Gerando uma Microestrutura Fractal de Laminina-111 para Sinalizar para Células

Resumo

Descrevemos três métodos para gerar polímeros Ln1 com propriedades fractais que sinalizam para as células de forma diferente em comparação com Ln1 não polimerizado.

Resumo

A laminina-111 (Ln1) é parte essencial da matriz extracelular nos epitélios, sistemas muscular e neural. Nós demonstramos anteriormente que a microestrutura de Ln1 altera a maneira como ele sinaliza para as células, possivelmente porque a montagem de Ln1 em redes expõe diferentes domínios adesivos. Neste protocolo, descrevemos três métodos para gerar Ln1 polimerizado.

Introdução

Ao contrário dos fatores de crescimento ou citocinas, as proteínas da matriz extracelular (MEC) podem se agrupar em redes estruturais. Como a disfunção da MEC é um elemento-chave de muitas condições de doença, os mecanismos pelos quais as células detectam e transduzem sinais da composição, microestrutura e biomecânica da MEC são alvos atraentes para o desenvolvimento terapêutico. Evidências crescentes sugerem que a microestrutura dessas redes desempenha um papel importante em como essas proteínas sinalizam para as células. Até o momento, essa ligação entre a microestrutura da MEC e a função celular tem sido demonstrada para colágeno I¹, fibronectina² e fibrina³.

A laminina-111 (Ln1) é uma proteína trimérica, em forma de cruz, que é um componente estrutural chave da matriz extracelular que entra em contato com células epiteliais⁴, células musculares⁵ e células neurais⁶. Na glândula mamária, o Ln1 é necessário para a diferenciação funcional das células epiteliais da glândula mamária em células produtoras de leite7,8,9, e o Ln1 é crucial para a indução da reversão tumoral ^10,11. Ln1 e outras lamininas são necessárias para o desenvolvimento de redes corticais de actina e organização do sarcolema no músculo^12,13, e para migração de células neurais e crescimento de neuritos¹³ . Assim, compreender os mecanismos pelos quais a laminina sinaliza para as células é uma área ativa de pesquisa.

Ln1 contém múltiplos domínios adesivos para uma ampla gama de receptores, incluindo integrinas, sindecanos, distroglicanos, LBP-110 e LamR (Figura 1A)^4,14. O fragmento E8, que contém os domínios globulares c-terminais da laminina α1, é necessário para a ligação de distroglicanos e integrinas α6β1 e α3β1¹⁵, sendo necessário para a diferenciação funcional das células epiteliais ^15,16. Em contraste, os braços curtos apresentam atividade biológica diferente¹⁷, o que significa que a disponibilidade para o reconhecimento desses diferentes domínios Ln1 após a formação da rede poderia alterar o comportamento celular.

Recentemente, demonstramos que Ln1 arranjado em uma rede polimérica exibe propriedades fractais (isto é, uma estrutura que é auto-similar em múltiplas escalas de comprimento)¹⁸. As redes fractais sinalizam diferentemente às células epiteliais em relação ao Ln1, que não possui esse arranjo¹⁹. Essa rede fractal indica uma estrutura particular de montagem, onde o braço longo é preferencialmente exposto às células¹⁸. Como resultado dessa exibição de braço longo diferente, as células epiteliais sofrem diferenciação funcional em células produtoras de leite com tight junctions bem organizadas e supressão das fibras de estresse de actina¹⁹.

