения CRM, который полагается на клеточный рассеяние падающего света для визуализации морфологии клеток.
  4. Для многоканальной конфокальной микроспектроскопии оснастите микроскоп дихроичными зеркалами. Например, используйте разветвители луча MBS InVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543 или MBS 488/543/633 для возбуждения 405, 458, 488, 514, 543 или 633 нм соответственно.
  5. Отрегулируйте интенсивность освещения для каждой длины волны возбуждения с помощью лазерного измерителя мощности. Держите выход под микроскопом постоянным через длины волн возбуждения (например, используйте 50 мкВт с объективом 63x).

3. Получение изображений

  1. Установите размер точечного отверстия на 1 а.е. с помощью программного обеспечения микроскопа.
  2. Установите время выдержки пикселя (т.е. скорость сканирования) для каждой длины волны возбуждения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерно длительное время выдержки пикселя может повредить клетки. Избегайте чрезмерно длительного времени выдержки пикселя, чтобы свести к минимуму фотоповреждения в ячейках. Для бактериальных образцов время выдержки пикселя <55,6 мкс/мкм2 (когда выход излучения под микроскопом составляет ~17 мкВт/см2) обычно подходит для предотвращения ингибирования роста. Этот параметр может варьироваться в зависимости от организмов и экспериментальных установок.
  3. Установите разрешение сканирования. Для небольших клеток, таких как бактерии, используйте область сканирования 1024 x 1024.
  4. Установите диапазон Z-сканирования таким образом, чтобы была охвачена интересующая область.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для образцов бактериальных и дрожжевых клеток, распределенных на агарозной плите, обычно достаточно диапазона Z-сканирования ~ 15 мкм.
  5. Установите десканированный детектор для захвата видимого диапазона длин волн (например, 416−691 нм). Используйте спектральное окно 8−10 нм.
  6. Получение многоканальных конфокальных микроспектроскопических изображений в последовательности от самых длинных до кратчайших длин волн возбуждения для создания Z-стеков флуоресцентных изображений.
  7. Получение образов CRM.
  8. Сохраните полученные изображения в виде 16-битных файлов tiff в каталог. Назовите файлы, используя соглашение об именовании XXXcYYzZZ.tif, где XXX - длина волны возбуждения, YY - номер канала детектора, ZZ - номер Z-среза, а "c" и "z" - префиксы для номера детектора и номера Z-среза соответственно.
    1. Например, если многоканальное конфокальное микроспектроскопическое изображение получено с длиной волны возбуждения 405 нм, 1-м детекторным каналом детекторной решетки, и является 5-м срезом Z-стека, назовите его «405c01z05.tif». Для изображений CRM используйте строку "CRM" вместо XXX (например, "CRMc01z05.tif").
      ПРИМЕЧАНИЕ: Решите, является ли 2D или 3D сегментация наиболее подходящей для данных изображения. Используйте метод 2D-сегментации в ситуациях, когда маленькие клетки ограничены 2D-плоскостью (например, бактериальная популяция, придерживающаяся стеклянной поверхности). Используйте метод 3D-сегментации в ситуациях, когда клеточная популяция распределена в трехмерном пространстве (например, биопленки и образцы тканей) или размеры клеток больше толщины оптического среза (например, дрожжевые клетки, клетки млекопитающих). Для 2D-сегментации обратитесь к разделу 4; Для 3D-сегментации обратитесь к разделу 5.

4. 2D анализ изображений

  1. Оснастите рабочую станцию программным обеспечением для анализа изображений (например, MATLAB).
  2. Выполнение клеточной сегментации и реконструкции одноклеточных врожденных флуоресцентных сигнатур.
    1. Откройте программное обеспечение для анализа изображений.
    2. Дважды щелкните и откройте один из предоставленных скриптов "Script2D.m".
    3. Перейдите на вкладку Редактор и нажмите кнопку Выполнить. Должно появиться окно выбора папки.
    4. Выберите каталог, созданный на шаге 3.8, затем нажмите кнопку Открыть , чтобы продолжить. Автоматически появится диалоговое окно с запросом на ввод параметра сегментации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для целей тестирования выберите предоставленный набор данных («Sample_2D»). Образец набора данных предоставляется в виде сжатого файла и должен быть извлечен заранее.
    5. Введите параметры сегментации: Порог бинаризации изображения (0−1) для бинаризации изображения = 0,45, Верхний порог для области ячейки (в пикселях) = 200, Нижний порог для области ячейки (в пикселях) = 10 и Количество детекторов = 32. Нажмите кнопку ОК , чтобы продолжить.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти параметры могут потребовать настройки в зависимости от качества изображения.
    6. Должно появиться новое окно изображения, представляющее изображение CRM. Выберите произвольную фоновую область (т. е. область, где ячейки отсутствуют), чтобы использовать ее для вычитания фона. Нарисуйте прямоугольник в изображении CRM путем перетаскивания мыши. Дважды щелкните в выбранном регионе, чтобы подтвердить выбор.
    7. Найдите новый каталог с именем Signature в том же каталоге, который был выбран на шаге 4.2.4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предоставленный код автоматически создает этот каталог. Каталог «Подпись» хранит врожденную флуоресцентную сигнатуру каждой микробной клетки в популяции в виде .png файлов, которые последовательно нумеруются после общего префикса «Подпись».

