יצירת מיקרו-מבנה פרקטלי של למינין-111 כדי לאותת לתאים

Summary

אנו מתארים שלוש שיטות ליצירת פולימרי Ln1 בעלי תכונות פרקטליות המאותתות לתאים באופן שונה בהשוואה ל-Ln1 לא פולימרי.

Abstract

Laminin-111 (Ln1) הוא חלק חיוני של המטריצה החוץ תאית באפיתליה, שרירים ומערכות עצביות. הראינו בעבר שהמיקרו-מבנה של Ln1 משנה את האופן שבו הוא מאותת לתאים, אולי משום שהרכבת Ln1 לרשתות חושפת תחומי דבק שונים. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שלוש שיטות ליצירת Ln1 פולימרי.

Introduction

שלא כמו גורמי גדילה או ציטוקינים, חלבוני מטריצה חוץ-תאיים (ECM) יכולים להתאסף לרשתות מבניות. מכיוון שתפקוד לקוי של ECM הוא מרכיב מרכזי במצבי מחלה רבים, המנגנונים שבאמצעותם תאים חשים ומתמרים אותות מהרכב ECM, מיקרו-מבנה וביומכניקה הם מטרות אטרקטיביות לפיתוח טיפולי. עדויות הולכות ומצטברות מצביעות על כך שהמיקרו-מבנה של רשתות אלה ממלא תפקיד מרכזי באופן שבו חלבונים אלה מאותתים לתאים. עד כה, הקשר הזה בין מיקרו-מבנה ECM לבין תפקוד התאים הוכח עבור קולגן I¹, פיברונקטין² ופיברין³.

Laminin-111 (Ln1) הוא חלבון טרימרי בצורת צלב המהווה מרכיב מבני מרכזי במטריצה החוץ תאית שבאה במגע עם תאי אפיתל⁴, תאי שריר⁵ ותאים עצביים⁶. בבלוטת החלב, Ln1 הכרחי להתמיינות תפקודית של תאי אפיתל בלוטת החלב לתאים מייצרי חלב ^7,8,9, ו- Ln1 חיוני להשראת היפוך הגידול^10,11. Ln1 ולמינינים אחרים נחוצים להתפתחות רשתות אקטין קליפת המוח וארגון סרקולמה בשריר^12,13, ולנדידת תאים עצביים וצמיחת נוירונים¹³ . לפיכך, הבנת המנגנונים שבאמצעותם למינין מאותת לתאים היא תחום מחקר פעיל.

Ln1 מכיל תחומי הדבקה מרובים עבור מגוון רחב של קולטנים, כולל אינטגרינים, סינדקנים, דיסטרופיקן, LBP-110 ו-LamR (איור 1A)^4,14. מקטע E8, המכיל את התחומים הכדוריים c-terminus של למינין α1, הכרחי לקשירת דיסטרופיקן ואינטגרינים α6β1 ו- α3β1¹⁵, והוא הכרחי להתמיינות פונקציונלית של תאי אפיתל ^15,16. לעומת זאת, הזרועות הקצרות מראות פעילות ביולוגית שונה¹⁷, כלומר זמינות לזיהוי תחומי Ln1 שונים אלה לאחר היווצרות הרשת עשויה לשנות את התנהגות התא.

לאחרונה הראינו כי Ln1 המסודר ברשת פולימרית מציג תכונות פרקטליות (כלומר, מבנה הדומה לעצמו על פני סקאלות אורך מרובות)¹⁸. רשתות פרקטליות מאותתות באופן שונה לתאי אפיתל בהשוואה ל- Ln1, אשר חסר סידור זה¹⁹. רשת פרקטלית זו מצביעה על מבנה הרכבה מסוים, שבו הזרוע הארוכה חשופה באופן מועדף לתאים¹⁸. כתוצאה מתצוגת זרועות ארוכות ושונה זו, תאי אפיתל עוברים התמיינות תפקודית לתאים מייצרי חלב עם צמתים הדוקים מאורגנים היטב ודיכוי סיבי עקה אקטין¹⁹.

