生成层粘连蛋白-111的分形微观结构以向细胞发出信号

摘要

我们描述了三种生成具有分形特性的 Ln1 聚合物的方法，与未聚合的 Ln1 相比，这些聚合物向细胞发出的信号不同。

摘要

层粘连蛋白-111 （Ln1） 是上皮、肌肉和神经系统中细胞外基质的重要组成部分。我们之前已经证明，Ln1的微观结构改变了它向细胞发出信号的方式，这可能是因为Ln1组装到网络中暴露了不同的粘附结构域。在该协议中，我们描述了三种生成聚合Ln1的方法。

引言

与生长因子或细胞因子不同，细胞外基质 （ECM） 蛋白可以组装成结构网络。由于ECM功能障碍是许多疾病的关键因素，因此细胞从ECM组成、微观结构和生物力学中感知和转导信号的机制是治疗开发的有吸引力的靶标。越来越多的证据表明，这些网络的微观结构在这些蛋白质如何向细胞发出信号方面起着重要作用。迄今为止，ECM 微观结构与细胞功能之间的这种联系已在胶原 I¹、纤连蛋白² 和纤维蛋白³ 中得到证明。

层粘连蛋白-111 （Ln1） 是一种三聚体十字形蛋白质，是细胞外基质的关键结构成分，可接触上皮细胞⁴、肌肉细胞⁵ 和神经细胞⁶。在乳腺中，Ln1 是乳腺上皮细胞功能分化为产奶细胞所必需的 7,8,9，Ln1 对于诱导肿瘤逆转至关重要 ^10,11。Ln1 和其他层粘连蛋白是肌肉中皮质肌动蛋白网络和肌节组织发育所必需的^12,13，以及神经细胞迁移和神经突生长¹³ 所必需的。因此，了解层粘连蛋白向细胞发出信号的机制是一个活跃的研究领域。

Ln1 包含多种受体的多个粘附结构域，包括整合素、突聚糖、肌营养不良聚糖、LBP-110 和 LamR（图 1A）^4,14。含有层粘连蛋白 α1 的 c 末端球状结构域的 E8 片段是结合抗肌萎缩聚糖和整合素 α6β1 和 α3β1¹⁵ 所必需的，并且是上皮细胞功能分化所必需的^15,16。相比之下，短臂显示出不同的生物活性¹⁷，这意味着在网络形成后识别这些不同Ln1结构域的可用性可以改变细胞行为。

我们最近证明，排列成聚合物网络的 Ln1 表现出分形特性（即在多个长度尺度上自相似的结构）¹⁸。与缺乏这种排列的 Ln1 相比，分形网络对上皮细胞发出的信号不同¹⁹。该分形网络表示特定的组装结构，其中长臂优先暴露于单元¹⁸。由于这种不同的长臂显示，上皮细胞经历功能分化为产奶细胞，具有组织良好的紧密连接和肌动蛋白应力纤维^{的抑制 19}。

我们描述了从短臂-短臂结合相互作用中生成 Ln1 网络的 3 种方法，这些方法显示了 Ln1 长臂的高显示:1） 通过与酸性缓冲液的无细胞组装，2） 通过与糖蛋白共孵育，或 3） 通过与细胞表面抗肌萎缩聚糖的相互作用。这三种方法通过三种截然不同的机制产生相似的层粘连蛋白微观结构，从而在实验设计中具有灵活性。先前的研究表明，这三种方法可以代表生物学的稳健性:在乳腺上皮细胞中，细胞表面抗肌萎缩聚糖、糖蛋白或人工结构的层粘连蛋白都可以诱导功能分化¹⁹。因此，研究人员可以根据研究对象在这些方法之间进行选择:表达抗肌萎缩聚糖的细胞对 Ln-1 微观结构不敏感，因为细胞膜中的抗肌萎缩聚糖诱导正确的聚合成分形网络^19,20。基质凝胶是层粘连蛋白和糖蛋白^{的混合物21}，代表了Ln-1最经济的来源，并提供了诱导抗肌萎缩聚糖敲除乳腺细胞分化所需的微观结构²⁰，但含有具有批次间变异性的复杂蛋白质混合物。PolyLM 代表了提供此功能的最干净、最还原的系统，但与^{Matrigel 19} 相比，诱导乳腺细胞分化的成本更高，功效更低。

这三种方法具有扩散限制聚集的分形网络结构^特征18,19，并且与多个实验系统中的聚集层粘连蛋白相比，显示出生物活性的改变22,23,24,25。使用这些方法的未来研究可以识别上皮分化所需的受体和信号传导，并确定在异常微环境²⁰（例如肿瘤）中恢复细胞中的正常细胞-基质相互作用。

