세포에 신호를 보내는 Laminin-111의 프랙탈 미세구조 생성

요약

중합되지 않은 Ln1과 비교하여 세포에 다르게 신호를 보내는 프랙탈 특성을 가진 Ln1 중합체를 생성하는 세 가지 방법을 설명합니다.

초록

Laminin-111(Ln1)은 상피, 근육 및 신경계의 세포외 기질의 필수적인 부분입니다. 우리는 이전에 Ln1의 미세 구조가 세포에 신호를 보내는 방식을 변경한다는 것을 입증했는데, 이는 네트워크로의 Ln1 조립이 다른 접착 영역을 노출시키기 때문일 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 중합된 Ln1을 생성하는 세 가지 방법을 설명합니다.

서문

성장 인자나 사이토카인과 달리 세포외 기질(ECM) 단백질은 구조적 네트워크로 조립될 수 있습니다. ECM 기능 장애는 많은 질병 상태의 핵심 요소이기 때문에 세포가 ECM 구성, 미세 구조 및 생체 역학의 신호를 감지하고 전달하는 메커니즘은 치료제 개발을 위한 매력적인 표적입니다. 이러한 네트워크의 미세 구조가 이러한 단백질이 세포에 신호를 보내는 방식에 중요한 역할을 한다는 증거가 증가하고 있습니다. 현재까지 ECM 미세 구조와 세포 기능 사이의 이러한 연관성은 콜라겐 I¹, 피브로넥틴² 및 피브린³에 대해 나타났습니다.

Laminin-111 (Ln1)은 상피 세포⁴, 근육 세포⁵ 및 신경 세포⁶와 접촉하는 세포외 기질의 핵심 구조 구성 요소인 삼중 십자형 단백질입니다. 유선에서 Ln1은 유선 상피 세포가 우유 생산 세포로 기능적으로 분화하는 데 필요하며 ^7,8,9 Ln1은 종양 복귀 유도에 중요합니다^10,11. Ln1 및 기타 라미닌은 근육^12,13에서 대뇌 피질 액틴 네트워크 및 육종 조직의 발달과 신경 세포 이동 및 신경돌기 성장에 필요하다¹³ . 따라서 라미닌이 세포에 신호를 보내는 메커니즘을 이해하는 것은 활발한 연구 분야입니다.

Ln1에는 인테그린, 신데칸, 디스트로글리칸, LBP-110 및 LamR을 포함한 광범위한 수용체에 대한 여러 접착 도메인이 포함되어 있습니다(그림 1A)^4,14. 라미닌 α1의 c-말단 구형 도메인을 포함하는 E8 단편은 디스트로글리칸과 인테그린 α6β1 및 α3β1¹⁵의 결합에 필요하며, 상피 세포의 기능적 분화에 필요하다^15,16. 대조적으로, 짧은 팔은 상이한 생물학적 활성을 나타내는데(¹⁷), 이는 네트워크 형성 후 이들 상이한 Ln1 도메인을 인식할 수 있는 가용성이 세포 거동을 변화시킬 수 있음을 의미한다.

우리는 최근에 고분자 네트워크로 배열된 Ln1이 프랙탈 특성(즉, 여러 길이 스케일에 걸쳐 자체 유사한 구조)을 나타낸다는 것을 입증했습니다¹⁸. 프랙탈 네트워크는 이 배열이 결여된 Ln1과 비교하여 상피 세포에 다르게 신호를 보낸다¹⁹. 이 프랙탈 네트워크는 특정 조립체 구조를 나타내는데, 여기서 긴 팔은 세포⁽¹⁸)에 우선적으로 노출된다. 이러한 상이한 긴 팔 디스플레이의 결과로, 상피 세포는 잘 조직된 단단한 접합부와 액틴 스트레스 섬유의 억제를 가진 우유 생산 세포로 기능적 분화를 겪는다¹⁹.