Descrevemos 3 métodos para gerar redes Ln1 a partir de interações de ligação braço curto-braço curto, que mostram uma alta exibição do braço longo de Ln1: 1) por montagem livre de células com tampões ácidos, 2) por co-incubação com glicoproteínas, ou 3) por interação com distroglicanos de superfície celular. Estes três métodos geram microestruturas de laminina semelhantes através de três mecanismos muito diferentes, permitindo flexibilidade no planejamento experimental. Trabalhos anteriores sugerem que esses três métodos podem representar robustez biológica: no epitélio da glândula mamária, tanto distroglicanos de superfície celular, glicoproteínas ou laminina estruturada artificialmente podem induzir diferenciação funcional¹⁹. Assim, os pesquisadores podem escolher entre esses métodos com base no objeto de estudo: células que expressam distroglicanos não apresentam sensibilidade à microestrutura de Ln-1, pois o distroglicano na membrana celular induz a polimerização correta em uma rede fractal^19,20. Matrigel, uma mistura de lamininas e glicoproteínas²¹, representa a fonte mais econômica de Ln-1, e oferece a microestrutura necessária para induzir células mamárias knockout distroglicanos a diferenciar²⁰, mas contém uma mistura complexa de proteínas com variabilidade lote a lote. O PolyLM representa o sistema mais limpo e reducionista que proporciona essa função, porém com maior custo e menor eficácia para induzir a diferenciação das células mamárias em relação ao Matrigel¹⁹.

Esses três métodos apresentam estrutura de rede fractal característica de agregação limitada à^{difusão18,19} e apresentam atividade biológica alterada em relação à laminina agregada em múltiplos sistemas experimentais22,23,24,25. Estudos futuros utilizando esses métodos poderiam identificar os receptores e a sinalização necessários para a diferenciação epitelial e determinar a restauração de interações normais célula-matriz em células em microambientes^anormais20, como tumores.

Protocolo

1. Descongelar e alíquota laminina-111

NOTA: A laminina-111 purificada está disponível comercialmente (normalmente purificada a partir da matriz de EHS vendida como Matrigel), mas nem todas as fontes fornecem proteína intacta e não degradada.

1. Confirmar que Ln1 não é degradado por fornecimento de Ln1 e cromatografia de exclusão de tamanho de corrida²⁶ ou eletroforese em gel de poliacrilamida²⁶. Ln1 desnaturado deve ter bandas em 337 kDa, 197 kDa e 177 kDa, e Ln1 nativo deve ter uma única banda em 711 kDa.
2. Descongelar Ln1 no gelo em geladeira durante a noite e alíquota em tubos de microcentrífuga de baixa ligação a proteínas (tipicamente alíquota a 100 μg/tubo para sobreposições de cultura, ou 10 μg para revestimentos) usando pontas de baixa ligação a proteínas e técnica estéril²⁷. Congelar alíquotas e conservar a -80 °C.