研究方案

1. 解冻和等分试样层粘连蛋白-111

注意:纯化的层粘连蛋白-111 可在市面上买到（通常从作为基质出售的 EHS 基质中纯化），但并非所有来源都能提供完整、未降解的蛋白质。

1. 通过获取 Ln1 和运行尺寸排阻色谱²⁶ 或聚丙烯酰胺凝胶电泳²⁶ 确认 Ln1 未降解。变性 Ln1 应具有 337 kDa、197 kDa 和 177 kDa 的条带，而天然 Ln1 应具有 711 kDa 的单条带。
2. 在冰箱中将 Ln1 在冰上解冻过夜，并使用低蛋白结合尖端和无菌技术等分到低蛋白结合微量离心管中（通常以 100 μg/管等分试样进行培养覆盖，或 10 μg 用于包被）²⁷。冷冻等分试样并储存在-80°C。

2. 使用低pH缓冲液进行层粘连蛋白聚合

1. 制备polyLM聚合缓冲液:称取1 mM CaCl₂ 和20 mM乙酸钠在超纯水中混合。然后使用HCl或乙酸将pH调节至4.0。通过0.2μm过滤器进行无菌过滤，并储存在4°C。
2. 制备对照聚合缓冲液:混合 1 mM CalCl₂ 和 20 mM Tris，并根据需要使用 10 N HCl 或 12 N NaOH 将 pH 调节至 7.0。通过0.2μm过滤器进行无菌过滤，并储存在4°C。
   注意:协议可以在此处暂停。
3. 在冰箱中解冻所需数量的 Ln-1 等分试样过夜。
4. 使用无菌细胞培养技术，将适当的缓冲液（步骤2.1中的polyLM聚合缓冲液或步骤2.2中的对照聚合缓冲液）加入到终浓度为100μg/ mL的层粘连蛋白等分试样中（即向50μg等分试样中加入0.5mL），并通过移液轻轻混合。
5. 如果使用荧光标记的层粘连蛋白进行可视化，则重新配制并以 1:50 wt/wt 的比例加入（例如 2 μg/100 μg），并通过移液轻轻混合。
   注意:如果使用层粘连蛋白作为细胞附着的底物，请按照步骤2.6-2.8操作:
6. 在适当的缓冲液中稀释后，立即将层粘连蛋白转移到培养塑料或玻璃器皿上，并在37°C的细胞培养箱中孵育过夜。 请注意，涂覆盖玻片时，加入足够大的体积以产生平衡液滴（通常，13 mm圆形盖玻片使用50μL），并在37°C的加湿室中保存过夜。
7. 使用无菌技术²⁷，用1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤。
8. 小心地取出液体。不要让表面完全干燥。
   注意:如果使用层粘连蛋白覆盖细胞以诱导牛奶蛋白，请按照步骤2.9-2.12操作:
9. 培养乳腺上皮细胞。在补充有 2% FBS、0.01 mg/mL 胰岛素、0.005 μg/mL EGF、0.05 mg/mL 庆大霉素和 0.05 g/mL 正霉素的 DMEM-F12 中培养 MepG 抗肌萎缩聚糖敲入 （DgKI） 或 MepG 抗肌萎缩聚糖敲除细胞 （DgKO）。
10. 在孔板或盖玻片底部培养皿中以 10,500 个细胞/cm² 的速度接种用于层粘连蛋白刺激的 DgKO 和 DgKI 细胞
11. 将稀释的层粘连蛋白在37°C的细胞培养箱中孵育30分钟。
12. 将polyLM等分试样以2,000× g 离心20分钟，但由于蛋白质实体的尺寸较小，并且需要更高的速度才能有效收集，因此在20,000× g 的中性pH下离心LM20分钟。
13. 使用无菌技术²⁷，轻轻除去上清液，并重悬于补充有3μg/mL催乳素，2.8μM氢化可的松和5μg/mL胰岛素的适当体积的DMEM-F12诱导培养基中
14. 立即将层粘连蛋白转移到细胞培养基中以刺激细胞。我们已经成功地用50-800μg/mL Ln1刺激细胞