אנו מתארים 3 שיטות ליצירת רשתות Ln1 מאינטראקציות קשירת זרוע קצרה-זרוע קצרה, אשר מראות תצוגה גבוהה של הזרוע הארוכה Ln1: 1) על ידי הרכבה ללא תאים עם מאגרים חומציים, 2) על ידי דגירה משותפת עם גליקופרוטאינים, או 3) על ידי אינטראקציה עם דיסטרופיקן פני התא. שלוש שיטות אלה מייצרות מיקרו-מבנים דומים של למינינים באמצעות שלושה מנגנונים שונים מאוד, המאפשרים גמישות בתכנון הניסוי. עבודות קודמות מצביעות על כך ששלוש שיטות אלה יכולות לייצג חוסן ביולוגי: באפיתל של בלוטת החלב, דיסטרוגליקן על פני התא, גליקופרוטאינים, או למינין במבנה מלאכותי יכולים לגרום להתמיינות תפקודית¹⁹. לפיכך, החוקרים יכולים לבחור בין שיטות אלה בהתבסס על נושא המחקר: תאים המבטאים דיסטרוגליקן אינם מראים רגישות למיקרו-מבנה Ln-1, שכן דיסטרופיקן בקרום התא גורם לפילמור נכון לרשת פרקטלית^19,20. Matrigel, תערובת של למינינים וגליקופרוטאינים²¹, מייצג את המקור החסכוני ביותר של Ln-1, ומציע את המיקרו-מבנה הדרוש כדי לגרום לתאי חלב נוקאאוט דיסטרופיקניים להתמיין²⁰, אך מכיל תערובת מורכבת של חלבונים עם שונות רבה להרבה. PolyLM מייצגת את המערכת הרדוקציוניסטית הנקייה ביותר המספקת פונקציה זו, אך בעלות מוגברת וביעילות נמוכה יותר להשראת התמיינות תאי חלב בהשוואה למטריג'ל¹⁹.

לשלוש שיטות אלה מבנה רשת פרקטלי האופייני לצבירה מוגבלת בדיפוזיה^18,19, והן מראות פעילות ביולוגית שונה בהשוואה ללמינין מצטבר במערכות ניסוי מרובות 22,23,24,25. מחקרים עתידיים המשתמשים בשיטות אלה יוכלו לזהות את הקולטנים והאיתות הדרושים להתמיינות אפיתל ולקבוע לשחזר אינטראקציות נורמליות בין מטריצת תאים בתאים במיקרו-סביבות חריגות²⁰, כגון גידולים.

Protocol

1. הפשרה ו aliquot laminin-111

הערה: למינין-111 מטוהר זמין באופן מסחרי (בדרך כלל מטוהר ממטריצת EHS שנמכרת כמטריג'ל), אך לא כל המקורות מספקים חלבון שלם ולא מתפרק.

1. ודא כי Ln1 אינו פגום על ידי מיקור Ln1 והפעלת גודל לא כולל כרומטוגרפיה²⁶ או אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילאמיד²⁶. ל-Ln1 מפורק צריכות להיות רצועות ב-337 kDa, 197 kDa ו-177 kDa, ול-Ln1 מקורי צריכה להיות להקה אחת ב-711 kDa.
2. הפשירו Ln1 על קרח במקרר למשך הלילה, והכניסו אותו לצינורות מיקרו-צנטריפוגות דלות חלבון (בדרך כלל aliquot ב-100 מיקרוגרם לשפופרת עבור שכבות-על של תרבית, או 10 מיקרוגרם עבור ציפויים) באמצעות קצוות קשירת חלבון נמוכים וטכניקה סטרילית²⁷. להקפיא aliquots ולאחסן ב -80 °C.