Ln1 긴 팔의 높은 디스플레이를 보여주는 짧은 팔-짧은 팔 결합 상호 작용에서 Ln1 네트워크를 생성하는 3가지 방법을 설명합니다: 1) 산성 완충액을 사용한 cell-free 조립, 2) 당단백질과의 공동 배양 또는 3) 세포 표면 디스트로글리칸과의 상호 작용. 이 세 가지 방법은 세 가지 매우 다른 메커니즘을 통해 유사한 라미닌 미세 구조를 생성하여 실험 설계에 유연성을 허용합니다. 이전 연구는 이 세 가지 방법이 생물학적 강건성을 나타낼 수 있음을 시사한다: 유선상피에서 세포 표면 디스트로글리칸, 당단백질 또는 인위적으로 구조화된 라미닌은 기능적 분화를 유도할 수 있다¹⁹. 따라서, 연구자들은 연구 주제에 따라 이러한 방법들 중에서 선택할 수 있다: 세포막의 디스트로글리칸이 프랙탈 네트워크로 올바른 중합을 유도하기 때문에, 디스트로글리칸 발현 세포는 Ln-1 미세구조에 대한 민감도를 나타내지 않는다 ^19,20. 라미닌과 당단백질(²¹)의 혼합물인 마트리겔(Matrigel)은 Ln-1의 가장 경제적인 공급원이며, 디스트로글리칸 녹아웃(dystroglycan knockout) 유선세포가²⁰을 분화하도록 유도하는 데 필요한 미세구조를 제공하지만, 로트 간 변동성이 있는 복잡한 단백질 혼합물을 포함하고 있다. PolyLM은 이 기능을 제공하는 가장 깨끗하고 환원주의적인 시스템이지만 Matrigel¹⁹에 비해 유방 세포 분화를 유도하는 데 비용이 증가하고 효능이 낮습니다.

이들 3가지 방법은 확산 제한 응집(diffusion limited aggregation)^18,19의 프랙탈 네트워크 구조 특성을 가지며, 다중 실험 시스템^(22,23,24,25)에서 응집된 라미닌(laminin)과 비교하여 변화된 생물학적 활성을 나타낸다. 이러한 방법을 사용하는 향후 연구는 상피 분화에 필요한 수용체와 신호를 확인하고 종양과 같은 비정상적인 미세 환경²⁰에서 세포에서 정상적인 세포-기질 상호 작용을 복원하도록 결정할 수 있습니다.

프로토콜

1. 해동 및 분취 라미닌-111

참고: 정제된 라미닌-111은 상업적으로 이용 가능하지만(일반적으로 Matrigel로 판매되는 EHS 매트릭스에서 정제됨) 모든 공급원이 온전하고 분해되지 않은 단백질을 제공하는 것은 아닙니다.

1. Ln1 및 실행 크기 배제 크로마토그래피(²⁶ ) 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(²⁶)을 소싱하여 Ln1이 분해되지 않았는지 확인합니다. 변성된 Ln1은 337kDa, 197kDa 및 177kDa의 대역을 가져야 하며 네이티브 Ln1은 711kDa의 단일 대역을 가져야 합니다.
2. Ln1을 냉장고의 얼음 위에서 밤새 해동하고, 저단백질 결합 팁과 멸균 기술을 사용하여 저단백질 결합 마이크로 원심분리기 튜브(일반적으로 배양 오버레이의 경우 100μg/튜브 또는 코팅의 경우 10μg의 부분 표본)에 분취한다²⁷. 부분 표본을 얼려서 -80 °C에서 보관하십시오.

2. 낮은 pH 완충액을 이용한 라미닌 중합

1. polyLM 중합 완충액 만들기: 무게를 측정하여 1mM CaCl₂ 및 20mM 아세트산 나트륨을 초순수에 혼합합니다. 그런 다음 HCl 또는 아세트산을 사용하여 pH를 4.0으로 조정합니다. 0.2μm 필터를 통해 제균 필터를 사용하고 4°C에서 보관합니다.
2. 대조군 중합 완충액 만들기: 1mM CalCl₂ 및 20mM Tris를 혼합하고 필요에 따라 10N HCl 또는 12N NaOH를 사용하여 pH를 7.0으로 조정합니다. 0.2μm 필터를 통해 제균 필터를 사용하고 4°C에서 보관합니다.
   참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
3. 필요한 수의 Ln-1 부분 표본을 냉장고에서 밤새 해동합니다.
4. 멸균 세포 배양 기법을 사용하여 적절한 완충액(2.1단계의 polyLM 중합 완충액 또는 2.2단계의 대조 중합 완충액)을 최종 농도 100μg/mL(즉, 0.5mL에서 50μg 분취액 추가)로 라미닌 분취액에 첨가하고 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다.
5. 시각화를 위해 형광 태그가 부착된 라미닌을 사용하는 경우 1:50 wt/wt 비율(예: 2 μg/100 μg)로 재구성 및 추가하고 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다.
   알림: 세포 부착을 위한 기질로 라미닌을 사용하는 경우 2.6-2.8단계를 따르십시오.
6. 적절한 완충액으로 희석한 직후 라미닌을 배양 플라스틱 또는 유리 용기에 옮기고 37°C의 세포 배양 인큐베이터에서 밤새 배양합니다. 커버슬립을 코팅할 때는 평형 방울이 생성될 수 있을 만큼 충분히 큰 부피를 추가하고(일반적으로 13mm 원형 커버슬립의 경우 50μL 사용) 37°C의 가습 챔버에서 밤새 보관합니다.
7. 멸균 기술²⁷을 사용하여 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척합니다.
8. 액체를 조심스럽게 제거하십시오. 표면이 완전히 건조되지 않도록 하십시오.
   알림: 우유 단백질 유도를 위해 세포를 덮기 위해 라미닌을 사용하는 경우 2.9-2.12단계를 따르십시오.
9. 유방 상피 세포 배양. 2% FBS, 0.01mg/mL 인슐린, 0.005μg/mL EGF, 0.05mg/mL 겐타마이신 및 0.05g/mL 노르모신이 보충된 DMEM-F12의 MepG 디스트로글리칸 녹인(DgKI) 또는 MepG 디스트로글리칸 녹아웃 세포(DgKO) 세포를 배양합니다.
10. 웰 플레이트 또는 커버슬립 바닥 접시에서 10,500 cells/^cm2 의 라미닌 자극을 위해 DgKO 및 DgKI 세포를 종자합니다.
11. 희석된 라미닌을 37°C의 세포 배양 인큐베이터에서 30분 동안 배양합니다.
12. 원심분리기 polyLM은 2,000 x g 에서 20분 동안 분주하지만, 단백질 개체의 크기가 작고 효과적으로 수집하기 위해 더 빠른 속도가 필요하기 때문에 LM을 20,000 x g 의 중성 pH에서 20분 동안 원심분리합니다.
13. 멸균 기법²⁷을 사용하여 상층액을 부드럽게 제거하고 3μg/mL 프로락틴, 2.8μM 하이드로코르티손 및 5μg/mL 인슐린이 보충된 DMEM-F12의 적절한 부피의 유도 배지에 재현탁시킵니다
14. 세포 배양 배지에 라미닌을 즉시 전달하여 세포를 자극합니다. 50-800 μg/mL Ln1로 세포를 성공적으로 자극했습니다.

3. 분리된 당단백질을 이용한 라미닌 중합

1. 재조합 니도겐-1과 Ln1을 냉장고의 얼음 위에서 밤새 부드럽게 해동합니다.
2. 세포 배양 배지에서 저단백질 결합 팁과 튜브를 사용하고 멸균 기술을 사용하여 Ln1과 니도겐-1을 1:1 wt/wt 비율로 혼합합니다. 세포 배양 배지에서 순수 Ln1을 대조군으로 사용하십시오.
3. 시각화를 위해 형광 태그가 부착된 라미닌을 사용하는 경우 1:50 wt/wt 비율(예: 2 μg/100 μg)로 재구성 및 추가합니다. 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다.
4. Ln1-nidogen을 배양하거나 37°C의 세포 배양 인큐베이터에서 30분 동안 대조군 Ln1을 배양합니다.
5. 2,000 x g 에서 30분 동안 Ln1-니도겐 공중합체를 원심분리하고 대조군 Ln1을 20,000 x g 에서 30분 동안 원심분리합니다.
6. 상층액을 부드럽게 제거하고 세포 배양 배지에서 최종 농도 100-800μg의 총 단백질/mL로 재현탁시킵니다.
7. 즉시 사용하여 세포를 자극하거나 커버슬립으로 옮겨 가습된 세포 배양 인큐베이터에서 37°C에서 밤새 부착할 수 있습니다.
8. 커버슬립에서 배양 배지를 제거하고 1x PBS로 커버슬립을 세척한 다음 실온에서 10% 포르말린(즉, PBS의 4% 포름알데히드)으로 15분 동안 고정합니다.

4. 디스트로글리칸 발현 세포를 이용한 라미닌 중합

1. 유방 상피 세포 배양. 2% FBS, 0.01mg/mL 인슐린, 0.005μg/mL EGF, 0.05mg/mL 겐타마이신 및 0.05g/mL 노르모신이 보충된 DMEM-F12의 MepG 디스트로글리칸 녹인(DgKI) 또는 MepG 디스트로글리칸 녹아웃 세포(DgKO) 세포를 배양합니다.
2. 성장률의 차이로 인해 DgKI 세포를 5,000 cells/^cm2로 종자하고 DgKO 세포를 8,000 cells/^cm2 로 종자합니다. 가습 인큐베이터에서 37°C에서 2-3일마다 배지를 교체하고 엄격한 멸균 기술을 사용하여 4-5일마다 통과합니다. 적절한 성장 속도를 보장하기 위해 혈구계 또는 자동 세포 카운터(²⁷ )로 세포를 주의 깊게 계수합니다.
3. 10,500 cells/^cm2 에서 라미닌 자극을 위한 시드 세포를 웰 플레이트 또는 커버슬립 바닥 접시에 넣고 DgKI 세포를 사용하여 음성 대조군으로 프랙탈 Ln1 및 DgKO 세포를 생성하여 2일 동안 배양합니다. Ln-1을 냉장고의 얼음 위에서 밤새 부드럽게 해동한 다음 3μg/mL 프로락틴, 2.8μM 하이드로코르티손, 5μg/mL 인슐린이 보충된 DMEM-F12 유도 배지와 혼합합니다. 35mm 접시의 경우 50-800μg의 Ln1과 함께 1mL의 유도 배지를 사용합니다.
4. 형광 Ln1을 사용하는 경우 50:1 wt/wt 비율로 혼합합니다.
5. 세포에서 배지를 제거하고 3μg/mL 프로락틴, 2.8μM 하이드로코르티손 및 5μg/mL 인슐린이 보충된 DMEM-F12의 라미닌 및 유도 배지로 덮습니다.
6. 2일 동안 세포를 배양한 후 10% 포르말린으로 고정합니다.

5. 광학 현미경을 통한 라미닌 미세구조의 특성화

1. 고정 샘플을 수집하고 실온에서 1x PBS로 5분 동안 3회 세척합니다.
2. 0.5% Triton X-100, 3% 소 혈청 알부민, 10% 염소 혈청 및 40μg/mL 항마우스 차단 항체 단편을 사용하여 가습 챔버에서 실온에서 1시간 동안 1x PBS의 샘플을 차단 및 투과시킵니다.
   알림: Triton X-100은 위험합니다. 장갑과 보안경을 착용하고 적절하게 폐기하십시오.
3. 1:100으로 희석하여 항-라미닌 항체를 0.5% Triton X-100 및 3% BSA가 포함된 1x PBS와 혼합하고 가습 챔버에서 실온에서 2시간 동안 또는 4°C에서 밤새 샘플에 첨가합니다(일반적으로 바닥에 젖은 실험실 물티슈가 있는 팁 상자 사용).
4. 1차 항체를 제거하고 0.5% Triton X-100 및 3% BSA가 함유된 1x PBS로 3회 세척합니다.
5. 0.5% Triton X-100 및 3% BSA가 포함된 1x PBS의 샘플에 1:500으로 희석하여 적절한 2차 항체를 추가하고 가습 챔버의 어두운 실온에서 배양합니다.
6. 2차 항체를 제거하고 0.5% Triton X-100 및 3% BSA가 함유된 1x PBS로 3회 세척합니다.
7. 세포가 포함된 샘플의 경우 6μM 팔로이딘을 45분 동안 첨가한 다음 0.5% Triton X-100 및 3% BSA가 포함된 PBS로 3회 세척한 다음 PBS로 3회 세척합니다. 그런 다음 PBS에서 0.1μg/mL DAPI로 5분 동안 염색합니다.
8. 필요한 경우 샘플을 장착합니다.
9. 고해상도 컨포칼 현미경을 사용한 이미지 ln-1 구조. 침지 대물렌즈(Water Immersion Plan Apochromat 40X/1.1NA 또는 Oil Immersion Plan Apochromat 63X/1.4NA)가 장착된 레이저 스캐닝 현미경을 사용하십시오.

6. 박스 카운팅 치수를 통한 라미닌 구조물의 특성화

1. Matlab 툴박스 또는 ImageJ에서 사용할 수 있는 상자 계수 차원 알고리즘을 사용하여 프랙탈 속성을 분석합니다. 이 방법은 라미닌의 이미지를 임계값으로 표시하고 로그-로그에 플로팅하여 Ln1을 포함하는 상자의 개수를 상자 크기와 비교하여 플로팅합니다. 이러한 파라미터 사이의 관계의 기울기는 박스 카운팅 차원입니다: 비프랙탈 기하 도형은 0, 1 또는 2의 차원을 갖는 반면, 프랙탈 기하 도형은 정수가 아닌 차원²⁸을 갖습니다.
   참고: 산 처리, 당단백질 처리 및 DgKI 세포 부착 Ln1은 모두 ~1.7의 상자 계수 프랙탈 차원을 갖는 반면 대조군 Ln1은 2.0의 프랙탈 차원을 갖습니다.

7. 전자 현미경을 통한 라미닌 구성물의 특성 분석

1. 세포 배양 배지에 라미닌을 재현탁시키고 습한 37°C 환경에서 90분 동안 실리카 웨이퍼에 흡착시킵니다.
2. pH 7.2에서 0.1M 나트륨 카코딜레이트 완충액의 2.5% 글루타르알데히드에 매트릭스를 고정합니다.
   알림: 글루타르알데히드는 위험하므로 장갑과 보안경이 있는 흄 후드에서 처리하고 유해 폐기물로 처리해야 합니다.
3. pH 7.2에서 0.1M 나트륨 카코딜레이트 완충액의 1% 오스뮴 테트라옥사이드의 후미자 매트릭스.
   알림: 사산화오스뮴은 위험하므로 장갑과 보안경이 있는 흄 후드에서 취급하고 적절하게 폐기해야 합니다. 카코딜레이트는 위험하므로 장갑과 보안경이 있는 흄 후드에서 취급하고 적절하게 폐기해야 합니다.
4. pH 7.2의 카코딜산나트륨 완충액으로 3회 세척합니다.
5. 에탄올 농도를 증가시켜 탈수하십시오.
6. 얇은 금색 층이 있는 스퍼터 코트 매트릭스.
7. 주사 전자 현미경을 사용한 이미지.

결과

Laminin-111은 짧은 팔 끝에 3개의 자가 조립 도메인이 있는 삼량체 단백질입니다(그림 1A). 적절하게 처리하면 짧은 암이 육각형 격자(그림 1B,1C)로 중합될 수 있으며, 이는 더 큰 공간 규모에서 확산 제한 응집체 프랙탈 특성을 나타냅니다(그림 2). 칼슘 함유 중성 pH 완충액에서 배양된 라미닌은 항-Ln1 항체(

토론

라미닌은 상피, 근육 및 신경 장기 시스템에서 ECM의 핵심 요소를 나타내며 세포의 기능적 분화를 조절하는 데 필수적인 역할을 하는 것으로 체외에서 밝혀졌습니다. 세포에 표시되는 라미닌의 구조가 신호 전달 및 결과 세포 표현형^15,16을 조절한다는 증거가 증가하고 있으므로 Ln1 미세 구조를 제어하는 방법은 이 분야에서 일하는 기초 생물학자와 체외...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% formalin	Sigma Aldrich	HT501128
Anti-Laminin primary antibody	Sigma Aldrich	L9393
Anti-Rabbit Alexafluor 488 secondary antibody	Thermo	A32731
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A9418
CaCl2	Sigma Aldrich	C4901 or similar
Cell Culture Incubator	Thermo	Heracell 150 or similar
Centrifuge for microcentrifuge tubes	Eppendorf	5418 or similar
Confocal Microscope	Zeiss	LSM 710 or equivalent
Coverslips	Thermo	25CIR-1 or similar
DMEM-F12, Liquid, High Glucose, +HEPES, L-glutamine, +Phenol red	Thermo	11330107
EGF (Epidermal Growth Factor)	Sigma Aldrich	11376454001
Fluorescently Labeled Laminin	Cytoskeleton Inc	LMN02
Gentamicin	VWR	VWRV0304-10G
Glutaraldehyde	Sigma Aldrich	G5882
HCl	Sigma Aldrich	320331 or similar
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888-5G
Insulin	Sigma Aldrich	16634-50mg
MepG Dystroglycan Knockout Cells	LBNL	N/A
NaOH	Sigma Aldrich	S8045 or similar
Normocin	Invivogen	ant-nr-1
Osmium Tetroxide	Sigma Aldrich	75633
Ovine Prolactin	Los Angeles Biomedical Research Institute	Ovine Pituitary Prolactin
Phalloidin	Thermo	A22287
Phosphate Buffered Saline	Thermo	10010023 or similar
Purified Laminin-111	Sigma Aldrich	L2020-1MG
Recombinant human Nidogen-1, carrier free	R&D systems	2570-ND-050
Sodium Acetate	Sigma Aldrich	S2889 or similar
Sodium Cacodylate	Sigma Aldrich	C0250
Sterile filters	Millipore	SLGP033RS or similar
Tris	Sigma Aldrich	252859 or similar
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Ultra-low protein binding tubes	VWR	76322-516, 76322-522 or similar
Ultrapure water	Thermo	15230253 or similar