3. 使用分离的糖蛋白进行层粘连蛋白聚合

1. 将重组 nidogen-1 和 Ln1 在冰箱中的冰上轻轻解冻过夜。
2. 使用低蛋白结合尖端和试管并使用无菌技术，在细胞培养基中以 1:1 wt/wt 的比例将 Ln1 与 nidogen-1 混合。使用细胞培养基中的纯 Ln1 作为对照。
3. 如果使用荧光标记的层粘连蛋白进行可视化，则以 1:50 wt/wt 的比例（例如，2 μg/100 μg）复溶并添加。用移液器轻轻混合。
4. 在37°C的细胞培养箱中孵育Ln1-nidogen或对照Ln130分钟。
5. 将Ln1-nidogen共聚物以2,000× g 离心30分钟，将对照Ln1以20,000× g 离心30分钟。
6. 轻轻除去上清液并重悬于细胞培养基中，终浓度为 100-800 μg 总蛋白/mL。
7. 立即用于刺激细胞，或转移到盖玻片上，并在37°C湿润的细胞培养箱中粘附过夜。
8. 从盖玻片中取出培养基，用 1x PBS 洗涤盖玻片，然后在室温下用 10% 福尔马林（即 4% 甲醛在 PBS 中）固定 15 分钟。

4. 使用抗肌萎缩聚糖表达细胞的层粘连蛋白聚合

1. 培养乳腺上皮细胞。在补充有 2% FBS、0.01 mg/mL 胰岛素、0.005 μg/mL EGF、0.05 mg/mL 庆大霉素和 0.05 g/mL 正霉素的 DMEM-F12 中培养 MepG 抗肌萎缩聚糖敲入 （DgKI） 或 MepG 抗肌萎缩聚糖敲除细胞 （DgKO）。
2. 由于生长速率的差异，以 5,000 个细胞/cm² 接种 DgKI 细胞，以 8,000 个细胞/cm² 接种 DgKO 细胞。在37°C湿润培养箱中培养，每2-3天更换一次培养基，每4-5天使用严格的无菌技术传代一次。使用血细胞计数器或自动细胞计数器²⁷ 仔细计数细胞，以确保适当的生长速率。
3. 在孔板或盖玻片底部培养皿中以 10,500 个细胞/cm² 的强度接种用于层粘连蛋白刺激的细胞并培养 2 天，使用 DgKI 细胞产生分形 Ln1 和 DgKO 细胞作为阴性对照。在冰箱中将 Ln-1 在冰上轻轻解冻过夜，然后与补充有 3 μg/mL 催乳素、2.8 μM 氢化可的松和 5 μg/mL 胰岛素的 DMEM-F12 诱导培养基混合。对于 35 mm 培养皿，使用 1 mL 含有 50-800 μg Ln1 的诱导培养基。
4. 如果使用荧光 Ln1，则以 50:1 wt/wt 的比例混合。
5. 从细胞中取出培养基，并用补充有 3 μg/mL 催乳素、2.8 μM 氢化可的松和 5 μg/mL 胰岛素的 DMEM-F12 层粘连蛋白和诱导培养基覆盖
6. 培养细胞 2 天，然后用 10% 福尔马林固定。

5. 通过光学显微镜表征层粘连蛋白微观结构

1. 收集固定样品，并在室温下用1x PBS洗涤3次5分钟。
2. 在室温下，用0.5%Triton X-100,3%牛血清白蛋白，10%山羊血清和40μg/ mL抗小鼠阻断抗体片段在1x PBS中封闭和透化样品1小时。
   注意: Triton X-100 是危险的。戴上手套和护目镜进行处理并妥善处理。
3. 将稀释度为1:100的抗层粘连蛋白抗体与1x PBS与0.5%Triton X-100和3%BSA混合，并在室温下或在4°C下在加湿室中加入样品2小时（通常使用底部带有湿实验室湿巾的尖端盒）。
4. 取出一抗，用 1x PBS 和 0.5% Triton X-100 和 3% BSA 洗涤 3 次。
5. 在含有0.5%Triton X-100和3%BSA的1x PBS样品中以1:500的稀释度向样品中加入适当的二抗，并在室温下在加湿室中避光孵育。
6. 去除二抗，用 1x PBS 和 0.5% Triton X-100 和 3% BSA 洗涤 3 次。
7. 对于含有细胞的样品，加入 6 μM 鬼笔环肽 45 分钟，然后用含有 0.5% Triton X-100 和 3% BSA 的 PBS 洗涤 3 次，然后用 PBS 洗涤 3 次。然后用 0.1 μg/mL DAPI 在 PBS 中染色 5 分钟。
8. 如果合适，可以挂载样品。
9. 使用高分辨率共聚焦显微镜对 ln-1 结构进行成像。使用配备浸没物镜的激光扫描显微镜（水浸复消色差计40X/1.1NA或油浸复消色差计63X/1.4NA）。

6. 通过盒数维度表征层粘连蛋白结构

1. 使用 Matlab 工具箱或 ImageJ 中提供的箱计数维度算法分析分形属性。这些方法对层粘连蛋白的图像进行阈值测量，并在对数对数上绘制含有 Ln1 的盒数与盒的大小。这些参数之间关系的斜率是盒数维数:非分形几何的维数为 0、1 或 2，而分形几何的非整数维数为²⁸。
   注意:酸处理、糖蛋白处理和 DgKI 细胞附着的 Ln1 的盒计数分形维数均为 ~1.7，而对照 Ln1 的分形维数为 2.0。

7. 通过电子显微镜表征层粘连蛋白构建体

1. 将层粘连蛋白重悬于细胞培养基中，并在潮湿的37°C环境中吸附到二氧化硅晶片上90分钟。
2. 将基质固定在 pH 7.2 的 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液中的 2.5% 戊二醛中。
   注意:戊二醛是危险的，应在通风橱中处理，并戴上手套和护目镜，并作为危险废物处理。
3. 在pH 7.2的0.1M二甲胂酸钠缓冲液中的1%四氧化锇中建立后缀基质。
   注意: 四氧化锇是危险的，应在通风橱中处理，并戴上手套和护目镜，并妥善处理。二甲胂酸盐是危险的，应在通风橱中处理，并戴上手套和护目镜，并妥善处理。
4. 在pH 7.2的二甲胂酸钠缓冲液中洗涤3次。
5. 随着乙醇浓度的增加而脱水。
6. 溅射涂层基质上一层薄薄的金。
7. 使用扫描电子显微镜进行图像处理。

结果

层粘连蛋白-111是一种三聚体蛋白，在其短臂末端具有三个自组装结构域（图1A）。如果处理得当，短臂可以聚合成六边形晶格（图1B，1C），在更大的空间尺度上显示出扩散限制的聚集体分形特性（图2）。在含钙的中性pH缓冲液中孵育的层粘连蛋白形成用抗Ln1抗体可视化的小聚集体（图2A），其?...

讨论

层粘连蛋白是上皮、肌肉和神经器官系统中ECM的关键元素，在体外已被证明在调节细胞功能分化中起着重要作用。越来越多的证据表明，向细胞展示的层粘连蛋白结构调节其信号传导和由此产生的细胞表型^15,16，因此控制 Ln1 微观结构的方法应该对在这些领域工作的基础生物学家以及寻求概括体外正常行为的组织工程师感兴趣。更一般地说，已知各种细?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% formalin	Sigma Aldrich	HT501128
Anti-Laminin primary antibody	Sigma Aldrich	L9393
Anti-Rabbit Alexafluor 488 secondary antibody	Thermo	A32731
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A9418
CaCl2	Sigma Aldrich	C4901 or similar
Cell Culture Incubator	Thermo	Heracell 150 or similar
Centrifuge for microcentrifuge tubes	Eppendorf	5418 or similar
Confocal Microscope	Zeiss	LSM 710 or equivalent
Coverslips	Thermo	25CIR-1 or similar
DMEM-F12, Liquid, High Glucose, +HEPES, L-glutamine, +Phenol red	Thermo	11330107
EGF (Epidermal Growth Factor)	Sigma Aldrich	11376454001
Fluorescently Labeled Laminin	Cytoskeleton Inc	LMN02
Gentamicin	VWR	VWRV0304-10G
Glutaraldehyde	Sigma Aldrich	G5882
HCl	Sigma Aldrich	320331 or similar
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888-5G
Insulin	Sigma Aldrich	16634-50mg
MepG Dystroglycan Knockout Cells	LBNL	N/A
NaOH	Sigma Aldrich	S8045 or similar
Normocin	Invivogen	ant-nr-1
Osmium Tetroxide	Sigma Aldrich	75633
Ovine Prolactin	Los Angeles Biomedical Research Institute	Ovine Pituitary Prolactin
Phalloidin	Thermo	A22287
Phosphate Buffered Saline	Thermo	10010023 or similar
Purified Laminin-111	Sigma Aldrich	L2020-1MG
Recombinant human Nidogen-1, carrier free	R&D systems	2570-ND-050
Sodium Acetate	Sigma Aldrich	S2889 or similar
Sodium Cacodylate	Sigma Aldrich	C0250
Sterile filters	Millipore	SLGP033RS or similar
Tris	Sigma Aldrich	252859 or similar
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Ultra-low protein binding tubes	VWR	76322-516, 76322-522 or similar
Ultrapure water	Thermo	15230253 or similar