2. פילמור למינין באמצעות מאגרי pH נמוכים

1. צור חיץ פילמור polyLM: שקול וערבב 1 mM CaCl₂ ו 20 mM נתרן אצטט במים טהורים במיוחד. לאחר מכן להתאים את ה- pH ל 4.0, באמצעות HCl או חומצה אצטית. מסננים סטריליים דרך מסנן 0.2 מיקרומטר, ומאחסנים בטמפרטורה של 4°C.
2. צור חיץ פילמור בקרה: ערבב 1 mM CalCl₂ ו- 20 mM Tris וכוונן את ה- pH ל- 7.0, באמצעות 10 N HCl או 12 N NaOH לפי הצורך. מסננים סטריליים דרך מסנן 0.2 מיקרומטר, ומאחסנים בטמפרטורה של 4°C.
   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
3. הפשירו את המספר הדרוש של אליציטוטים Ln-1 במקרר למשך הלילה.
4. באמצעות טכניקת תרבית תאים סטרילית, הוסף את המאגר המתאים (או חיץ פילמור פוליLM משלב 2.1 או חיץ פילמור בקרה משלב 2.2) לאליציטוטים למינין בריכוז סופי של 100 מיקרוגרם / מ"ל (כלומר הוסף 0.5 מ"ל ל 50 מיקרוגרם aliquots) וערבב בעדינות על ידי pipetting.
5. אם אתם משתמשים בלמינין עם תווית פלואורסצנטית להמחשה, יש ליצור מחדש ולהוסיף ביחס של 1:50 wt/wt (לדוגמה, 2 מיקרוגרם/100 מיקרוגרם) ולערבב בעדינות באמצעות פיפט.
   הערה: אם אתה משתמש בלמינינים כמצע עבור קובץ מצורף לתא, בצע את שלבים 2.6-2.8:
6. מיד לאחר דילול בחיץ מתאים, מעבירים למינינים לתרבית פלסטיק או כלי זכוכית ודגרים לילה באינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. שימו לב שבעת ציפוי כיסויים, הוסיפו נפח גדול מספיק כדי ליצור טיפה מאוזנת (בדרך כלל, השתמשו ב-50 מיקרוליטר לכיסוי עגול של 13 מ"מ), ושמרו בתא לח למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C.
7. בטכניקה סטרילית²⁷, יש לשטוף במי מלח חוצצים פוספט 1x (PBS).
8. מוציאים את הנוזל בזהירות. אין לאפשר למשטח להיות יבש לחלוטין.
   הערה: אם אתה משתמש בלמינינים לכיסוי תאים להשראת חלבון חלב, בצע את השלבים 2.9-2.12:
9. תרבית תאי אפיתל החלב. תרבית תאי דיסטרוגליקן מסוג MepG (DgKI) או תאי נוקאאוט דיסטרוגליקן MepG (DgKO) בתאי DMEM-F12 בתוספת 2% FBS, 0.01 מ"ג/מ"ל אינסולין, 0.005 מיקרוגרם/מ"ל EGF, 0.05 מ"ג/מ"ל גנטמיצין ו-0.05 גרם/מ"ל נורמוצין.
10. זרע DgKO ו DgKI תאים לגירוי למינין ב 10,500 תאים / ס"מ² בצלחות באר או לכסות כלים תחתונים
11. לדגור על למינינים מדוללים באינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות.
12. צנטריפוגה polyLM aliquots ב 2,000 x גרם במשך 20 דקות, אבל צנטריפוגה LM ב pH ניטרלי ב 20,000 x גרם במשך 20 דקות בשל גודל קטן יותר של ישויות חלבון צורך מהירויות גבוהות יותר לאסוף ביעילות.
13. באמצעות טכניקה סטרילית²⁷, להסיר את supernatant בעדינות, ולהשהות מחדש בנפח מתאים של אמצעי השראה של DMEM-F12 בתוספת 3 מיקרוגרם / מ"ל פרולקטין, 2.8 מיקרומטר הידרוקורטיזון, ו 5 מיקרוגרם / מ"ל אינסולין
14. העבר למינין בתווך תרבית התא באופן מיידי כדי לעורר תאים. גירינו בהצלחה תאים עם 50-800 מיקרוגרם/מ"ל Ln1