5.3D анализ изображений

  1. Оснастить рабочую станцию программным обеспечением для анализа изображений (Таблица материалов).
  2. Выполнение клеточной сегментации и реконструкции одноклеточных врожденных флуоресцентных сигнатур.
    1. Откройте программное обеспечение для анализа изображений.
    2. Дважды щелкните и откройте предоставленный скрипт "Script3D.m".
    3. Перейдите на вкладку Редактор и нажмите кнопку Выполнить. Должно появиться окно выбора папки.
    4. Выберите каталог, созданный на шаге 3.8, затем нажмите кнопку Открыть , чтобы продолжить. Автоматически появится диалоговое окно с запросом на ввод параметров сегментации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для целей тестирования выберите предоставленный набор данных («Sample_3D»). Образец набора данных предоставляется в виде сжатого файла и должен быть извлечен заранее.
    5. Введите параметры сегментации: Порог бинаризации изображения (0–1) для бинаризации изображения = 0,01, Верхний порог для объема ячейки (в пикселях) = 1000, Нижний порог для области ячейки (в пикселях) = 20, X Размер пикселя [мкм/пиксель] = 0,26, Размер пикселя Y [мкм/пиксель] = 0,26, Размер пикселя Z [мкм/пиксель] = 0,42 и Количество детекторов = 32. Нажмите кнопку ОК , чтобы продолжить; появится диалоговое окно, запрашивающее ввод количества длин волн возбуждения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти параметры могут потребовать настройки в зависимости от качества изображения.
    6. Введите количество длин волн, используемых для получения изображения (например, если используются 405, 488, 561, 630, введите 4 в диалоговом окне). Нажмите кнопку ОК.
    7. Введите длины волн возбуждения в последовательности от самой короткой (т.е. название поля: Возбуждение No 1) до самой длинной длины волны в диалоговые окна. Нажмите кнопку ОК , чтобы продолжить; должно появиться новое окно изображения, в котором представлено изображение CRM.
    8. Выберите произвольную фоновую область (т. е. область, в которой отсутствуют ячейки), которая будет использоваться для вычитания фона. Нарисуйте прямоугольник в изображении CRM путем перетаскивания мыши. Дважды щелкните в выбранном регионе, чтобы подтвердить выбор.
    9. Найдите каталог с именем Signature в каталоге, выбранном на шаге 5.2.4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предоставленный код автоматически создает этот каталог. Каталог «Подпись» хранит врожденную флуоресцентную сигнатуру каждой отдельной микробной клетки в популяции в виде .png файлов, которые последовательно нумеруются после общего префикса «Подпись».

6. Статистический анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполнение методов уменьшения размеров (например, анализ главных компонентов [PCA]) для визуализации распределения гиперспектрумов клеточных популяций. Предоставленный сценарий (PCA.py) выполняет PCA для двух клеточных популяций (т.е. двух классов).

  1. Оснастить рабочую станцию языком программирования и сопутствующими библиотеками и модулями (Таблица материалов).
  2. Создайте пустой каталог на диске C (или эквивалентном) и назовите каталог "Parent_directory" (т.е. C:/ Parent_ каталог).
  3. Храните флуоресцентные сигнатуры (например, файлы .png, сгенерированные на шаге 4.2.7) каждой из двух популяций клеток в двух отдельных каталогах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оба каталога должны быть расположены в "Parent_directory".

    C:/Parent_directory/
    figure-protocol-11388putidaKT2440/
    figure-protocol-11485 figure-protocol-11566Подпись01.png
    figure-protocol-11662 figure-protocol-11743Подпись02.png
    figure-protocol-11840 figure-protocol-11920:
    figure-protocol-12005putidaKT2442/
     figure-protocol-12104Подпись01.png
     figure-protocol-12203Подпись02.png
     figure-protocol-12302:
  4. Скачайте PCA.py в "Parent_directory".
  5. Откройте интерфейс командной строки рабочей станции.
  6. Введите "python C:/Parent_directory/PCA.py" в интерфейсе командной строки.
  7. Выберите «Parent_directory» после отображения сообщения «Выбрать целевой каталог».
  8. В поле "C:/Parent_directory" найдите "PCA.png", который содержит результирующий график PCA.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