2. Polimerização da laminina usando tampões de pH baixo

1. Faça tampão de polimerização poliLM: Pesar e misturar 1 mM de CaCl₂ e 20 mM de acetato de sódio em água ultrapura. Em seguida, ajuste o pH para 4,0, usando HCl ou ácido acético. Filtrar estéril através de um filtro de 0,2 μm e conservar a 4 °C.
2. Faça o controle do tampão de polimerização: Misture 1 mM CalCl₂ e 20 mM Tris e ajuste o pH para 7,0, usando 10 N HCl ou 12 N NaOH conforme necessário. Filtrar estéril através de um filtro de 0,2 μm e conservar a 4 °C.
   NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
3. Descongele o número necessário de alíquotas de Ln-1 em uma geladeira durante a noite.
4. Usando a técnica de cultura de células estéreis, adicione o tampão apropriado (tampão de polimerização poliLM da etapa 2.1 ou tampão de polimerização de controle da etapa 2.2) às alíquotas de laminina na concentração final de 100 μg/mL (ou seja, adicione 0,5 mL a 50 μg de alíquotas) e misture suavemente por pipetagem.
5. Se utilizar laminina fluorescentemente marcada para visualização, reconstitua e adicione na proporção 1:50 m/peso (por exemplo, 2 μg/100 μg) e misture suavemente por pipetagem.
   Observação : se usando laminins como um substrato para a fixação celular, execute as etapas 2.6-2.8:
6. Imediatamente após a diluição em tampão apropriado, transferir lamininas para plástico de cultura ou vidraria e incubar durante a noite em uma incubadora de cultura celular a 37 °C. Observe que, ao cobrir o revestimento, adicione um volume suficientemente grande para produzir uma queda equilibrada (normalmente, use 50 μL para uma lamínula redonda de 13 mm) e mantenha em uma câmara umidificada durante a noite a 37 °C.
7. Utilizando técnica estéril²⁷, lavar com solução salina tamponada com fosfato (PBS) 1x.
8. Retire o líquido com cuidado. Não deixe a superfície completamente seca.
   NOTA: Se estiver usando lamininas para cobrir as células para indução de proteína do leite, siga as etapas 2.9-2.12:
9. Cultura de células epiteliais mamárias. Cultura MepG dystroglycan knock in (DgKI) ou células MepG dystroglycan knockout cells (DgKO) em DMEM-F12 suplementado com 2% FBS, 0,01 mg/mL insulina, 0,005 μg/mL EGF, 0,05 mg/mL gentamicina e 0,05 g/mL normocina.
10. Células DgKO e DgKI de sementes para estimulação de laminina a 10.500 células/^cm2 em placas de poço ou placas de fundo de lamínula
11. Incubar lamininas diluídas em uma incubadora de cultura celular a 37 °C por 30 min.
12. Centrifugar alíquotas de poliLM a 2.000 x g por 20 minutos, mas centrifugar LM em pH neutro a 20.000 x g por 20 minutos devido ao menor tamanho das entidades proteicas e necessidade de velocidades mais altas para coletar efetivamente.
13. Por técnica estéril²⁷, retirar suavemente o sobrenadante e ressuspender em volume apropriado de meio de indução DMEM-F12 suplementado com 3 μg/mL de prolactina, 2,8 μM de hidrocortisona e 5 μg/mL de insulina
14. Transferir laminina em meio de cultura celular imediatamente para estimular as células. Estimulamos células com 50-800 μg/mL Ln1

3. Polimerização da laminina utilizando glicoproteínas isoladas

1. Descongele nidogênio-1 recombinante e Ln1 suavemente no gelo na geladeira durante a noite.
2. Misturar Ln1 com nidogênio-1 na proporção 1:1 em peso em meio de cultura celular usando pontas e tubos de baixa ligação a proteínas e usando técnica estéril. Utilizar Ln1 puro em meio de cultura celular como controle.
3. Se usar laminina fluorescentemente marcada para visualização, reconstitua e adicione na proporção 1:50 m/peso (por exemplo, 2 μg/100 μg). Misture suavemente por pipetagem.
4. Incubar Ln1-nidogênio ou controlar Ln1 em incubadora de cultura celular a 37 °C por 30 min.
5. Centrífuga de copolímeros de Ln1-nidogênio a 2.000 x g por 30 min e controle Ln1 a 20.000 x g por 30 min.
6. Remover suavemente o sobrenadante e ressuspender em meio de cultura celular até uma concentração final de 100-800 μg de proteína total/mL.
7. Use imediatamente para estimular as células, ou transfira para lamínulas e deixe aderir durante a noite a 37 °C em incubadoras de cultura de células umedecidas.
8. Remova o meio de cultura das lamínulas, lave as lamínulas com 1x PBS e, em seguida, fixe com formalina a 10% (ou seja, formaldeído a 4% em PBS) por 15 minutos à temperatura ambiente.

