Génération d’une microstructure fractale de laminine-111 pour signaler aux cellules

Résumé

Nous décrivons trois méthodes pour générer des polymères Ln1 avec des propriétés fractales qui signalent aux cellules différemment par rapport au Ln1 non polymérisé.

Résumé

La laminine-111 (Ln1) est une partie essentielle de la matrice extracellulaire dans les épithéliums, les muscles et les systèmes neuronaux. Nous avons déjà démontré que la microstructure de Ln1 modifie la façon dont il signale aux cellules, peut-être parce que l’assemblage de Ln1 en réseaux expose différents domaines adhésifs. Dans ce protocole, nous décrivons trois méthodes pour générer du Ln1 polymérisé.

Introduction

Contrairement aux facteurs de croissance ou aux cytokines, les protéines de la matrice extracellulaire (MEC) peuvent s’assembler en réseaux structurels. Comme le dysfonctionnement de la MEC est un élément clé de nombreuses maladies, les mécanismes par lesquels les cellules détectent et transduisent les signaux de la composition, de la microstructure et de la biomécanique de la MEC sont des cibles intéressantes pour le développement thérapeutique. De plus en plus de preuves suggèrent que la microstructure de ces réseaux joue un rôle majeur dans la façon dont ces protéines signalent aux cellules. À ce jour, ce lien entre la microstructure de la MEC et la fonction cellulaire a été démontré pour le collagène I¹, la fibronectine² et la fibrine³.

La laminine-111 (Ln1) est une protéine trimérique en forme de croix qui est un composant structurel clé de la matrice extracellulaire qui entre en contact avec les cellules épithéliales⁴, les cellules musculaires⁵ et les cellules neurales⁶. Dans la glande mammaire, Ln1 est nécessaire à la différenciation fonctionnelle des cellules épithéliales de la glande mammaire en cellules productrices de lait ^7,8,9, et Ln1 est crucial pour l’induction de la réversion tumorale^10,11. Ln1 et d’autres laminines sont nécessaires au développement des réseaux d’actine corticale et à l’organisation des sarcolemmes dans le muscle^12,13, ainsi qu’à la migration des cellules neurales et à la croissance des neurites¹³ . Ainsi, la compréhension des mécanismes par lesquels la laminine envoie des signaux aux cellules est un domaine de recherche actif.

Ln1 contient plusieurs domaines adhésifs pour une large gamme de récepteurs, notamment les intégrines, les syndécines, le dystroglycane, le LBP-110 et le LamR (Figure 1A)^4,14. Le fragment E8, qui contient les domaines globulaires c-terminus de la laminine α1, est nécessaire à la liaison du dystroglycane et des intégrines α6β1 et α3β1¹⁵, et il est nécessaire à la différenciation fonctionnelle des cellules épithéliales ^15,16. En revanche, les bras courts montrent une activité biologique différente¹⁷, ce qui signifie que la disponibilité pour la reconnaissance de ces différents domaines Ln1 après la formation du réseau pourrait modifier le comportement cellulaire.

Nous avons récemment démontré que Ln1 arrangé en un réseau polymérique présente des propriétés fractales (c’est-à-dire une structure auto-similaire sur plusieurs échelles de longueur)¹⁸. Les réseaux fractals signalent différemment aux cellules épithéliales par rapport à Ln1, qui n’a pas cet arrangement¹⁹. Ce réseau fractal indique une structure d’assemblage particulière, où le bras long est préférentiellement exposé aux cellules¹⁸. En raison de cette différence de bras long, les cellules épithéliales subissent une différenciation fonctionnelle en cellules productrices de lait avec des jonctions serrées bien organisées et une suppression des fibres de stress d’actine¹⁹.

