JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

وصفنا ثلاث طرق لتوليد بوليمرات Ln1 ذات خصائص كسورية تشير إلى الخلايا بشكل مختلف مقارنة ب Ln1 غير المبلمر.

Abstract

Laminin-111 (Ln1) هو جزء أساسي من المصفوفة خارج الخلية في epithelia, العضلات والنظم العصبية. لقد أثبتنا سابقا أن البنية المجهرية ل Ln1 تغير الطريقة التي تشير بها إلى الخلايا ، ربما لأن تجميع Ln1 في الشبكات يكشف عن مجالات لاصقة مختلفة. في هذا البروتوكول ، نصف ثلاث طرق لتوليد Ln1 المبلمر.

Introduction

على عكس عوامل النمو أو السيتوكينات ، يمكن أن تتجمع بروتينات المصفوفة خارج الخلية (ECM) في شبكات هيكلية. نظرا لأن الخلل الوظيفي في ECM هو عنصر أساسي في العديد من الحالات المرضية ، فإن الآليات التي تستشعر بها الخلايا الإشارات وتنقلها من تكوين ECM والبنية المجهرية والميكانيكا الحيوية هي أهداف جذابة للتطوير العلاجي. تشير الأدلة المتزايدة إلى أن البنية المجهرية لهذه الشبكات تلعب دورا رئيسيا في كيفية إشارة هذه البروتينات إلى الخلايا. حتى الآن ، تم إظهار هذا الارتباط بين البنية المجهرية ECM ووظيفة الخلية للكولاجين I1 و fibronectin2 و fibrin3.

Laminin-111 (Ln1) هو بروتين ثلاثي الشكل متقاطع يعد مكونا هيكليا رئيسيا للمصفوفة خارج الخلية التي تتصل بالخلايا الظهارية4 وخلايا العضلات5 والخلايا العصبية6. في الغدة الثديية ، Ln1 ضروري للتمايز الوظيفي للخلايا الظهارية للغدة الثديية إلى خلايا منتجة للحليب 7،8،9 ، و Ln1 ضروري لتحريض ارتداد الورم10،11. Ln1 وغيرها من الصفيحات ضرورية لتطوير شبكات الأكتين القشرية وتنظيم الساركوليما في العضلات12،13 ، ولهجرة الخلايا العصبية ونمو الخلايا العصبية13 . وبالتالي ، فإن فهم الآليات التي يشير بها اللامينين إلى الخلايا هو مجال نشط للبحث.

يحتوي Ln1 على مجالات لاصقة متعددة لمجموعة واسعة من المستقبلات بما في ذلك الانتغرينات ، والسينديكان ، والديستروغليكان ، و LBP-110 و LamR (الشكل 1A) 4,14. جزء E8 ، الذي يحتوي على المجالات الكروية c-terminus من laminin α1 ، ضروري لربط dystroglycan و integrins α6β1 و α3β115 ، وهو ضروري للتمايز الوظيفي للخلايا الظهارية 15,16. في المقابل ، تظهر الأذرع القصيرة نشاطا بيولوجيا مختلفا17 ، مما يعني أن توفر التعرف على مجال Ln1 المختلف بعد تكوين الشبكة يمكن أن يغير سلوك الخلية.

لقد أثبتنا مؤخرا أن Ln1 مرتبة في شبكة بوليمرية تعرض خصائص كسورية (أي بنية متشابهة ذاتيا عبر مقاييس طول متعددة)18. تشير الشبكات الكسورية بشكل مختلف إلى الخلايا الظهارية مقارنة ب Ln1 ، الذي يفتقر إلى هذا الترتيب19. تشير هذه الشبكة الكسورية إلى بنية تجميع معينة ، حيث يتعرض الذراع الطويل بشكل تفضيلي للخلايا18. نتيجة لهذا العرض المختلف للذراع الطويلة ، تخضع الخلايا الظهارية للتمايز الوظيفي إلى خلايا منتجة للحليب ذات تقاطعات ضيقة جيدة التنظيم وقمع ألياف إجهاد الأكتين19.