На рисунке 1А показана типичная одноклетовая флуоресцентная сигнатура бактериальной клетки, представленная в виде традиционного участка спектра (вверху) и в виде тепловой карты (посередине). На рисунке 1B показан результат точной сегментации 2D-клеток, на...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этом методе есть две критические точки, которые необходимо внимательно соблюдать для получения воспроизводимых результатов: 1) поддерживать постоянную выходную мощность лазера под микроскопом с помощью длин волн возбуждения и экспериментов и 2) выполнять точную сегментацию клеток.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было частично поддержано грантом на научные исследования от Министерства образования, культуры, спорта и технологий Японии (18K04843) Ю. Явате, JST ERATO (JPMJER1502) до Н. Номуры.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseWako Chemicals312-01193
Beam splittersCarl Zeiss, NikonMBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543, or MBS 488/543/633 beam splitters (Carl Zeiss)
Confocal microscopeCarl Zeiss, NikonModel LSM 880 (Carl Zeiss), Model A1R (Nikon)
Cover slipsMatsunami GlassC024601
Glass slidesMatsunami GlassS011120
Half-reflection mirrorCarl Zeiss, NikonNT80/20
Laser power meterThorlabsPM400 (power meter console) and S175C (sensor)
LB BrothNacalai tesque20066-95For bacteria culture
Image analysis softwareThe MathWorksMATLAB version 2019a or later, Image Processing Toolbox is needed
Microscope objectiveCarl Zeiss, Nikon440762-9904e.g. 63x plan Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss)
Microscope softwareCarl Zeiss, NikonZEN (Carl Zeiss),NIS-elements (Nikon)
PBS(-)Wako Chemicals166-23555
Programming languagePython and libraries, modules (numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter) are rquired to run the supplied PCA script.
Silicone gasketThermoFisher ScientificP24744
WorkstationA high-performance workstation with discrete GPUs is recommended.
Yeast extract-peptone-dextrose (YPD) agar mediumSigma-AldrichY1500-250GFor yeast culture
YPD mediumSigma-AldrichY1375-250G

Ссылки

  1. Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
  2. Tang, J. Microbial metabolomics. Current Genomics. 12, 391-403 (2011).
  3. Woo, P. C., Lau, S. K., Teng, J. L., Tse, H., Yuen, K. Y. Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories. Clinical Microbiology and Infection. 14, 908-934 (2008).
  4. Amman, R., Fuchs, B. M. Single-cell identification in microbial communities by improved fluorescence in situ hybridization techniques. Nature Reviews Microbiology. 6, 339-348 (2008).
  5. Giana, H. E., Silveira, L., Zângaro, R. A., Pacheco, M. T. T. Rapid identification of bacterial species by fluorescence spectroscopy and classification through principal components analysis. Journal of Fluorescence. 13 (6), 489-493 (2003).
  6. Leblanc, L., Dufour, E. Monitoring the identity of bacteria using their intrinsic fluorescence. FEMS Microbiology Letters. 211 (2), 147-153 (2002).
  7. Hou, X., Liu, S., Feng, Y. The autofluorescence characteristics of bacterial intracellular and extracellular substances during the operation of anammox reactor. Scientific Reports. 7, 39289(2017).
  8. Ramanujam, N., et al. In vivo diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia using 337-nm-excited laser-induced fluorescence. Proceeding National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (21), 10193-10197 (1994).
  9. Zhang, J. C., et al. Innate cellular fluorescence reflects alterations in cellular proliferation. Lasers in Surgery and Medicine. 20 (3), 319-331 (1997).
  10. Gosnell, M. E., et al. Quantitative non-invasive cell characterisation and discrimination based on multispectral autofluorescence features. Scientific Reports. 6, 23453(2016).
  11. Yawata, Y., et al. Intra- and interspecies variability of single-cell innate fluorescence signature of microbial cell. Applied and Environmental Microbiology. 85, 00608-00619 (2019).
  12. Nelson, K. E., et al. Complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putida KT2440. Environmental Microbiology. 4 (12), 799-808 (2002).
  13. Bagdasarian, M., et al. Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas. Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).
  14. Luo, Y., Vijaychander, S., Stile, J., Zhu, L. Cloning and analysis of DNA-binding proteins by yeast one-hybrid and one-two-hybrid systems. Biotechniques. 20 (4), 564-568 (1996).
  15. Yawata, Y., et al. Monitoring biofilm development in a microfluidic device using modified confocal reflection microscopy. Journal of Bioscience and Bioengineering. 110 (3), 377-380 (2010).
  16. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third edition. , Springer. Germany. (2006).
  17. Blacker, T. S., Duchen, M. R. Investigating mitochondrial redox state using NADH and NADPH autofluorescence. Free Radical Biology & Medicine. 100, 53-65 (2016).
  18. Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence spectroscopy and imaging: A tool for biomedical research and diagnosis. European Journal of Histochemistry. 58 (4), 2461(2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

159

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены