Erzeugung einer fraktalen Mikrostruktur von Laminin-111 als Signal an Zellen

Zusammenfassung

Wir beschreiben drei Methoden zur Erzeugung von Ln1-Polymeren mit fraktalen Eigenschaften, die den Zellen anders signalisieren als unpolymerisiertes Ln1.

Zusammenfassung

Laminin-111 (Ln1) ist ein wesentlicher Bestandteil der extrazellulären Matrix in Epithelien, Muskeln und Nervensystemen. Wir haben bereits gezeigt, dass die Mikrostruktur von Ln1 die Art und Weise verändert, wie es an Zellen signalisiert, möglicherweise weil die Anordnung von Ln1 zu Netzwerken verschiedene adhäsive Domänen freilegt. In diesem Protokoll beschreiben wir drei Methoden zur Erzeugung von polymerisiertem Ln1.

Einleitung

Im Gegensatz zu Wachstumsfaktoren oder Zytokinen können sich Proteine der extrazellulären Matrix (ECM) zu strukturellen Netzwerken zusammensetzen. Da die EZM-Dysfunktion ein Schlüsselelement vieler Krankheitszustände ist, sind die Mechanismen, mit denen Zellen Signale aus der Zusammensetzung, Mikrostruktur und Biomechanik der EZM wahrnehmen und weiterleiten, attraktive Ziele für die therapeutische Entwicklung. Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass die Mikrostruktur dieser Netzwerke eine wichtige Rolle dabei spielt, wie diese Proteine an die Zellen signalisieren. Bisher wurde dieser Zusammenhang zwischen EZM-Mikrostruktur und Zellfunktion für Kollagen I¹, Fibronektin² und Fibrin³ gezeigt.

Laminin-111 (Ln1) ist ein trimeres, kreuzförmiges Protein, das eine wichtige Strukturkomponente der extrazellulären Matrix ist, die Epithelzellen⁴, Muskelzellen⁵ und Nervenzellen⁶ kontaktiert. In der Brustdrüse ist Ln1 für die funktionelle Differenzierung von Brustdrüsenepithelzellen in milchproduzierende Zellen notwendig ^7,8,9, und Ln1 ist entscheidend für die Induktion der Tumorreversion^10,11. Ln1 und andere Laminine sind notwendig für die Entwicklung kortikaler Aktinnetzwerke und die Sarkolemma-Organisation im Muskel^12,13 sowie für die Migration von Nervenzellen und das Wachstum von Neuriten¹³ . Daher ist das Verständnis der Mechanismen, durch die Laminin Signale an Zellen senden, ein aktives Forschungsgebiet.

Ln1 enthält mehrere adhäsive Domänen für ein breites Spektrum von Rezeptoren, darunter Integrine, Syndecane, Dystroglykan, LBP-110 und LamR (Abbildung 1A)^4,14. Das E8-Fragment, das die c-terminus-globulären Domänen von Laminin α1 enthält, ist für die Bindung von Dystroglykan und Integrinen α6β1 und α3β1¹⁵ und für die funktionelle Differenzierung von Epithelzellen notwendig^15,16. Im Gegensatz dazu zeigen die kurzen Arme unterschiedliche biologische Aktivität¹⁷, was bedeutet, dass die Verfügbarkeit für die Erkennung dieser verschiedenen Ln1-Domänen nach Netzwerkbildung das Zellverhalten verändern könnte.

Wir haben kürzlich gezeigt, dass Ln1, das in einem polymeren Netzwerk angeordnet ist, fraktale Eigenschaften aufweist (d.h. eine Struktur, die über mehrere Längenskalen hinweg selbstähnlich ist)¹⁸. Fraktale Netzwerke signalisieren Epithelzellen anders als Ln1, dem diese Anordnung fehlt¹⁹. Dieses fraktale Netzwerk weist auf eine bestimmte Assemblierungsstruktur hin, bei der der lange Arm bevorzugt den Zellen¹⁸ ausgesetzt ist. Infolge dieser unterschiedlichen Darstellung des langen Arms differenzieren sich Epithelzellen funktionell in milchproduzierende Zellen mit gut organisierten Tight Junctions und Unterdrückung von Aktin-Stressfasern¹⁹.

Wir beschreiben 3 Methoden zur Erzeugung von Ln1-Netzwerken aus Kurzarm-Kurzarm-Bindungsinteraktionen, die eine hohe Darstellung des Ln1-Langarms zeigen: 1) durch zellfreie Assemblierung mit sauren Puffern, 2) durch Co-Inkubation mit Glykoproteinen oder 3) durch Interaktion mit Zelloberflächendystroglykan. Diese drei Methoden erzeugen ähnliche Laminin-Mikrostrukturen durch drei sehr unterschiedliche Mechanismen, was Flexibilität bei der Versuchsplanung ermöglicht. Frühere Arbeiten deuten darauf hin, dass diese drei Methoden biologische Robustheit darstellen könnten: In Brustdrüsenepithelien können entweder Zelloberflächendystroglykan, Glykoproteine oder künstlich strukturiertes Laminin eine funktionelle Differenzierung induzieren¹⁹. So können die Forscher je nach Studienobjekt zwischen diesen Methoden wählen: Dystroglykan-exprimierende Zellen zeigen keine Empfindlichkeit gegenüber der Ln-1-Mikrostruktur, da Dystroglykan in der Zellmembran eine korrekte Polymerisation zu einem fraktalen Netzwerk induziert^19,20. Matrigel, eine Mischung aus Lamininen und Glykoproteinen²¹, stellt die wirtschaftlichste Quelle für Ln-1 dar und bietet die notwendige Mikrostruktur, um dystroglykanische Knockout-Brustzellen zur Differenzierung zu veranlassen²⁰, enthält jedoch eine komplexe Mischung von Proteinen mit Chargenvariabilität. PolyLM stellt das sauberste und reduktionistischste System dar, das diese Funktion bietet, jedoch zu höheren Kosten und einer geringeren Wirksamkeit bei der Induktion der Differenzierung von Brustzellen im Vergleich zu Matrigel¹⁹.

Diese drei Methoden haben eine fraktale Netzwerkstruktur, die für diffusionsbegrenzte Aggregation charakteristisch ist^18,19 und zeigen eine veränderte biologische Aktivität im Vergleich zu aggregiertem Laminin in mehreren experimentellen Systemen 22,23,24,25. Zukünftige Studien mit diesen Methoden könnten die Rezeptoren und Signale identifizieren, die für die epitheliale Differenzierung erforderlich sind, und bestimmen, wie normale Zell-Matrix-Interaktionen in Zellen in abnormalen Mikroumgebungen²⁰, wie z. B. Tumoren, wiederhergestellt werden können.

Protokoll

1. Auftauen und aliquotes Laminin-111

HINWEIS: Aufgereinigtes Laminin-111 ist im Handel erhältlich (typischerweise gereinigt aus EHS-Matrix, die als Matrigel verkauft wird), aber nicht alle Quellen liefern intaktes, nicht abgebautes Protein.

1. Bestätigen Sie, dass Ln1 nicht durch Beschaffung von Ln1 und Laufgrößenausschlusschromatographie²⁶ oder Polyacrylamid-Gelelektrophorese²⁶ abgebaut wird. Denaturiertes Ln1 sollte Banden bei 337 kDa, 197 kDa und 177 kDa haben, und natives Ln1 sollte ein einzelnes Band bei 711 kDa haben.
2. Ln1 über Nacht auf Eis im Kühlschrank auftauen und in Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung aliquotieren (typischerweise aliquotiert bei 100 μg/Röhrchen für Kulturüberlagerungen oder 10 μg für Beschichtungen) unter Verwendung proteinarmer Bindungsspitzen und steriler Technik²⁷. Aliquote einfrieren und bei -80 °C lagern.

2. Lamininpolymerisation mit Puffern mit niedrigem pH-Wert

1. PolyLM-Polymerisationspuffer herstellen: 1 mM CaCl₂ und 20 mM Natriumacetat in Reinstwasser abwiegen und mischen. Stellen Sie dann den pH-Wert mit HCl oder Essigsäure auf 4,0 ein. Sterilfiltrieren Sie durch einen 0,2-μm-Filter und lagern Sie ihn bei 4 °C.
2. Stellen Sie einen Kontrollpolymerisationspuffer her: Mischen Sie 1 mM CalCl₂ und 20 mM Tris und stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 ein, wobei Sie je nach Bedarf 10 N HCl oder 12 N NaOH verwenden. Sterilfiltrieren Sie durch einen 0,2-μm-Filter und lagern Sie ihn bei 4 °C.
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
3. Tauen Sie die benötigte Anzahl von Ln-1-Aliquoten über Nacht im Kühlschrank auf.
4. Unter Verwendung der sterilen Zellkulturtechnik den entsprechenden Puffer (entweder PolyLM-Polymerisationspuffer aus Schritt 2.1 oder Kontrollpolymerisationspuffer aus Schritt 2.2) zu Laminin-Aliquoten in einer Endkonzentration von 100 μg/ml geben (d. h. 0,5 ml bis 50 μg Aliquote hinzufügen) und vorsichtig durch Pipettieren mischen.
5. Wenn Sie fluoreszenzmarkiertes Laminin zur Visualisierung verwenden, rekonstituieren und im Verhältnis 1:50 Gew./Gew. (z. B. 2 μg/100 μg) hinzufügen und vorsichtig durch Pipettieren mischen.
   HINWEIS: Wenn Sie Laminine als Substrat für die Zellanhaftung verwenden, befolgen Sie die Schritte 2.6-2.8:
6. Unmittelbar nach der Verdünnung in geeignetem Puffer werden Laminine auf Kulturkunststoff oder Glaswaren übertragen und über Nacht in einem Zellkulturinkubator bei 37 °C inkubiert. Beachten Sie, dass beim Beschichten von Deckgläsern ein ausreichend großes Volumen hinzugefügt wird, um einen ausgeglichenen Tropfen zu erzeugen (in der Regel 50 μl für ein rundes 13-mm-Deckglas verwenden), und über Nacht bei 37 °C in einer befeuchteten Kammer aufbewahren.
7. Mit steriler Technik²⁷ mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen.
8. Entfernen Sie die Flüssigkeit vorsichtig. Lassen Sie die Oberfläche nicht vollständig trocken sein.
   Anmerkungen: Wenn Sie Laminine verwenden, um Zellen für die Milchproteininduktion abzudecken, befolgen Sie die Schritte 2.9-2.12:
9. Kultivieren Sie Brustepithelzellen. Kultivieren Sie MepG-Dystroglykan-Knock-in- (DgKI) oder MepG-Dystroglykan-Knockout-Zellen (DgKO) in DMEM-F12, ergänzt mit 2 % FBS, 0,01 mg/ml Insulin, 0,005 μg/ml EGF, 0,05 mg/ml Gentamycin und 0,05 g/ml Normocin.
10. Seed-DgKO- und DgKI-Zellen für die Lamininstimulation bei 10.500 Zellen/^cm2 in Well-Platten oder Deckglasböden
11. Verdünnte Laminine in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 °C für 30 min inkubieren.
12. Zentrifugieren Sie polyLM 20 Minuten lang bei 2.000 x g , aber zentrifugieren Sie LM bei neutralem pH-Wert bei 20.000 x g für 20 Minuten, da die Proteineinheiten kleiner sind und höhere Geschwindigkeiten erforderlich sind, um effektiv zu sammeln.
13. Unter Verwendung der sterilen Technik²⁷ wird der Überstand vorsichtig entfernt und in einem geeigneten Volumen des Induktionsmediums DMEM-F12, ergänzt mit 3 μg/ml Prolaktin, 2,8 μM Hydrocortison und 5 μg/ml Insulin, resuspendiert
14. Laminin sofort in Zellkulturmedium übertragen, um die Zellen zu stimulieren. Wir haben erfolgreich Zellen mit 50-800 μg/ml Ln1 stimuliert

3. Lamininpolymerisation mit isolierten Glykoproteinen

1. Rekombinantes Nidogen-1 und Ln1 über Nacht sanft auf Eis im Kühlschrank auftauen.
2. Mischen Sie Ln1 mit Nidogen-1 in einem Verhältnis von 1:1 Gew./Gew. in Zellkulturmedium mit proteinarmen Bindungsspitzen und -röhrchen und mit steriler Technik. Verwenden Sie reines Ln1 in Zellkulturmedium als Kontrolle.
3. Wenn Sie fluoreszenzmarkiertes Laminin zur Visualisierung verwenden, rekonstituieren Sie es und fügen Sie es im Verhältnis 1:50 Gew./Gew. hinzu (z. B. 2 μg/100 μg). Vorsichtig durch Pipettieren mischen.
4. Inkubieren Sie Ln1-Nidogen oder kontrollieren Sie Ln1 in einem Zellkulturinkubator bei 37 °C für 30 min.
5. Zentrifugieren Sie Ln1-Nidogen-Copolymere bei 2.000 x g für 30 min und die Steuerung Ln1 bei 20.000 x g für 30 min.
6. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie ihn im Zellkulturmedium auf eine Endkonzentration von 100-800 μg Gesamtprotein/ml.
7. Zur Stimulierung der Zellen sofort anwenden oder auf Deckgläser übertragen und über Nacht bei 37 °C in befeuchteten Zellkultur-Inkubatoren einwirken lassen.
8. Kulturmedium von Deckgläsern entfernen, Deckgläser mit 1x PBS waschen und dann 15 Minuten bei Raumtemperatur mit 10% Formalin (d.h. 4% Formaldehyd in PBS) fixieren.

4. Lamininpolymerisation mit Dystroglykan-exprimierenden Zellen

1. Kultivieren Sie Brustepithelzellen. Kultivieren Sie MepG-Dystroglykan-Knock-in- (DgKI) oder MepG-Dystroglykan-Knockout-Zellen (DgKO) in DMEM-F12, ergänzt mit 2 % FBS, 0,01 mg/ml Insulin, 0,005 μg/ml EGF, 0,05 mg/ml Gentamycin und 0,05 g/ml Normocin.
2. Seed-DgKI-Zellen bei 5.000 Zellen/^cm2 und Seed-DgKO-Zellen bei 8.000 Zellen/^cm2 aufgrund unterschiedlicher Wachstumsraten. Kultur bei 37 °C in befeuchteten Inkubatoren mit Medienwechsel alle 2-3 Tage und Durchgängen alle 4-5 Tage in einer strengen sterilen Technik. Zählen Sie die Zellen sorgfältig mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler²⁷ , um angemessene Wachstumsraten zu gewährleisten.
3. Keimzellen für die Lamininstimulation bei 10.500 Zellen/^cm2 in Well-Platten oder Deckglasböden und Kultur für 2 Tage, wobei DgKI-Zellen zur Erzeugung fraktaler Ln1- und DgKO-Zellen als Negativkontrollen verwendet werden. Ln-1 vorsichtig über Nacht auf Eis im Kühlschrank auftauen und dann mit Induktionsmedium DMEM-F12 mischen, das mit 3 μg/ml Prolaktin, 2,8 μM Hydrocortison und 5 μg/ml Insulin ergänzt wird. Verwenden Sie für eine 35-mm-Schale 1 ml Induktionsmedium mit 50-800 μg Ln1.
4. Wenn Sie fluoreszierendes Ln1 verwenden, mischen Sie es im Verhältnis 50:1 Gew./Gew.
5. Entfernen Sie Medien aus den Zellen und bedecken Sie sie mit Laminin und Induktionsmedien von DMEM-F12, ergänzt mit 3 μg/ml Prolaktin, 2,8 μM Hydrocortison und 5 μg/ml Insulin
6. Kultivieren Sie die Zellen 2 Tage lang und fixieren Sie sie dann mit 10% Formalin.

5. Charakterisierung der Laminin-Mikrostruktur mittels optischer Mikroskopie

1. Fixierte Proben sammeln und 3 mal mit 1x PBS bei Raumtemperatur für 5 min waschen.
2. Proben in 1x PBS mit 0,5 % Triton X-100, 3 % Rinderserumalbumin, 10 % Ziegenserum und 40 μg/ml Anti-Maus-blockierendem Antikörperfragment für 1 h bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer blockieren und permeabilisieren.
   HINWEIS: Triton X-100 ist gefährlich. Mit Handschuhen und Augenschutz anfassen und fachgerecht entsorgen.
3. Anti-Laminin-Antikörper in einer Verdünnung von 1:100 mit 1x PBS mit 0,5 % Triton X-100 und 3 % BSA mischen und 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C in einer befeuchteten Kammer zu den Proben geben (normalerweise Tip-Boxen mit einem feuchten Labortuch am Boden verwenden).
4. Primären Antikörper entfernen und 3 mal mit 1x PBS mit 0,5% Triton X-100 und 3% BSA waschen.
5. Proben in 1x PBS mit 0,5 % Triton X-100 und 3 % BSA einen geeigneten Sekundärantikörper in einer Verdünnung von 1:500 zugeben und bei Raumtemperatur im Dunkeln in einer befeuchteten Kammer inkubieren.
6. Sekundärantikörper entfernen und 3 mal mit 1x PBS mit 0,5% Triton X-100 und 3% BSA waschen.
7. Bei Proben, die Zellen enthalten, fügen Sie 6 μM Phalloidin für 45 Minuten hinzu, gefolgt von 3 Waschungen mit PBS mit 0,5 % Triton X-100 und 3 % BSA und gefolgt von 3 Waschgängen mit PBS. Anschließend 5 Minuten lang mit 0,1 μg/ml DAPI in PBS färben.
8. Montieren Sie gegebenenfalls Proben.
9. Abbildung der ln-1-Struktur mit hochauflösender konfokaler Mikroskopie. Verwenden Sie ein Laser-Scanning-Mikroskop, das mit Immersionsobjektiven ausgestattet ist (Wasserimmersion Plan Apochromat 40X/1.1NA oder Ölimmersion Plan Apochromat 63X/1.4NA).

6. Charakterisierung von Lamininkonstrukten über die Kistenzähldimension

1. Analysieren Sie fraktale Eigenschaften mit Box-Zähldimensionsalgorithmen, die in Matlab-Toolboxen oder in ImageJ verfügbar sind. Diese Methoden erzeugen Schwellenwertbilder von Laminin und zeichnen auf einem Log-Log-Diagramm die Anzahl der Kisten, die Ln1 enthalten, im Vergleich zur Größe der Kisten. Die Steigung der Beziehung zwischen diesen Parametern ist die Box-Zähldimension: Nicht-fraktale Geometrien haben eine Dimension von 0, 1 oder 2, während fraktale Geometrien eine nicht-ganzzahlige Dimension²⁸ haben.
   HINWEIS: Säurebehandeltes, Glykoprotein-behandeltes und DgKI-Zell-gebundenes Ln1 haben alle eine fraktale Dimension von ~1,7, während Kontroll-Ln1 eine fraktale Dimension von 2,0 hat.

7. Charakterisierung von Lamininkonstrukten mittels Elektronenmikroskopie

1. Resuspendieren Sie die Laminine in Zellkulturmedien und lassen Sie sie 90 Minuten lang in einer feuchten Umgebung von 37 °C an Siliziumdioxidwafern adsorbieren.
2. Matrizen in 2,5 % Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer bei pH 7,2 fixieren.
   HINWEIS: Glutaraldehyd ist gefährlich und sollte in einem Abzug mit Handschuhen und Augenschutz gehandhabt und als Sondermüll entsorgt werden.
3. Postfix-Matrizen in 1 % Osmiumtetroxid in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer bei pH 7,2.
   Anmerkungen: Osmiumtetroxid ist gefährlich und sollte in einem Abzug mit Handschuhen und Augenschutz gehandhabt und ordnungsgemäß entsorgt werden. Cacodylat ist gefährlich und sollte in einem Abzug mit Handschuhen und Augenschutz gehandhabt und ordnungsgemäß entsorgt werden.
4. 3 Mal in Natriumcacodylatpuffer bei pH 7,2 waschen.
5. Dehydrieren Sie mit steigenden Ethanolkonzentrationen.
6. Sputtern Sie Matrizen mit einer dünnen Goldschicht.
7. Aufnahme mit Rasterelektronenmikroskopie.

Ergebnisse

Laminin-111 ist ein trimeres Protein mit drei selbstorganisierenden Domänen am Ende seiner kurzen Arme (Abbildung 1A). Bei geeigneter Behandlung können die kurzen Arme zu einem hexagonalen Gitter polymerisieren (Abbildung 1B,1C), das diffusionsbegrenzte Aggregatfraktaleigenschaften auf größeren räumlichen Skalen aufweist (Abbildung 2). Laminin, das in kalziumhaltigen Puffern mit neutralem pH-Wert inkubiert wird...

Diskussion

Laminine stellen ein Schlüsselelement der EZM in epithelialen, muskulären und neuronalen Organsystemen dar und spielen in vitro eine wesentliche Rolle bei der Regulierung der funktionellen Differenzierung von Zellen. Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass die Struktur von Laminin, die den Zellen gezeigt wird, seine Signalübertragung und den daraus resultierenden Zellphänotyp^{reguliert 15,16}, so dass Methoden zur Kontrolle der Ln1-Mikrostruktur für Grundlage...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% formalin	Sigma Aldrich	HT501128
Anti-Laminin primary antibody	Sigma Aldrich	L9393
Anti-Rabbit Alexafluor 488 secondary antibody	Thermo	A32731
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A9418
CaCl2	Sigma Aldrich	C4901 or similar
Cell Culture Incubator	Thermo	Heracell 150 or similar
Centrifuge for microcentrifuge tubes	Eppendorf	5418 or similar
Confocal Microscope	Zeiss	LSM 710 or equivalent
Coverslips	Thermo	25CIR-1 or similar
DMEM-F12, Liquid, High Glucose, +HEPES, L-glutamine, +Phenol red	Thermo	11330107
EGF (Epidermal Growth Factor)	Sigma Aldrich	11376454001
Fluorescently Labeled Laminin	Cytoskeleton Inc	LMN02
Gentamicin	VWR	VWRV0304-10G
Glutaraldehyde	Sigma Aldrich	G5882
HCl	Sigma Aldrich	320331 or similar
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888-5G
Insulin	Sigma Aldrich	16634-50mg
MepG Dystroglycan Knockout Cells	LBNL	N/A
NaOH	Sigma Aldrich	S8045 or similar
Normocin	Invivogen	ant-nr-1
Osmium Tetroxide	Sigma Aldrich	75633
Ovine Prolactin	Los Angeles Biomedical Research Institute	Ovine Pituitary Prolactin
Phalloidin	Thermo	A22287
Phosphate Buffered Saline	Thermo	10010023 or similar
Purified Laminin-111	Sigma Aldrich	L2020-1MG
Recombinant human Nidogen-1, carrier free	R&D systems	2570-ND-050
Sodium Acetate	Sigma Aldrich	S2889 or similar
Sodium Cacodylate	Sigma Aldrich	C0250
Sterile filters	Millipore	SLGP033RS or similar
Tris	Sigma Aldrich	252859 or similar
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Ultra-low protein binding tubes	VWR	76322-516, 76322-522 or similar
Ultrapure water	Thermo	15230253 or similar