وصفنا 3 طرق لتوليد شبكات Ln1 من تفاعلات ربط الذراع القصيرة والذراع القصيرة ، والتي تظهر عرضا عاليا للذراع الطويلة Ln1: 1) عن طريق التجميع الخالي من الخلايا مع المخازن المؤقتة الحمضية ، 2) عن طريق الحضانة المشتركة مع البروتينات السكرية ، أو 3) عن طريق التفاعل مع سطح الخلية dystroglycan. تولد هذه الطرق الثلاث هياكل مجهرية متشابهة لللامينين من خلال ثلاث آليات مختلفة للغاية ، مما يسمح بالمرونة في التصميم التجريبي. تشير الأبحاث السابقة إلى أن هذه الطرق الثلاث يمكن أن تمثل المتانة البيولوجية: في الغدة الثديية epithelia، يمكن أن يؤدي إما ديستروغليكان سطح الخلية أو البروتينات السكرية أو اللامينين ذو البنية الاصطناعية إلى تحفيز التمايز الوظيفي19. وبالتالي ، يمكن للباحثين الاختيار بين هذه الطرق بناء على موضوع الدراسة: لا تظهر خلايا التعبير عن dystroglycan أي حساسية للبنية المجهرية Ln-1 ، حيث أن dystroglycan في غشاء الخلية يحفز البلمرة الصحيحة في شبكة كسورية19,20. يمثل Matrigel ، وهو مزيج من laminins والبروتينات السكرية21 ، المصدر الأكثر اقتصادا ل Ln-1 ، ويوفر البنية المجهرية اللازمة لحث الخلايا الثديية dystroglycan بالضربة القاضية على التمييزبين 20 ، ولكنه يحتوي على مزيج معقد من البروتينات مع الكثير من التباين إلى الكثير. يمثل PolyLM النظام الأنظف والأكثر اختزالا الذي يوفر هذه الوظيفة ، ولكن بتكلفة متزايدة وفعالية أقل للحث على تمايز الخلايا الثديية مقارنة ب Matrigel19.

هذه الطرق الثلاث لها بنية شبكة كسورية مميزة للتجميع المحدود للانتشار18،19 ، وتظهر نشاطا بيولوجيا متغيرا مقارنة باللامينين المجمع في أنظمة تجريبية متعددة22،23،24،25. يمكن للدراسات المستقبلية باستخدام هذه الطرق تحديد المستقبلات والإشارات اللازمة للتمايز الظهاري وتحديد استعادة تفاعلات مصفوفة الخلايا الطبيعية في الخلايا في البيئات الدقيقةغير الطبيعية 20 ، مثل الأورام.

Protocol

1. ذوبان الجليد والقسمة laminin-111

ملاحظة: يتوفر اللامينين 111 المنقى تجاريا (عادة ما يتم تنقيته من مصفوفة EHS التي تباع باسم Matrigel) ، ولكن لا توفر جميع المصادر بروتينا سليما وغير متحلل.

  1. تأكد من أن Ln1 لا يتحلل عن طريق الحصول على Ln1 وتشغيل كروماتوغرافيا استبعاد الحجم26 أو الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد26. يجب أن يحتوي Ln1 المشوه على نطاقات عند 337 كيلو دالتون و 197 كيلو دالتون و 177 كيلو دالتون ، ويجب أن يكون ل Ln1 الأصلي نطاق واحد عند 711 كيلو دالتون.
  2. قم بإذابة Ln1 على الثلج في الثلاجة طوال الليل ، وقم بالقسمة في أنابيب طرد مركزي دقيقة منخفضة البروتين (عادة ما تكون القسمة عند 100 ميكروغرام / أنبوب لتراكبات الاستزراع ، أو 10 ميكروغرام للطلاء) باستخدام أطراف ربط منخفضة البروتين وتقنية معقمة27. تجمد القسامات وتخزن في درجة حرارة -80 درجة مئوية.