3. פילמור למינין באמצעות גליקופרוטאינים מבודדים

1. הפשירו בעדינות nidogen-1 ו-Ln1 רקומביננטיים על קרח במקרר למשך הלילה.
2. ערבבו את Ln1 עם nidogen-1 ביחס של 1:1 wt/wt בתווך תרבית תאים תוך שימוש בקצוות ובצינורות דלי קשירת חלבונים ובטכניקה סטרילית. השתמש ב- Ln1 טהור במדיום תרבית תאים כבקרה.
3. אם אתה משתמש בלמינין מתויג פלואורסצנטית לתצוגה חזותית, צור מחדש והוסף ביחס של 1:50 wt/wt (לדוגמה, 2 מיקרוגרם/100 מיקרוגרם). מערבבים בעדינות על ידי פיפט.
4. לדגור על Ln1-nidogen או לשלוט Ln1 באינקובטור תרבית תאים ב 37 ° C במשך 30 דקות.
5. צנטריפוגה Ln1-nidogen קופולימרים ב 2,000 x גרם במשך 30 דקות ואת הבקרה Ln1 ב 20,000 x גרם במשך 30 דקות.
6. מסירים בעדינות את הסופרנאטנט ומשהים מחדש בתווך תרבית התאים לריכוז סופי של 100-800 מיקרוגרם סה"כ חלבון/מ"ל.
7. יש להשתמש מיד כדי לעורר תאים, או להעביר לכיסויים ולאפשר להיצמד למשך הלילה לטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטורים של תרביות תאים לחות.
8. יש להסיר את מדיום התרבית מהכיסויים, לשטוף את הכיסויים עם 1x PBS, ולאחר מכן לתקן עם 10% פורמלין (כלומר, 4% פורמלדהיד ב-PBS) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

4. פילמור למינין באמצעות תאים המבטאים דיסטרוגליקן

1. תרבית תאי אפיתל החלב. תרבית תאי דיסטרוגליקן מסוג MepG (DgKI) או תאי נוקאאוט דיסטרוגליקן MepG (DgKO) בתאי DMEM-F12 בתוספת 2% FBS, 0.01 מ"ג/מ"ל אינסולין, 0.005 מיקרוגרם/מ"ל EGF, 0.05 מ"ג/מ"ל גנטמיצין ו-0.05 גרם/מ"ל נורמוצין.
2. תאי DgKI זרעים ב-5,000 תאים לסמ"ק², ותאי DgKO זרעים ב-8,000 תאים לסמ"ק² עקב הבדלים בקצב הצמיחה. תרבית ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטורים לחים עם שינויי מדיה כל 2-3 ימים ומעברים כל 4-5 ימים באמצעות טכניקה סטרילית קפדנית. ספור תאים בזהירות עם המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי²⁷ כדי להבטיח קצבי גדילה מתאימים.
3. תאי זרעים לגירוי למינין ב 10,500 תאים / ס"מ² בצלחות באר או לכסות כלים תחתונים ותרבית במשך יומיים, באמצעות תאי DgKI כדי לייצר תאי Ln1 ו- DgKO פרקטליים כבקרות שליליות. יש להפשיר את Ln-1 בעדינות למשך הלילה על קרח במקרר, ולאחר מכן לערבב עם מצע אינדוקציה של DMEM-F12 בתוספת פרולקטין של 3 מק"ג/מ"ל, הידרוקורטיזון של 2.8 מיקרומטר ואינסולין של 5 מק"ג/מ"ל. עבור צלחת 35 מ"מ, השתמש 1 מ"ל של מדיה אינדוקציה עם 50-800 מיקרוגרם של Ln1.
4. אם אתם משתמשים ב-Ln1 פלואורסצנטי, ערבבו ביחס של 50:1 wt/wt.
5. יש להסיר מדיה מהתאים, ולכסות בלמינין ובאמצעי אינדוקציה של DMEM-F12 בתוספת פרולקטין של 3 מיקרוגרם/מ"ל, הידרוקורטיזון של 2.8 מיקרומטר ואינסולין של 5 מק"ג/מ"ל
6. תאים תרבית במשך 2 ימים, ולאחר מכן לתקן עם 10% פורמלין.