Nous décrivons 3 méthodes pour générer des réseaux Ln1 à partir d’interactions de liaison bras court-bras court, qui montrent une forte manifestation du bras long Ln1 : 1) par assemblage acellulaire avec des tampons acides, 2) par co-incubation avec des glycoprotéines, ou 3) par interaction avec le dystroglycane de surface cellulaire. Ces trois méthodes génèrent des microstructures de laminines similaires par trois mécanismes très différents, ce qui permet une flexibilité dans la conception expérimentale. Des travaux antérieurs suggèrent que ces trois méthodes pourraient représenter une robustesse biologique : dans les épithéliums des glandes mammaires, le dystroglycane de surface cellulaire, les glycoprotéines ou la laminine structurée artificiellement peuvent induire une différenciation fonctionnelle¹⁹. Ainsi, les chercheurs peuvent choisir entre ces méthodes en fonction du sujet de l’étude : les cellules exprimant le dystroglycane ne montrent aucune sensibilité à la microstructure Ln-1, car le dystroglycane dans la membrane cellulaire induit une polymérisation correcte en un réseau fractal^19,20. Matrigel, un mélange de laminines et de glycoprotéines²¹, représente la source la plus économique de Ln-1 et offre la microstructure nécessaire pour induire les cellules mammaires knock-out des dystroglycanes à se différencier²⁰, mais contient un mélange complexe de protéines avec une variabilité d’un lot à l’autre. PolyLM représente le système le plus propre et le plus réductionniste qui assure cette fonction, mais à un coût accru et à une efficacité moindre pour induire la différenciation des cellules mammaires par rapport à Matrigel¹⁹.

Ces trois méthodes ont une structure de réseau fractal caractéristique de l’agrégation limitée par diffusion^18,19, et montrent une activité biologique altérée par rapport à la laminine agrégée dans plusieurs systèmes expérimentaux 22,23,24,25. De futures études utilisant ces méthodes pourraient identifier les récepteurs et la signalisation nécessaires à la différenciation épithéliale et déterminer comment restaurer les interactions normales entre la matrice cellulaire et la matrice dans les cellules dans des microenvironnements anormaux²⁰, tels que les tumeurs.

Protocole

1. Décongélation et aliquote laminine-111

REMARQUE : La laminine-111 purifiée est disponible dans le commerce (généralement purifiée à partir de la matrice EHS vendue sous le nom de Matrigel), mais toutes les sources ne fournissent pas de protéines intactes et non dégradées.

1. Confirmer que Ln1 n’est pas dégradé en s’approvisionnant en Ln1 et en utilisant la chromatographie d’exclusion de taille^{d’essai 26} ou l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide²⁶. Le Ln1 dénaturé doit avoir des bandes de 337 kDa, 197 kDa et 177 kDa, et le Ln1 natif doit avoir une seule bande de 711 kDa.
2. Décongeler Ln1 sur de la glace au réfrigérateur pendant la nuit et aliquote dans des tubes de microcentrifugation à faible liaison protéique (généralement aliquote à 100 μg/tube pour les superpositions de culture, ou 10 μg pour les enrobages) à l’aide d’embouts à faible liaison protéique et d’une technique stérile²⁷. Congeler les aliquotes et les conserver à -80 °C.