2. بلمرة اللامينين باستخدام مخازن منخفضة الأس الهيدروجيني

  1. اصنع عازلة للبلمرة polyLM: قم بوزن وخلط 1 mM CaCl2 و 20 mM من أسيتات الصوديوم في ماء فائق النقاء. ثم اضبط الرقم الهيدروجيني على 4.0 ، باستخدام حمض الهيدروكلوريك أو حمض الخليك. مرشح معقم من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر ، ويخزن في 4 درجات مئوية.
  2. اصنع مخزن بلمرة التحكم: امزج 1 mM CalCl2 و 20 mM Tris واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.0 ، باستخدام 10 N HCl أو 12 N NaOH حسب الضرورة. مرشح معقم من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر ، ويخزن في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
  3. قم بإذابة العدد المطلوب من قسامات Ln-1 في الثلاجة طوال الليل.
  4. باستخدام تقنية زراعة الخلايا المعقمة ، أضف المخزن المؤقت المناسب (إما مخزن بلمرة polyLM من الخطوة 2.1 أو مخزن بلمرة التحكم من الخطوة 2.2) إلى قسامات اللامينين بتركيز نهائي قدره 100 ميكروغرام / مل (أي أضف 0.5 مل إلى 50 ميكروغرام من القسامة) واخلطها برفق عن طريق الماصة.
  5. في حالة استخدام اللامينين الموسوم بالفلورسنت للتصور ، أعد تكوينه وأضفه بنسبة 1:50 وزن / وزن (على سبيل المثال 2 ميكروغرام / 100 ميكروغرام) واخلطه برفق عن طريق الماصة.
    ملاحظة: في حالة استخدام اللامينين كركيزة لمرفق الخلية ، اتبع الخطوات 2.6-2.8:
  6. مباشرة بعد التخفيف في المخزن المؤقت المناسب ، انقل الصفيحات إلى بلاستيك أو الأواني الزجاجية واحتضانها طوال الليل في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية. لاحظ أنه عند طلاء أغطية الغطاء ، أضف حجما كبيرا بما يكفي لإنتاج انخفاض متوازن (عادة ، استخدم 50 ميكرولتر لغطاء دائري 13 مم) ، واحفظه في غرفة مرطبة طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
  7. باستخدام تقنية معقمة27 ، يغسل مع 1x محلول ملحي مخزن الفوسفات (PBS).
  8. قم بإزالة السائل بعناية. لا تدع السطح يجف تماما.
    ملاحظة: في حالة استخدام اللامينين لتغطية الخلايا لتحريض بروتين الحليب ، اتبع الخطوات 2.9-2.12:
  9. ثقافة الخلايا الظهارية الثديية. ثقافة MepG dystroglycan يطرق في (DgKI) أو MepG خلايا الضربة القاضية dystroglycan (DgKO) الخلايا في DMEM-F12 تستكمل مع 2 ٪ FBS ، 0.01 ملغ / مل الأنسولين ، 0.005 ميكروغرام / مل EGF ، 0.05 ملغ / مل جنتاميسين ، و 0.05 غرام / مل نورموسين.
  10. بذور خلايا DgKO و DgKI لتحفيز اللامينين عند 10500 خلية / سم2 في أطباق البئر أو أطباق قاع الغطاء
  11. احتضان اللامينين المخفف في حاضنة زراعة الخلايا على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  12. قسام polyLM لأجهزة الطرد المركزي عند 2000 × جم لمدة 20 دقيقة ، ولكن أجهزة الطرد المركزي LM في درجة حموضة محايدة عند 20000 × جم لمدة 20 دقيقة بسبب الحجم الأصغر لكيانات البروتين والحاجة إلى سرعات أعلى للتجميع بفعالية.
  13. باستخدام تقنيةالتعقيم 27 ، قم بإزالة المادة الطافية برفق ، وأعد تعليقها في حجم مناسب من وسط الحث DMEM-F12 المكمل ب 3 ميكروغرام / مل برولاكتين ، 2.8 ميكرومتر هيدروكورتيزون ، و 5 ميكروغرام / مل من الأنسولين
  14. نقل اللامينين في وسط زراعة الخلايا على الفور لتحفيز الخلايا. لقد نجحنا في تحفيز الخلايا باستخدام 50-800 ميكروغرام / مل Ln1