4. Polimerização de laminina utilizando células que expressam distroglicanos

1. Cultura de células epiteliais mamárias. Cultura MepG dystroglycan knock in (DgKI) ou células MepG dystroglycan knockout cells (DgKO) em DMEM-F12 suplementado com 2% FBS, 0,01 mg/mL insulina, 0,005 μg/mL EGF, 0,05 mg/mL gentamicina e 0,05 g/mL normocina.
2. Sementes de células DgKI a 5.000 células/cm² e células DgKO de sementes a 8.000 células/cm² devido a diferenças nas taxas de crescimento. Cultura a 37 °C em incubadoras umedecidas com trocas de meios a cada 2-3 dias e passagens a cada 4-5 dias usando uma técnica estéril rigorosa. Contar as células cuidadosamente com um hemocitômetro ou contador automático de células²⁷ para garantir taxas de crescimento adequadas.
3. Células de sementes para estimulação de laminina a 10.500 células/^cm2 em placas de poço ou placas de fundo de cobertura e cultura por 2 dias, usando células DgKI para gerar células fractais Ln1 e DgKO como controles negativos. Descongelar Ln-1 suavemente durante a noite em gelo em um refrigerador e, em seguida, misturar com meio de indução de DMEM-F12 suplementado com 3 μg/mL de prolactina, 2,8 μM de hidrocortisona e 5 μg/mL de insulina. Para uma placa de 35 mm, use 1 mL de meio de indução com 50-800 μg de Ln1.
4. Se estiver usando Ln1 fluorescente, misture na proporção 50:1 em peso/mwt.
5. Remover o meio das células e cobrir com laminina e meio de indução de DMEM-F12 suplementado com 3 μg/mL de prolactina, 2,8 μM de hidrocortisona e 5 μg/mL de insulina
6. Cultivar células por 2 dias e, em seguida, fixar com formalina a 10%.

5. Caracterização da microestrutura da laminina via microscopia óptica

1. Coletar amostras fixas e lavar 3 vezes com 1x PBS à temperatura ambiente por 5 min.
2. Bloquear e permeabilizar amostras em 1x PBS com Triton X-100 a 0,5%, albumina de soro bovino a 3%, soro caprino a 10% e fragmento de anticorpo bloqueador de camundongo a 40 μg/mL por 1 h à temperatura ambiente em câmara umedecida.
   NOTA: Triton X-100 é perigoso. Manuseie com luvas e proteção ocular e descarte adequadamente.
3. Misture o anticorpo antilaminina numa diluição de 1:100 com 1x PBS com Triton X-100 a 0,5% e BSA a 3% e adicione às amostras durante 2 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C numa câmara humidificada (normalmente utilize caixas de ponta com um lenço de laboratório molhado no fundo).
4. Remover o anticorpo primário e lavar 3 vezes com 1x PBS com Triton X-100 a 0,5% e BSA a 3%.
5. Adicionar um anticorpo secundário adequado numa diluição de 1:500 às amostras em 1x PBS com Triton X-100 a 0,5% e BSA a 3% e incubar à temperatura ambiente no escuro numa câmara umedecida.
6. Remover o anticorpo secundário e lavar 3 vezes com 1x PBS com Triton X-100 a 0,5% e BSA a 3%.
7. Para amostras contendo células, adicionar 6 μM de faloidina por 45 min, seguido de 3 lavagens com PBS com Triton X-100 a 0,5% e BSA 3%, e seguidas de 3 lavagens com PBS. Em seguida, corar com 0,1 μg/mL DAPI em PBS por 5 minutos.
8. Monte amostras, se for o caso.
9. Estrutura da imagem ln-1 utilizando microscopia confocal de alta resolução. Use um microscópio de varredura a laser equipado com objetivas de imersão (Plano de imersão em água Apochromat 40X/1.1NA ou Plano de imersão em óleo Apochromat 63X/1.4NA).

6. Caracterização de construções de laminina via dimensão de contagem de caixas

1. Analise as propriedades fractais usando algoritmos de dimensão de contagem de caixas disponíveis nas caixas de ferramentas do Matlab ou no ImageJ. Esses métodos limiares imagens de laminina e plotam em um log-log plotar o número de caixas contendo Ln1 em comparação com o tamanho das caixas. A inclinação da relação entre esses parâmetros é a dimensão de contagem de caixas: geometrias não-fractais terão uma dimensão de 0, 1 ou 2, enquanto geometrias fractais terão uma dimensão não-inteira²⁸.
   NOTA: Ln1 tratado com ácido, glicoproteína e ligado a células DgKI tem uma dimensão fractal de contagem de caixa de ~1,7, enquanto Ln1 de controle tem uma dimensão fractal de 2,0.