2. Polymérisation de la laminine à l’aide de tampons à faible pH

1. Fabriquer un tampon de polymérisation polyLM : Peser et mélanger 1 mM de CaCl₂ et 20 mM d’acétate de sodium dans de l’eau ultrapure. Ajustez ensuite le pH à 4,0, en utilisant du HCl ou de l’acide acétique. Filtrer stérilement à travers un filtre de 0,2 μm et conserver à 4 °C.
2. Fabriquer un tampon de polymérisation témoin : Mélanger 1 mM de CalCl₂ et 20 mM de Tris et ajuster le pH à 7,0, en utilisant 10 N HCl ou 12 N NaOH si nécessaire. Filtrer stérilement à travers un filtre de 0,2 μm et conserver à 4 °C.
   REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.
3. Décongeler le nombre nécessaire d’aliquotes de Ln-1 au réfrigérateur pendant la nuit.
4. À l’aide d’une technique de culture cellulaire stérile, ajouter le tampon approprié (soit un tampon de polymérisation polyLM de l’étape 2.1, soit un tampon de polymérisation témoin de l’étape 2.2) aux aliquotes de laminine à une concentration finale de 100 μg/mL (c.-à-d. ajouter 0,5 mL à 50 μg d’aliquotes) et mélanger doucement par pipetage.
5. Si vous utilisez de la laminine marquée par fluorescence pour la visualisation, reconstituer et ajouter à un rapport poids/poids de 1 :50 (par exemple 2 μg/100 μg) et mélanger doucement par pipetage.
   REMARQUE : Si vous utilisez des laminines comme substrat pour la fixation des cellules, suivez les étapes 2.6-2.8 :
6. Immédiatement après dilution dans un tampon approprié, transférer les laminines sur du plastique de culture ou de la verrerie et incuber toute la nuit dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C. Il convient de noter que lorsque vous recouvrez des lamelles, ajoutez un volume suffisamment important pour produire une goutte équilibrée (utilisez généralement 50 μL pour une lamelle ronde de 13 mm) et conservez-les dans une chambre humidifiée pendant la nuit à 37 °C.
7. En utilisant la technique stérile²⁷, laver avec 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
8. Retirez le liquide avec précaution. Ne laissez pas la surface être complètement sèche.
   REMARQUE : Si vous utilisez des laminines pour couvrir les cellules pour l’induction des protéines du lait, suivez les étapes 2.9 à 2.12 :
9. Culture de cellules épithéliales mammaires. Culture de cellules de dystroglycanes MepG knock-in (DgKI) ou de cellules MepG dystroglycanes knock-out (DgKO) dans le DMEM-F12 supplémentées en FBS à 2 %, 0,01 mg/mL d’insuline, 0,005 μg/mL d’EGF, 0,05 mg/mL de gentamycine et 0,05 g/mL de normocine.
10. Semez des cellules DgKO et DgKI pour la stimulation de la laminine à 10 500 cellules/^cm2 dans des plaques à puits ou des plats à fond de lamelle
11. Incuber les laminines diluées dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C pendant 30 min.
12. Centrifugez polyLM aliquotes à 2 000 x g pendant 20 minutes, mais centrifugez LM à pH neutre à 20 000 x g pendant 20 minutes en raison de la petite taille des entités protéiques et de la nécessité de vitesses plus élevées pour collecter efficacement.
13. À l’aide de la technique stérile²⁷, retirer délicatement le surnageant et remettre en suspension dans un volume approprié de milieu d’induction de DMEM-F12 complété par 3 μg/mL de prolactine, 2,8 μM d’hydrocortisone et 5 μg/mL d’insuline
14. Transférez immédiatement la laminine dans le milieu de culture cellulaire pour stimuler les cellules. Nous avons stimulé avec succès des cellules avec 50-800 μg/mL Ln1

3. Polymérisation de la laminine à l’aide de glycoprotéines isolées

1. Décongeler doucement le nidogène recombinant 1 et Ln1 sur de la glace au réfrigérateur pendant la nuit.
2. Mélanger Ln1 avec le nidogen-1 à un rapport poids/poids de 1 :1 dans un milieu de culture cellulaire en utilisant des embouts et des tubes à faible liaison protéique et en utilisant une technique stérile. Utilisez du Ln1 pur dans un milieu de culture cellulaire comme témoin.
3. Si vous utilisez de la laminine marquée par fluorescence pour la visualisation, reconstituez et ajoutez à un rapport poids/poids de 1 :50 (p. ex., 2 μg/100 μg). Mélanger délicatement par pipetage.
4. Incuber le Ln1-nidogen ou le contrôle du Ln1 dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C pendant 30 min.
5. Centrifuger les copolymères Ln1-nidogen à 2 000 x g pendant 30 min et le témoin Ln1 à 20 000 x g pendant 30 min.
6. Retirer délicatement le surnageant et le remettre en suspension dans le milieu de culture cellulaire jusqu’à une concentration finale de 100 à 800 μg de protéines totales/mL.
7. Utiliser immédiatement pour stimuler les cellules, ou transférer sur des lamelles et laisser adhérer toute la nuit à 37 °C dans des incubateurs de culture cellulaire humidifiés.
8. Retirer le milieu de culture des lamelles, laver les lamelles avec 1x PBS, puis fixer avec du formol à 10 % (c.-à-d. 4 % de formaldéhyde dans du PBS) pendant 15 minutes à température ambiante.