3. بلمرة اللامينين باستخدام البروتينات السكرية المعزولة

  1. قم بإذابة nidogen-1 و Ln1 المؤتلف برفق على الثلج في الثلاجة طوال الليل.
  2. امزج Ln1 مع nidogen-1 بنسبة 1: 1 بالوزن / الوزن في وسط زراعة الخلايا باستخدام أطراف وأنابيب ربط منخفضة البروتين وباستخدام تقنية معقمة. استخدم Ln1 النقي في وسط زراعة الخلايا كعنصر تحكم.
  3. في حالة استخدام اللامينين الموسوم بالفلورسنت للتصور ، أعد تكوينه وأضفه بنسبة 1:50 بالوزن / الوزن (على سبيل المثال ، 2 ميكروغرام / 100 ميكروغرام). تخلط بلطف عن طريق الماصة.
  4. احتضان Ln1-nidogen أو التحكم في Ln1 في حاضنة زراعة الخلايا على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  5. البوليمرات المشتركة للطرد المركزي Ln1-nidogen عند 2000 × جم لمدة 30 دقيقة والتحكم Ln1 عند 20000 × جم لمدة 30 دقيقة.
  6. قم بإزالة المادة الطافية برفق وأعد تعليقها في وسط زراعة الخلايا إلى تركيز نهائي يتراوح بين 100-800 ميكروغرام من البروتين الكلي / مل.
  7. استخدميه على الفور لتحفيز الخلايا ، أو انقله إلى أغطية الغطاء واتركه يلتصق طوال الليل عند 37 درجة مئوية في حاضنات زراعة الخلايا المرطبة.
  8. قم بإزالة وسط الثقافة من أغطية الغطاء ، واغسل أغطية الغطاء باستخدام 1x PBS ، ثم ثبته بنسبة 10٪ فورمالين (أي 4٪ فورمالديهايد في PBS) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

4. بلمرة اللامينين باستخدام خلايا التعبير عن الديستروغليكان

  1. ثقافة الخلايا الظهارية الثديية. ثقافة MepG dystroglycan يطرق في (DgKI) أو MepG خلايا الضربة القاضية dystroglycan (DgKO) الخلايا في DMEM-F12 تستكمل مع 2 ٪ FBS ، 0.01 ملغ / مل الأنسولين ، 0.005 ميكروغرام / مل EGF ، 0.05 ملغ / مل جنتاميسين ، و 0.05 غرام / مل نورموسين.
  2. خلايا البذور DgKI عند 5000 خلية / سم2 ، وخلايا DgKO البذور عند 8000 خلية / سم2 بسبب الاختلافات في معدلات النمو. استزراع عند 37 درجة مئوية في حاضنات مرطبة مع تغيير الوسائط كل 2-3 أيام وممرات كل 4-5 أيام باستخدام تقنية معقمة صارمة. عد الخلايا بعناية باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلاياالآلي 27 لضمان معدلات النمو المناسبة.
  3. خلايا البذور لتحفيز اللامينين عند 10500 خلية / سم2 في أطباق البئر أو أطباق قاع الغطاء والاستزراع لمدة يومين ، باستخدام خلايا DgKI لتوليد خلايا كسورية Ln1 و DgKO كضوابط سلبية. قم بإذابة Ln-1 برفق طوال الليل على الثلج في الثلاجة ، ثم امزجه مع وسيط الحث DMEM-F12 المكمل ب 3 ميكروغرام / مل برولاكتين ، 2.8 ميكرومتر هيدروكورتيزون ، و 5 ميكروغرام / مل من الأنسولين. بالنسبة لطبق 35 مم ، استخدم 1 مل من الوسائط الحثية مع 50-800 ميكروغرام من Ln1.
  4. في حالة استخدام الفلورسنت Ln1 ، امزج بنسبة 50: 1 بالوزن / الوزن.
  5. إزالة الوسائط من الخلايا ، وتغطيتها باللامينين والوسائط الحثية من DMEM-F12 المكمل ب 3 ميكروغرام / مل برولاكتين ، 2.8 ميكرومتر هيدروكورتيزون ، و 5 ميكروغرام / مل من الأنسولين
  6. خلايا الثقافة لمدة 2 أيام ، ثم إصلاح مع 10 ٪ الفورمالين.