7. Caracterização de construções de laminina via microscopia eletrônica

1. Ressuspender as lamininas em meios de cultura celular e deixar adsorver wafers de sílica por 90 min em um ambiente úmido de 37 °C.
2. Matrizes de fixação em glutaraldeído 2,5% em tampão cacodilato de sódio 0,1 M pH 7,2.
   NOTA: O glutaraldeído é perigoso e deve ser manuseado em uma capela com luvas e proteção ocular e descartado como resíduo perigoso.
3. Matrizes pós-fixas em tetróxido de ósmio a 1% em tampão cacodilato de sódio 0,1 M pH 7,2.
   NOTA: O tetróxido de ósmio é perigoso e deve ser manuseado em um exaustor com luvas e proteção ocular e descartado adequadamente. O cacodilato é perigoso e deve ser manuseado em um exaustor com luvas e proteção ocular e descartado adequadamente.
4. Lavar 3 vezes em tampão cacodilato de sódio a pH 7,2.
5. Desidratar com concentrações crescentes de etanol.
6. Sputter reveste matrizes com uma fina camada de ouro.
7. Imagem utilizando microscopia eletrônica de varredura.

Resultados

A laminina-111 é uma proteína trimérica com três domínios automontáveis no final de seus braços curtos (Figura 1A). Quando tratados adequadamente, os braços curtos podem polimerizar-se em uma rede hexagonal (Figura 1B,1C), que exibe propriedades fractais de agregados limitadas à difusão em escalas espaciais maiores (Figura 2). A laminina incubada em tampões de pH neutro contendo cálcio forma pequenos agr...

Discussão

As lamininas representam um elemento-chave da MEC em sistemas epiteliais, musculares e de órgãos neurais, e têm demonstrado in vitro desempenhar papéis essenciais na regulação da diferenciação funcional das células. Evidências crescentes indicam que a estrutura da laminina exibida às células regula sua sinalização e o fenótipo celular resultante ^15,16, portanto, métodos para controlar a microestrutura de Ln1 devem ser de interesse para biólogos b...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% formalin	Sigma Aldrich	HT501128
Anti-Laminin primary antibody	Sigma Aldrich	L9393
Anti-Rabbit Alexafluor 488 secondary antibody	Thermo	A32731
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A9418
CaCl2	Sigma Aldrich	C4901 or similar
Cell Culture Incubator	Thermo	Heracell 150 or similar
Centrifuge for microcentrifuge tubes	Eppendorf	5418 or similar
Confocal Microscope	Zeiss	LSM 710 or equivalent
Coverslips	Thermo	25CIR-1 or similar
DMEM-F12, Liquid, High Glucose, +HEPES, L-glutamine, +Phenol red	Thermo	11330107
EGF (Epidermal Growth Factor)	Sigma Aldrich	11376454001
Fluorescently Labeled Laminin	Cytoskeleton Inc	LMN02
Gentamicin	VWR	VWRV0304-10G
Glutaraldehyde	Sigma Aldrich	G5882
HCl	Sigma Aldrich	320331 or similar
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888-5G
Insulin	Sigma Aldrich	16634-50mg
MepG Dystroglycan Knockout Cells	LBNL	N/A
NaOH	Sigma Aldrich	S8045 or similar
Normocin	Invivogen	ant-nr-1
Osmium Tetroxide	Sigma Aldrich	75633
Ovine Prolactin	Los Angeles Biomedical Research Institute	Ovine Pituitary Prolactin
Phalloidin	Thermo	A22287
Phosphate Buffered Saline	Thermo	10010023 or similar
Purified Laminin-111	Sigma Aldrich	L2020-1MG
Recombinant human Nidogen-1, carrier free	R&D systems	2570-ND-050
Sodium Acetate	Sigma Aldrich	S2889 or similar
Sodium Cacodylate	Sigma Aldrich	C0250
Sterile filters	Millipore	SLGP033RS or similar
Tris	Sigma Aldrich	252859 or similar
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Ultra-low protein binding tubes	VWR	76322-516, 76322-522 or similar
Ultrapure water	Thermo	15230253 or similar