4. Polymérisation de la laminine à l’aide de cellules exprimant des dystroglycanes

1. Culture de cellules épithéliales mammaires. Culture de cellules de dystroglycanes MepG knock-in (DgKI) ou de cellules MepG dystroglycanes knock-out (DgKO) dans le DMEM-F12 supplémentées en FBS à 2 %, 0,01 mg/mL d’insuline, 0,005 μg/mL d’EGF, 0,05 mg/mL de gentamycine et 0,05 g/mL de normocine.
2. Semez des cellules DgKI à 5 000 cellules/^cm2 et des cellules DgKO à 8 000 cellules/^cm2 en raison des différences de taux de croissance. Culture à 37 °C dans des incubateurs humidifiés avec des changements de milieu tous les 2-3 jours et des passages tous les 4-5 jours en utilisant une technique stérile rigoureuse. Comptez soigneusement les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé²⁷ pour assurer des taux de croissance appropriés.
3. Cellules d’ensemencement pour la stimulation de la laminine à 10 500 cellules/^cm2 dans des plaques à puits ou des boîtes de fond de lamelle et culture pendant 2 jours, en utilisant des cellules DgKI pour générer des cellules fractales Ln1 et DgKO comme témoins négatifs. Décongeler doucement Ln-1 pendant la nuit sur de la glace au réfrigérateur, puis mélanger avec un milieu d’induction de DMEM-F12 complété par 3 μg/mL de prolactine, 2,8 μM d’hydrocortisone et 5 μg/mL d’insuline. Pour une boîte de 35 mm, utilisez 1 mL de milieu à induction contenant 50 à 800 μg de Ln1.
4. Si vous utilisez du Ln1 fluorescent, mélangez à un rapport poids/poids de 50 :1.
5. Retirer les milieux des cellules et les recouvrir de laminine et de milieux d’induction de DMEM-F12 additionnés de 3 μg/mL de prolactine, de 2,8 μM d’hydrocortisone et de 5 μg/mL d’insuline
6. Cultivez des cellules pendant 2 jours, puis fixez avec du formol à 10%.

5. Caractérisation de la microstructure de la laminine par microscopie optique

1. Prélever des échantillons fixes et laver 3 fois avec 1x PBS à température ambiante pendant 5 min.
2. Bloquer et perméabiliser les échantillons dans 1x PBS avec 0,5 % de Triton X-100, 3 % d’albumine sérique bovine, 10 % de sérum de chèvre et 40 μg/mL de fragment d’anticorps anti-blocage de la souris pendant 1 h à température ambiante dans une chambre humidifiée.
   REMARQUE : Triton X-100 est dangereux. Manipulez avec des gants et des lunettes de protection et jetez-les de manière appropriée.
3. Mélanger les anticorps anti-laminine à une dilution de 1 :100 avec 1x PBS avec 0,5 % de Triton X-100 et 3 % de BSA et ajouter aux échantillons pendant 2 h à température ambiante ou toute la nuit à 4 °C dans une chambre humidifiée (généralement utiliser des boîtes à embouts avec une lingette de laboratoire humide au fond).
4. Retirer l’anticorps primaire et laver 3 fois avec 1x PBS avec 0,5% de Triton X-100 et 3% de BSA.
5. Ajouter un anticorps secondaire approprié à une dilution de 1 :500 aux échantillons dans 1x PBS avec 0,5 % de Triton X-100 et 3 % de BSA et incuber à température ambiante dans l’obscurité dans une chambre humidifiée.
6. Retirer l’anticorps secondaire et laver 3 fois avec 1x PBS avec 0,5% de Triton X-100 et 3% de BSA.
7. Pour les échantillons contenant des cellules, ajouter 6 μM de phalloïdine pendant 45 min, suivi de 3 lavages avec du PBS avec 0,5 % de Triton X-100 et 3 % de BSA, et suivi de 3 lavages avec du PBS. Colorer ensuite avec 0,1 μg/mL de DAPI dans du PBS pendant 5 minutes.
8. Monter les échantillons si nécessaire.
9. Image de la structure ln-1 à l’aide de la microscopie confocale à haute résolution. Utilisez un microscope à balayage laser équipé d’objectifs à immersion (plan d’immersion dans l’eau Plan Apochromat 40X/1.1NA ou plan d’immersion dans l’huile Apochromat 63X/1.4NA).

6. Caractérisation des constructions de laminines via la dimension de comptage de boîtes

1. Analysez les propriétés fractales à l’aide des algorithmes de dimension de comptage de boîtes disponibles dans les boîtes à outils Matlab ou dans ImageJ. Ces méthodes permettent de chiffrer les images de laminine et de tracer sur un logarithme le nombre de boîtes contenant Ln1 par rapport à la taille des boîtes. La pente de la relation entre ces paramètres est la dimension de comptage de boîtes : les géométries non fractales auront une dimension de 0, 1 ou 2, tandis que les géométries fractales ont une dimension non entière^{de 28}.
   REMARQUE : Les Ln1 traités à l’acide, aux glycoprotéines et aux cellules DgKI ont tous une dimension fractale de comptage de boîtes de ~1,7, tandis que le Ln1 témoin a une dimension fractale de 2,0.