5. توصيف البنية المجهرية لللامينين عن طريق الفحص المجهري الضوئي

  1. اجمع عينات ثابتة واغسلها 3 مرات باستخدام 1x PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  2. قم بحظر العينات واختراقها في 1x PBS مع 0.5٪ Triton X-100 ، و 3٪ ألبومين مصل بقري ، و 10٪ مصل ماعز ، و 40 ميكروغرام / مل شظية الأجسام المضادة المضادة للفأر لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في غرفة مرطبة.
    ملاحظة: Triton X-100 خطير. تعامل مع القفازات وحماية العين وتخلص منها بشكل مناسب.
  3. امزج الأجسام المضادة المضادة لللامينين بتخفيف 1: 100 مع 1x PBS مع 0.5٪ Triton X-100 و 3٪ BSA وأضفه إلى العينات لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية في غرفة مرطبة (عادة ما تستخدم صناديق الأطراف مع مسح مختبر مبلل في الأسفل).
  4. قم بإزالة الأجسام المضادة الأولية واغسلها 3 مرات باستخدام 1x PBS مع 0.5٪ Triton X-100 و 3٪ BSA.
  5. أضف جسما مضادا ثانويا مناسبا بتخفيف 1: 500 إلى العينات في 1x PBS مع 0.5٪ Triton X-100 و 3٪ BSA واحتضانها في درجة حرارة الغرفة في الظلام في غرفة مرطبة.
  6. قم بإزالة الأجسام المضادة الثانوية واغسلها 3 مرات باستخدام 1x PBS مع 0.5٪ Triton X-100 و 3٪ BSA.
  7. بالنسبة للعينات التي تحتوي على خلايا ، أضف 6 ميكرومتر من القضيب لمدة 45 دقيقة ، متبوعا ب 3 غسلات مع PBS مع 0.5٪ Triton X-100 و 3٪ BSA ، متبوعا ب 3 غسلات مع PBS. ثم تلطخ ب 0.1 ميكروغرام / مل DAPI في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
  8. قم بتركيب العينات إذا كان ذلك مناسبا.
  9. هيكل الصورة ln-1 باستخدام المجهر متحد البؤر عالي الدقة. استخدم مجهر المسح بالليزر المجهز بأهداف الغمر (خطة الغمر في الماء Apochromat 40X / 1.1NA أو خطة الغمر بالزيت Apochromat 63X / 1.4NA).

6. توصيف تركيبات اللامينين عبر أبعاد عد الصناديق

  1. قم بتحليل خصائص الفركتلات باستخدام خوارزميات أبعاد عد الصناديق المتوفرة في صناديق أدوات Matlab أو في ImageJ. هذه الطرق عتبة صور laminin ورسم على سجل سجل رسم عدد المربعات التي تحتوي على Ln1 مقارنة بحجم الصناديق. ميل العلاقة بين هذه المعلمات هو بعد عد المربعات: سيكون للهندسة غير الفركتالية بعد 0 أو 1 أو 2 ، في حين أن الهندسة الكسورية لها بعد غير صحيح28.
    ملاحظة: المعالجة بالحمض والمعالجة بالبروتين السكري و DgKI المرتبطة بالخلايا Ln1 جميعها لها بعد كسورية عد الصناديق ~ 1.7 ، في حين أن التحكم Ln1 له بعد كسورية 2.0.