5. אפיון מיקרו-מבנה למינין באמצעות מיקרוסקופ אופטי

1. אספו דגימות קבועות ושטפו 3 פעמים עם 1x PBS בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
2. יש לחסום ולחדור דגימות ב-PBS 1x עם 0.5% Triton X-100, אלבומין בסרום 3% בקר, 10% סרום עיזים ומקטע נוגדנים חוסם נגד עכבר 40 מיקרוגרם/מ"ל למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בתא לח.
   הערה: Triton X-100 מסוכן. יש לטפל עם כפפות והגנה על העיניים ולהיפטר בהתאם.
3. יש לערבב נוגדן אנטי-למינין בדילול של 1:100 עם 1x PBS עם 0.5% Triton X-100 ו-3% BSA ולהוסיף לדגימות במשך שעתיים בטמפרטורת החדר או למשך הלילה ב-4°C בתא לח (בדרך כלל להשתמש בקופסאות קצה עם מגבון מעבדה רטוב בתחתית).
4. יש להסיר את הנוגדן הראשוני ולשטוף 3 פעמים עם PBS אחד עם 0.5% Triton X-100 ו-3% BSA.
5. יש להוסיף נוגדן משני מתאים בדילול של 1:500 לדגימות ב-1x PBS עם 0.5% Triton X-100 ו-3% BSA ולדגור בטמפרטורת החדר בחושך בתא לח.
6. יש להסיר נוגדנים משניים ולשטוף 3 פעמים עם 1x PBS עם 0.5% Triton X-100 ו-3% BSA.
7. עבור דגימות המכילות תאים, יש להוסיף פאלואידין 6 מיקרומטר למשך 45 דקות, לאחר מכן 3 שטיפות עם PBS עם 0.5% Triton X-100 ו-3% BSA, ולאחר מכן 3 שטיפות עם PBS. לאחר מכן יש להכתים עם 0.1 מיקרוגרם/מ"ל DAPI ב-PBS למשך 5 דקות.
8. הר דוגמאות במידת הצורך.
9. מבנה תמונה ln-1 באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי ברזולוציה גבוהה. השתמש במיקרוסקופ סריקת לייזר המצויד במטרות טבילה (תוכנית טבילה במים Apochromat 40X/1.1NA או טבילת שמן Plan Apochromat 63X/1.4NA).

6. אפיון מבני למינין באמצעות ממד ספירת קופסאות

1. נתח תכונות פרקטליות באמצעות אלגוריתמים של ממדי ספירת קופסאות הזמינים בארגזי הכלים של Matlab או ב- ImageJ. שיטות אלה מציבות תמונות סף של למינין והתוויית יומן בהתוויית יומן את מספר התיבות המכילות Ln1 בהשוואה לגודל התיבות. שיפוע היחסים בין פרמטרים אלה הוא ממד ספירת הקופסאות: גאומטריות לא פרקטליות יהיו בעלות ממד של 0, 1 או 2, בעוד שגיאומטריות פרקטליות יהיו בעלות ממד לא שלם²⁸.
   הערה: ל-Ln1 המחובר לתאי DgKI המטופלים בחומצה, מטופלים בגליקופרוטאין ומחוברים לתאי DgKI יש ממד פרקטלי של ~1.7, בעוד של-Ln1 הבקרה יש ממד פרקטלי של 2.0.

7. אפיון מבני למינין באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים

1. להשהות למינינים במדיה תרבית תאים ולאפשר לספוח פרוסות סיליקה במשך 90 דקות בסביבה לחה 37 ° C.
2. תקן מטריצות ב 2.5% גלוטראלדהיד ב 0.1 M נתרן cacodylate חיץ ב pH 7.2.
   הערה: גלוטראלדהיד הוא מסוכן ויש לטפל בו במכסה אדים עם כפפות והגנה על העיניים ולהשליך אותו כפסולת מסוכנת.
3. מטריצות Postfix ב 1% osmium tetroxide ב 0.1 M נתרן cacodylate חיץ ב pH 7.2.
   הערה: אוסמיום טטרוקסיד הוא מסוכן ויש לטפל בו במכסה אדים עם כפפות והגנה על העיניים ולסלק אותו כראוי. Cacodylate הוא מסוכן ויש לטפל בו במכסה מנוע עם כפפות והגנה על העיניים ולהיפטר ממנו כראוי.
4. יש לשטוף 3 פעמים במאגר נתרן קקודילט ב-pH 7.2.
5. להתייבש עם ריכוזים הולכים וגדלים של אתנול.
6. מפזרים מטריצות מעיל עם שכבה דקה של זהב.
7. תמונה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

תוצאות

Laminin-111 הוא חלבון טרימרי עם שלושה תחומי הרכבה עצמית בקצה זרועותיו הקצרות (איור 1A). כאשר הן מטופלות כראוי, הזרועות הקצרות יכולות להתפלמר לסריג משושה (איור 1B,1C), אשר מציג תכונות פרקטליות אגרגטיביות מוגבלות דיפוזיה בסקאלות מרחביות גדולות יותר (

Discussion

למינינים מייצגים מרכיב מרכזי של ECM במערכות אפיתל, שרירים ואיברים עצביים, והוכחו במבחנה כממלאים תפקידים חיוניים בוויסות ההתמיינות התפקודית של תאים. עדויות הולכות ומצטברות מצביעות על כך שמבנה הלמינין המוצג לתאים מווסת את האיתות שלו ואת פנוטיפ התא^15,16 המתקבל ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% formalin	Sigma Aldrich	HT501128
Anti-Laminin primary antibody	Sigma Aldrich	L9393
Anti-Rabbit Alexafluor 488 secondary antibody	Thermo	A32731
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A9418
CaCl2	Sigma Aldrich	C4901 or similar
Cell Culture Incubator	Thermo	Heracell 150 or similar
Centrifuge for microcentrifuge tubes	Eppendorf	5418 or similar
Confocal Microscope	Zeiss	LSM 710 or equivalent
Coverslips	Thermo	25CIR-1 or similar
DMEM-F12, Liquid, High Glucose, +HEPES, L-glutamine, +Phenol red	Thermo	11330107
EGF (Epidermal Growth Factor)	Sigma Aldrich	11376454001
Fluorescently Labeled Laminin	Cytoskeleton Inc	LMN02
Gentamicin	VWR	VWRV0304-10G
Glutaraldehyde	Sigma Aldrich	G5882
HCl	Sigma Aldrich	320331 or similar
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888-5G
Insulin	Sigma Aldrich	16634-50mg
MepG Dystroglycan Knockout Cells	LBNL	N/A
NaOH	Sigma Aldrich	S8045 or similar
Normocin	Invivogen	ant-nr-1
Osmium Tetroxide	Sigma Aldrich	75633
Ovine Prolactin	Los Angeles Biomedical Research Institute	Ovine Pituitary Prolactin
Phalloidin	Thermo	A22287
Phosphate Buffered Saline	Thermo	10010023 or similar
Purified Laminin-111	Sigma Aldrich	L2020-1MG
Recombinant human Nidogen-1, carrier free	R&D systems	2570-ND-050
Sodium Acetate	Sigma Aldrich	S2889 or similar
Sodium Cacodylate	Sigma Aldrich	C0250
Sterile filters	Millipore	SLGP033RS or similar
Tris	Sigma Aldrich	252859 or similar
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Ultra-low protein binding tubes	VWR	76322-516, 76322-522 or similar
Ultrapure water	Thermo	15230253 or similar