7. Caractérisation des constructions laminines par microscopie électronique

1. Remettre les laminines en suspension dans des milieux de culture cellulaire et les laisser adsorber sur des plaquettes de silice pendant 90 minutes dans un environnement humide à 37 °C.
2. Fixer les matrices dans du glutaraldéhyde à 2,5 % dans un tampon de cacodylate de sodium 0,1 M à pH 7,2.
   REMARQUE : Le glutaraldéhyde est dangereux et doit être manipulé dans une hotte avec des gants et des lunettes de protection et éliminé comme déchet dangereux.
3. Matrices Postfix dans du tétroxyde d’osmium à 1 % dans un tampon de cacodylate de sodium 0,1 M à pH 7,2.
   REMARQUE : Le tétroxyde d’osmium est dangereux et doit être manipulé dans une hotte avec des gants et des lunettes de protection et éliminé de manière appropriée. Le cacodylate est dangereux et doit être manipulé dans une hotte avec des gants et des lunettes de protection et éliminé de manière appropriée.
4. Laver 3 fois dans un tampon de cacodylate de sodium à pH 7,2.
5. Déshydrater avec des concentrations croissantes d’éthanol.
6. Pulvériser les matrices de couche avec une fine couche d’or.
7. Image par microscopie électronique à balayage.

Résultats

La laminine-111 est une protéine trimérique avec trois domaines auto-assemblés à l’extrémité de ses bras courts (Figure 1A). Lorsqu’ils sont traités de manière appropriée, les bras courts peuvent polymériser en un réseau hexagonal (Figure 1B,1C), qui présente des propriétés fractales agrégées limitées par diffusion à des échelles spatiales plus grandes (Figure 2). La laminine incubée dans des...

Discussion

Les laminines représentent un élément clé de la MEC dans les systèmes épithéliaux, musculaires et d’organes neuraux, et il a été démontré in vitro qu’elles jouent un rôle essentiel dans la régulation de la différenciation fonctionnelle des cellules. De plus en plus de preuves indiquent que la structure de la laminine présentée aux cellules régule sa signalisation et le phénotype cellulaire résultant^15,16, donc les méthodes de contrôle de ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% formalin	Sigma Aldrich	HT501128
Anti-Laminin primary antibody	Sigma Aldrich	L9393
Anti-Rabbit Alexafluor 488 secondary antibody	Thermo	A32731
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A9418
CaCl2	Sigma Aldrich	C4901 or similar
Cell Culture Incubator	Thermo	Heracell 150 or similar
Centrifuge for microcentrifuge tubes	Eppendorf	5418 or similar
Confocal Microscope	Zeiss	LSM 710 or equivalent
Coverslips	Thermo	25CIR-1 or similar
DMEM-F12, Liquid, High Glucose, +HEPES, L-glutamine, +Phenol red	Thermo	11330107
EGF (Epidermal Growth Factor)	Sigma Aldrich	11376454001
Fluorescently Labeled Laminin	Cytoskeleton Inc	LMN02
Gentamicin	VWR	VWRV0304-10G
Glutaraldehyde	Sigma Aldrich	G5882
HCl	Sigma Aldrich	320331 or similar
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888-5G
Insulin	Sigma Aldrich	16634-50mg
MepG Dystroglycan Knockout Cells	LBNL	N/A
NaOH	Sigma Aldrich	S8045 or similar
Normocin	Invivogen	ant-nr-1
Osmium Tetroxide	Sigma Aldrich	75633
Ovine Prolactin	Los Angeles Biomedical Research Institute	Ovine Pituitary Prolactin
Phalloidin	Thermo	A22287
Phosphate Buffered Saline	Thermo	10010023 or similar
Purified Laminin-111	Sigma Aldrich	L2020-1MG
Recombinant human Nidogen-1, carrier free	R&D systems	2570-ND-050
Sodium Acetate	Sigma Aldrich	S2889 or similar
Sodium Cacodylate	Sigma Aldrich	C0250
Sterile filters	Millipore	SLGP033RS or similar
Tris	Sigma Aldrich	252859 or similar
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Ultra-low protein binding tubes	VWR	76322-516, 76322-522 or similar
Ultrapure water	Thermo	15230253 or similar