7. توصيف تركيبات اللامينين عن طريق المجهر الإلكتروني

  1. أعد تعليق الصفيحات في وسط زراعة الخلايا واتركها تمتص رقائق السيليكا لمدة 90 دقيقة في بيئة رطبة تبلغ 37 درجة مئوية.
  2. إصلاح المصفوفات في 2.5٪ جلوتارالدهيد في 0.1 M كاكوديلات الصوديوم العازلة عند درجة الحموضة 7.2.
    ملاحظة: الجلوتارالدهيد خطير ويجب التعامل معه في غطاء دخان مع قفازات وحماية للعين والتخلص منه كنفايات خطرة.
  3. مصفوفات Postfix في رابع أكسيد الأوزميوم 1٪ في محلول كاكوديلات الصوديوم 0.1 M عند الرقم الهيدروجيني 7.2.
    ملاحظة: رابع أكسيد الأوزميوم خطير ويجب التعامل معه في غطاء دخان مع قفازات وحماية للعين والتخلص منه بشكل مناسب. الكاكوديلات خطير ويجب التعامل معه في غطاء دخان مع قفازات وحماية للعين والتخلص منه بشكل مناسب.
  4. يغسل 3 مرات في المخزن المؤقت كاكوديلات الصوديوم عند درجة الحموضة 7.2.
  5. يجفف مع زيادة تركيزات الإيثانول.
  6. رش مصفوفات معطف بطبقة رقيقة من الذهب.
  7. صورة باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح.

النتائج

Laminin-111 هو بروتين ثلاثي مع ثلاثة مجالات ذاتية التجميع في نهاية أذرعه القصيرة (الشكل 1 أ). عند معالجتها بشكل مناسب ، يمكن أن تتبلمر الأذرع القصيرة إلى شبكة سداسية (الشكل 1ب ، 1 ج) ، والتي تعرض خصائص كسورية مجمعة محدودة الانتشار على نطاقات مكانية أكبر (

Discussion

تمثل اللامينين عنصرا أساسيا في ECM في أنظمة الأعضاء الظهارية والعضلية والعصبية ، وقد ثبت في المختبر أنها تلعب أدوارا أساسية في تنظيم التمايز الوظيفي للخلايا. تشير الأدلة المتزايدة إلى أن بنية اللامينين المعروضة على الخلايا تنظم إشاراتها والنمط الظاهري للخليةالناتج 15،

Disclosures

تم تنفيذ هذا العمل تحت رعاية وزارة الطاقة الأمريكية من قبل مختبر لورانس ليفرمور الوطني بموجب العقد DE-AC52-07NA27344. إصدار الدردشة LLNL-JRNL-799443.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل من قبل مختبر لورانس ليفرمور الوطني LDRD 18-ERD-062 (إلى CR). شكرا لجون موشلر على هديته الكريمة من خلايا DgKO و DgKI. شكرا للموظفين في مختبر المجهر الإلكتروني بجامعة كاليفورنيا بيركلي على المشورة والمساعدة في إعداد عينات المجهر الإلكتروني وجمع البيانات.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10% formalinSigma AldrichHT501128
Anti-Laminin primary antibodySigma AldrichL9393
Anti-Rabbit Alexafluor 488 secondary antibodyThermoA32731
Bovine Serum AlbuminSigma AldrichA9418
CaCl2Sigma AldrichC4901 or similar
Cell Culture IncubatorThermoHeracell 150 or similar
Centrifuge for microcentrifuge tubesEppendorf5418 or similar
Confocal MicroscopeZeissLSM 710 or equivalent
CoverslipsThermo25CIR-1 or similar
DMEM-F12, Liquid, High Glucose, +HEPES, L-glutamine, +Phenol redThermo11330107
EGF (Epidermal Growth Factor)Sigma Aldrich11376454001
Fluorescently Labeled LamininCytoskeleton IncLMN02
GentamicinVWRVWRV0304-10G
GlutaraldehydeSigma AldrichG5882
HClSigma Aldrich320331 or similar
HydrocortisoneSigma-AldrichH0888-5G
InsulinSigma Aldrich16634-50mg
MepG Dystroglycan Knockout CellsLBNLN/A
NaOHSigma AldrichS8045 or similar
NormocinInvivogenant-nr-1
Osmium TetroxideSigma Aldrich75633
Ovine ProlactinLos Angeles Biomedical Research InstituteOvine Pituitary Prolactin
PhalloidinThermoA22287
Phosphate Buffered SalineThermo10010023 or similar
Purified Laminin-111Sigma AldrichL2020-1MG
Recombinant human Nidogen-1, carrier freeR&D systems2570-ND-050
Sodium AcetateSigma AldrichS2889 or similar
Sodium CacodylateSigma AldrichC0250
Sterile filtersMilliporeSLGP033RS or similar
TrisSigma Aldrich252859 or similar
Triton X-100Sigma-AldrichX100
Ultra-low protein binding tubesVWR76322-516, 76322-522 or similar
Ultrapure waterThermo15230253 or similar

References

  1. Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).
  2. Wang, K., et al. Stiffening and unfolding of early deposited-fibronectin increase proangiogenic factor secretion by breast cancer-associated stromal cells. Biomaterials. 54, 63-71 (2015).
  3. Bruekers, S. M. C., et al. Fibrin-fiber architecture influences cell spreading and differentiation. Cell Adhesion & Migration. 10 (5), 495-504 (2016).
  4. Yurchenco, P. D. Integrating Activities of Laminins that Drive Basement Membrane Assembly and Function. Curr Top Membr. 76, 1-30 (2015).
  5. Colognato, H., Winkelmann, D. A., Yurchenco, P. D. Laminin Polymerization Induces a Receptor-Cytoskeleton Network. The Journal of Cell Biology. 145 (3), 619-631 (1999).
  6. Powell, S. K., Kleinman, H. K. Neuronal laminins and their cellular receptors. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 29 (3), 401-414 (1997).
  7. Li, M. L., et al. Influence of a reconstituted basement membrane and its components on casein gene expression and secretion in mouse mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (1), 136-140 (1987).
  8. Fiore, A., et al. Laminin-111 and the Level of Nuclear Actin Regulate Epithelial Quiescence via Exportin-6. Cell Rep. 19 (10), 2102-2115 (2017).
  9. Inman, J. L., Robertson, C., Mott, J. D., Bissell, M. J. Mammary gland development: cell fate specification, stem cells and the microenvironment. Development. 142 (6), 1028-1042 (2015).
  10. Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. Journal of Cell Biology. 137 (1), 231-245 (1997).
  11. Furuta, S., Ren, G., Mao, J. -. H., Bissell, M. J. Laminin signals initiate the reciprocal loop that informs breast-specific gene expression and homeostasis by activating NO, p53 and microRNAs. eLife. 7, 26148 (2018).
  12. Brown, S. C., et al. Dystrophic phenotype induced in vitro by antibody blockade of muscle alpha-dystroglycan-laminin interaction. Journal of Cell Science. 112 (2), 209 (1999).
  13. Calof, A. L., Campanero, M. R., O'Rear, J. J., Yurchenco, P. D., Landert, A. D. Domain-specific activation of neuronal migration and neurite outgrowth-promoting activities of laminin. Neuron. 13 (1), 117-130 (1994).
  14. Li, S., et al. Laminin-sulfatide binding initiates basement membrane assembly and enables receptor signaling in Schwann cells and fibroblasts. The Journal of Cell Biology. 169 (1), 179-189 (2005).
  15. Sonnenberg, A., et al. Integrin recognition of different cell-binding fragments of laminin (P1, E3, E8) and evidence that alpha 6 beta 1 but not alpha 6 beta 4 functions as a major receptor for fragment E8. The Journal of Cell Biology. 110 (6), 2145-2155 (1990).
  16. Sorokin, L., Sonnenberg, A., Aumailley, M., Timpl, R., Ekblom, P. Recognition of the laminin E8 cell-binding site by an integrin possessing the alpha 6 subunit is essential for epithelial polarization in developing kidney tubules. The Journal of Cell Biology. 111 (3), 1265-1273 (1990).
  17. Horejs, C. -. M., et al. Biologically-active laminin-111 fragment that modulates the epithelial-to-mesenchymal transition in embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (16), 5908-5913 (2014).
  18. Hochman-Mendez, C., Cantini, M., Moratal, D., Salmeron-Sanchez, M., Coelho-Sampaio, T. A Fractal Nature for Polymerized Laminin. PLOS ONE. 9 (10), 109388 (2014).
  19. Kent, A. J., et al. The microstructure of laminin-111 compensates for dystroglycan loss in mammary epithelial cells in downstream expression of milk proteins. Biomaterials. 218, 119337 (2019).
  20. Weir, M. L., et al. Dystroglycan loss disrupts polarity and beta-casein induction in mammary epithelial cells by perturbing laminin anchoring. Journal of Cell Science. 119, 4047-4058 (2006).
  21. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  22. Palmero, C. Y., et al. The follicular thyroid cell line PCCL3 responds differently to laminin and to polylaminin, a polymer of laminin assembled in acidic pH. Molecular and Cellular Endocrinology. 376 (1), 12-22 (2013).
  23. Hochman-Mendez, C., Lacerda de Menezes, J. R., Sholl-Franco, A., Coelho-Sampaio, T. Polylaminin recognition by retinal cells. Journal of Neuroscience Research. 92 (1), 24-34 (2014).
  24. Leal-Lopes, C., Grazioli, G., Mares-Guia, T. R., Coelho-Sampaio, T., Sogayar, M. C. Polymerized laminin incorporation into alginate-based microcapsules reduces pericapsular overgrowth and inflammation. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 13 (10), 1912-1922 (2019).
  25. Paccola Mesquita, F. C., Hochman-Mendez, C., Morrissey, J., Sampaio, L. C., Taylor, D. A. Laminin as a Potent Substrate for Large-Scale Expansion of Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Closed Cell Expansion System. Stem Cells International. 2019, 9 (2019).
  26. Walker, J. M., Walker, J. M. . The Protein Protocols Handbook. , 61-67 (2002).
  27. Freshney, R. I. . Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques. 7th edition. , (2016).
  28. Mandelbrot, B. . The Fractal Geometry of Nature. , (1982).
  29. Schittny, J. C., Yurchenco, P. D. Terminal short arm domains of basement membrane laminin are critical for its self-assembly. Journal of Cell Biology. 110 (3), 825-832 (1990).
  30. Schuger, L., Yurchenco, P., Relan, N. K., Yang, Y. Laminin fragment E4 inhibition studies: basement membrane assembly and embryonic lung epithelial cell polarization requires laminin polymerization. International Journal of Developmental Biology. 42 (2), 217-220 (1998).
  31. Colognato, H., Yurchenco, P. D. Form and function: the laminin family of heterotrimers. Developmental Dynamics. 218 (2), 213-234 (2000).
  32. Kabaeva, Z., Meekhof, K. E., Michele, D. E. Sarcolemma instability during mechanical activity in Large myd cardiac myocytes with loss of dystroglycan extracellular matrix receptor function. Human Molecular Genetics. 20 (17), 3346-3355 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Laminin 111 Epithelia Ln1 Ln1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved