JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول نظامًا ديناميكيًا لثقافة إنتاج مجاميع حجم متحكم فيها للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات وزيادة تحفيز التمايز في الأعضاء الدماغية في ظل ظروف محددة كيميائيًا وخالية من التغذية باستخدام مفاعل حيوي أحادي الاستخدام.

Abstract

المخيخ يلعب دورا حاسما في الحفاظ على التوازن والتنسيق الحركي, وخلل وظيفي في الخلايا العصبية المخية المختلفة يمكن أن تؤدي إلى خلل cerebellar. معظم المعرفة الحالية حول الأنماط الظاهرية العصبية المرتبطة بالأمراض تستند إلى أنسجة ما بعد الوفاة ، مما يجعل فهم تطور المرض وتطوره صعبًا. كما استخدمت النماذج الحيوانية وخطوط الخلايا الخالدة كنماذج للاضطرابات العصبية. ومع ذلك ، فإنها لا تُكَلِم تماماً بمرض الإنسان. لدى الخلايا الجذعية المتعددة القدرات التي يسببها الإنسان إمكانات كبيرة في نمذجة الأمراض وتوفر مصدراً قيماً للنُهج التجديدية. في السنوات الأخيرة، جيل organoids الدماغي من iPSCs المستمدة من المريض تحسين آفاق النمذجة الأمراض العصبية. ومع ذلك، لا توجد بروتوكولات تنتج أعداداً كبيرة من الأعضاء وغلة عالية من الخلايا العصبية الناضجة في أنظمة الثقافة ثلاثية الأبعاد. البروتوكول المقدم هو نهج جديد لتوليد قابلة للتكرار وقابلة للتطوير من الأجهزة العضوية المشتقة من iPSC البشرية في ظل ظروف محددة كيميائيا باستخدام المفاعلات الحيوية القابلة للتطوير للاستخدام الواحد ، والتي تكتسب فيها الأجهزة هوية cerebellar. وتتميز organoids ولدت من خلال التعبير عن علامات محددة على حد سواء مرنا ومستوى البروتين. تحليل مجموعات محددة من البروتينات يسمح بالكشف عن مختلف مجموعات الخلايا المخية، التي توطين مهم لتقييم بنية organoid. يستخدم البكتات العضية والمزيد من الكبت المناعي لشرائح الأعضاء لتقييم وجود مجموعات محددة من خلايا المخيخ وتنظيمها المكاني.

Introduction

يمثل ظهور الخلايا الجذعية البشرية المتعددة القدرات (PSCs) أداة ممتازة للطب التجديدي وطراز الأمراض ، لأن هذه الخلايا يمكن أن تختلف في معظم أنساب الخلايا في جسم الإنسان1،2. منذ اكتشافها، PSC التمايز باستخدام نهج متنوعة وقد أفيد عن نموذج الأمراض المختلفة، بما في ذلك الاضطرابات العصبية3،4،5،6.

وفي الآونة الأخيرة، وردت تقارير عن ثقافات ثلاثية الأبعاد مستمدة من الهياكل الدماغية البشرية التي تشبه الهياكل الدماغية البشرية؛ وتسمى هذه organoids الدماغ3،7،8. ويتيح توليد هذه الهياكل من كل من اللجان الصحية الصحية الصحية الصحية والصحية الخاصة بالمريض فرصة قيّمة لوضع نماذج للتنمية البشرية والاضطرابات العصبية النمائية. ومع ذلك، من الصعب تطبيق الأساليب المستخدمة لتوليد هذه الهياكل الدماغية منظمة تنظيما جيدا لإنتاجها على نطاق واسع. لإنتاج الهياكل التي هي كبيرة بما يكفي لتكليل تكوين الأنسجة دون نخر داخل العضوية، بروتوكولات تعتمد على الالتزام العصبي الأولي في ظروف ثابتة، تليها التغليف في الهيدروجيل والثقافة اللاحقة في النظم الديناميكية3. غير أن هذه النهوج قد تحد من إمكانية زيادة الإنتاج العضوي. على الرغم من الجهود التي بذلت لتوجيه التمايز PSC لمناطق محددة من الجهاز العصبي المركزي, بما في ذلك القشرية, سترياتال, منتصف القرنين, والخلايا العصبية الحبل الشوكي9,,10,,11,12, لا يزال يشكل تحدياً توليد مناطق معينة في الدماغ في ظروف ديناميكية. على وجه الخصوص, جيل الخلايا العصبية cerebellar ناضجة في هياكل 3D لم يتم وصفها بعد. موغوروما وآخرون رائدة في توليد الظروف الثقافية التي تُستخيخ تطور المخ القريب المبكر13، وأبلغ مؤخراً عن بروتوكول يسمح للخلايا الجذعية الجنينية البشرية بتوليد بنية مستقطبة تذكرنا بأول يخسم المخيخ7في الثلث الأول من الحمل . ومع ذلك، فإن نضوج الخلايا العصبية cerebellar في الدراسات المبلغ عنها يتطلب تفكك organoids، وفرز السلف cerebellar، وزراعة نقّة مع الخلايا المغذية في نظام ثقافة أحادية الطبقة7،14،15،16. ولذلك، فإن الجيل القابل للتكرار من الأعضاء cerebellar المطلوبة للأمراض النمذجة في ظل ظروف محددة لا يزال تحديا المرتبطة الثقافة وتغذية من مصادر التغير.

يقدم هذا البروتوكول ظروف الثقافة المثلى للتوسع ثلاثي الأبعاد والتمايز الفعال للأجهزة الخاصة بشرية في الخلايا العصبية cerebellar باستخدام المفاعلات الحيوية ذات العجلات الرأسية ذات الاستخدام الواحد (انظر جدول المواد للمواصفات)، وتسمى فيما يلي المفاعلات الحيوية. وقد تم تجهيز bioreactors مع المكره الرأسي الكبير، والتي في تركيبة مع أسفل على شكل حرف U، وتوفير توزيع القص أكثر تجانسا داخل السفينة، والسماح لطيف، خلط موحد وتعليق الجسيمات مع انخفاض سرعات الانفعالات17. مع هذا النظام، يمكن الحصول على مجاميع الخلايا التي تسيطر عليها الشكل والحجم، وهو أمر مهم لتمايز أكثر تجانسا وكفاءة. وعلاوة على ذلك، يمكن توليد عدد أكبر من الأعضاء المشتقة من iPSC بطريقة أقل جاهدية.

السمة الرئيسية للعضوية، والتي هي هياكل متعددة الخلايا 3D التي تتشكل عادة من الخلايا الجذعية، هو التنظيم الذاتي لأنواع الخلايا المختلفة التي تشكل أشكال محددة مثل تلك التي ينظر إليها في morphogenesis الإنسان18،19،20. ولذلك، مورفولوجيا الجهاز هو معيار مهم لتقييمها أثناء عملية التفريق. والتبريد من organoids والمزيد من المناعة من شرائح organoid مع مجموعة محددة من الأجسام المضادة تسمح للتصور المكاني للعلامات الجزيئية لتحليل انتشار الخلايا ، والتمايز ، والهوية السكانية الخلية ، و المبرمج. مع هذا البروتوكول ، عن طريق الكبتات العضية التي تحتوي على المناعة ، لوحظ التزام عصبي أولي فعال من قبلاليوم السابع للتمايز. أثناء التمايز، لوحظ عدد من مجموعات الخلايا ذات الهوية الدماغية. بعد 35 يوما في هذا النظام الديناميكي، وsyepithelium cerebellar ينظم على طول محور picobasal، مع طبقة apical من السلفاروس المتكاثرة والخلايا العصبية ما بعد الحركة. خلال عملية النضج، من أيام 35-90 من التمايز، يمكن رؤية أنواع متميزة من الخلايا العصبية cerebellar، بما في ذلك خلايا بوركينجي (كالبيندين+)، الخلايا الحبيبية (PAX6+/ MAP2+) ، خلايا غولجي (Neurogranin+) ، خلايا فرشاة أحادي القطب (TBR2+) ، والخلايا العصبية العميقة الإسقاط النوية cerebellar (TBR1+). أيضا، لوحظت كمية غير مُهَمِّة من موت الخلايا في الأعضاء المُنشأة في المخيخ بعد 90 يوماً في الثقافة.

في هذا النظام، تنضج الأجهزة المشتقة من iPSC البشرية إلى خلايا عصبية مختلفة من المخيخ والبقاء على قيد الحياة لمدة تصل إلى 3 أشهر دون الحاجة إلى الانفصام وتربية الحيوانات المغذية، مما يوفر مصدرًا للخلايا العصبية الدماغية البشرية لنم نمستر المرض.

Protocol

1. Passaging وصيانة iPSCs الإنسان في ثقافة أحادية الطبقات

  1. إعداد اللوحات
    1. ذوبان مصفوفة غشاء الطابق السفلي (انظر جدول المواد)المخزون في 4 درجة مئوية وإعداد 60 ميكرولتر aliquots. تجميد aliquots في -20 درجة مئوية.
    2. لمعطف آبار لوحة 6 بئر، ذوبان aliquot واحد من مصفوفة غشاء الطابق السفلي على الجليد. مرة واحدة إذابة إضافة 60 μL إلى 6 مل من DMEM-F12. إعادة بناء بلطف عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا.
    3. إضافة 1 مل من مصفوفة غشاء الطابق السفلي المخفف حل لكل بئر من 6 لوحة جيدا واحتضان في RT لمدة 1 ساعة على الأقل قبل passaging أو تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 أسبوع.
  2. تمرير مستعمرات iPSC مع EDTA
    1. الحفاظ على iPSCs في ثقافة أحادية الطبقات في 6 لوحات جيدا في الحاضنة في 37 درجة مئوية، رطوبة 95٪ و 5٪ CO2.
      ملاحظة: في هذا البروتوكول، تم استخدام ثلاثة خطوط iPSC الإنسان متميزة: F002.1A.1321، خط iPSC episomal الإنسان (iPSC6.2)22، وحصل تجاريا iPS-DF6-9-9-9T.B (انظر جدول المواد).
    2. قبل passaging، احتضان اللوحات المخزنة (الخطوة 1.1) في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 15 دقيقة وإعداد mTesR1 المتوسطة(الجدول 1).
    3. التعرق الحل من لوحة باستخدام ماصة المصلية وعلى الفور إضافة 0.5 مل من mTeSR1 المتوسطة لكل بئر.
    4. التعرق المتوسط المستهلك من البئر الذي يحتوي على iPSCs وغسل مرة واحدة باستخدام 1 مل من 0.5 mM EDTA في البئر.
    5. أضف 1 مل من 0.5 mM EDTA إلى كل بئر واحتضان في RT لمدة 5 دقائق.
    6. EDTA التعرق وإزالة الخلايا من الآبار عن طريق إضافة بلطف mTeSR1 المتوسطة و pipetting المستعمرات باستخدام p1000 micropipette. جمع الخلايا في أنبوب مخروطي.
      ملاحظة: لا خلايا الماصات صعودا وهبوطا أكثر من 3x.
    7. إضافة 1 مل من تعليق الخلية (المخفف 1:4) إلى كل بئر بحيث يحتوي كل بئر 1.5 مل من المتوسط بعد إضافة تعليق الخلية. إعادة الخلايا إلى الحاضنة في 5٪ CO2، 37 درجة مئوية.
    8. استبدال المتوسط الذي يقضيه يوميا والمرور كل 3 أيام عندما يتحقق التقاء 75٪-80٪.

2- بذرات مراكز iPSCs البشرية في المُتَفَدِر البيولوجي

  1. iPSCs احتضان نمت كما monolayers في mTeSR1 تكملها 10 μM من المانع روك Y-27632 (ROCKi). إضافة 1 مل من المتوسطة المكملة لكل بئر من 6 بئر لوحة الأنسجة وحضن لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية، رطوبة 95٪ ، و 5٪ CO2.
    ملاحظة: يستخدم ROCKi لحماية iPSCs منفصلة من المبرمج23.
  2. بعد 1 ح من الحضانة، التعرق المتوسطة المستهلكة من كل بئر وغسل 1x مع 1 مل من 1× برنامج تلفزيوني في البئر.
  3. إضافة 1 مل من المتوسطة مفرزة الخلية (انظر جدول المواد)إلى كل بئر من 6 بئر لوحة واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 7 دقائق حتى الخلايا تنفصل بسهولة عن الآبار مع اهتزاز لطيف.
  4. الماصات الخلية مفرزة المتوسطة صعودا وهبوطا مع p1000 micropipette حتى الخلايا فصل وانفصال في خلايا واحدة. إضافة 2 مل من خلية كاملة ثقافة المتوسطة لكل بئر إلى تعطيل الهضم الأنزيمي والميصة الخلايا بلطف في أنبوب مخروطي معقمة.
  5. جهاز طرد مركزي في 210 × ز لمدة 3 دقائق وإزالة فائقة.
  6. Resuspend بيليه الخلية في المتوسطة الثقافة (أي mTeSR1 تكملها 10 μM من ROCKi) وعد iPSCs مع قياس الهيموسيت باستخدام الصبغة الزرقاء trypan.
  7. البذور 15 × 106 خلايا مفردة في مفاعل حيوي (الحد الأقصى لحجم 100 مل) مع 60 مل من mTeSR1 تكملها 10 ميكرومتر من ROCKi في كثافة الخلايا النهائية من 250،000 الخلايا / مل.
  8. أدخل الوعاء الذي يحتوي على وحدات iPSCs في وحدة القاعدة العالمية الموضوعة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية، ورطوبة 95٪، و 5٪ CO2.
    ملاحظة: يتم الاحتفاظ بتحريك المُثيرات الحيوية لمدة 24 ساعة عن طريق تعيين التحكم الشامل في وحدة الأساس إلى 27 دورة في الدقيقة لتعزيز تجميع iPSC.

3- التمايز ونضج المجاميع المشتقة من iPSC البشرية في الأعضاء الدماغية

  1. تعريف يوم بذر الخلية المفردة كـ يوم 0.
  2. في اليوم الأول، جمع 1 مل من المجاميع iPSC عينة باستخدام ماصات المصلية. الحفاظ على مفاعل حيوي تحت الانفعالات كما كان من قبل عن طريق وضع وحدة قاعدة عالمية مع مفاعل حيوي يحتوي على المجاميع في تدفق معقمة قبل جمع العينة. لوحة تعليق الخلية في مرفق منخفضة جدا 24 لوحة جيدا. تحقق من تكوين المجاميع المشتقة من iPSC.
  3. الحصول على الصور مع المجهر البصري باستخدام التكبير الكلي من 40x أو 100x لقياس القطر الكلي.
  4. قياس مساحة المجاميع في كل صورة باستخدام برنامج فيجي.
    1. اختر "تحليل | تعيين القياسات" من شريط القوائم وانقر على "المنطقة" و "موافق".
    2. اختر "ملف | فتح" من شريط القوائم لفتح ملف صورة مخزنة. حدد أداة تحديد الخط المعروضة في شريط الأدوات وقم بإنشاء خط مستقيم فوق شريط المقياس المعروض في الصورة. اختر "تحليل | تعيين مقياس" من شريط القوائم.
    3. في "مسافة معروفة"إضافة فسحة شريط مقياس الصورة في μm. تعريف"وحدة الطول"كما μm. انقر على "العالمية" للحفاظ على الإعدادات و "موافق". حدد التحديد البيضاوي في شريط الأدوات.
    4. لكل تجميع رسم المنطقة مع الأداة البيضاوية. اختر "تحليل | قياس". حساب قطرها على أساس المساحة المقاسة، مع الأخذ في الاعتبار أن المجاميع هي تقريبا كروية باستخدام
      figure-protocol-5203
      مع A كمساحة من المجموع.
  5. عندما يكون متوسط قطر المجاميع 100 ميكرومتر، استبدل 80٪ من المتوسط المستهلك بmTeSR1 الطازجة بدون ROCKi. عندما تصل المجاميع 200-250 ميكرومتر في القطر، استبدال جميع المتوسط المستهلك مع gfCDM(الجدول 1)، والسماح للعضية تستقر في الجزء السفلي من مفاعل حيوي.
    ملاحظة: إذا تجاوز متوسط القطر الإجمالي 350 ميكرومتر لا تبدأ بروتوكول التمايز. كرر البذر من الخلايا المفردة. عموما، يستغرق حوالي 1 يوم لمجموع للوصول إلى متوسط قطرها 100 ميكرومتر.
  6. إدراج مفاعل حيوي يحتوي على المجاميع في وحدة قاعدة عالمية وضعت في الحاضنة في 37 درجة مئوية، رطوبة 95٪ و 5٪ CO2.
  7. تقليل التحريض على مفاعل حيوي إلى 25 دورة في الدقيقة.
  8. في اليوم الثاني، كرر الخطوات 3.2 و3.3 و3.4 لتقييم القطر الإجمالي. إضافة 30 ميكرولتر من FGF2 (التركيز النهائي، 50 نانوغرام/مل) و60 ميكرولتر من SB431542 (التركيز النهائي، 10 ميكرومتر) إلى 60 مل من gfCDM تمايز المتوسطة(الجدول 1). استبدال كل المتوسط المستهلك من مفاعل حيوي مع gfCDM المكملة. كرر الخطوة 3.6.
    ملاحظة: SB431542 أمر بالغ الأهمية لمنع التمايز الميندوديرم، مما يحفز التمايز العصبي24. FGF2 يستخدم لتعزيز الإبادة الجماعية للأنسجة العصبية25.
  9. في اليوم الخامس، كرر الخطوات 3.2 و3.3 و3.4 و3.8.
    ملاحظة: يجب زيادة الحجم الإجمالي أثناء بروتوكول التمييز. ومع ذلك، فإن القطر لا يكون إلا حرجة عندما يبدأ التمايز، لأن هذه المعلمة يمكن أن تؤثر على فعالية التمايز.
  10. في اليوم 7، كرر الخطوات 3.2 و3.3 و3.4. تخفيف FGF2 و SB431542 إلى 2/3: إضافة 20 ميكرولتر FGF2 و 40 ميكرولتر من SB431542 إلى 60 مل من gfCDM تمايز المتوسطة. استبدال جميع المتوسطات المستهلكة من مفاعل حيوي مع gfCDM المكملة. كرر الخطوة 3.6 وزيادة التحريض على مفاعل حيوي إلى 30 دورة في الدقيقة.
  11. في يوم 14 كرر الخطوات 3.2 و 3.3 و 3.4. إضافة 60 ميكرولتر من FGF19 (التركيز النهائي، 100 نانوغرام/مل) إلى 60 مل من gfCDM تمايز المتوسطة. استبدال كل المتوسطة المستهلكة من مفاعل حيوي مع gfCDM تستكمل مع FGF19. كرر الخطوة 3.6.
    ملاحظة: FGF19 يستخدم لتعزيز الاستقطاب من هياكل منتصف hindbrain26.
  12. في اليوم 18، كرر الخطوات 3.2 و3.3 و3.4 و3.11.
  13. في يوم 21 كرر الخطوات 3.2 و 3.3 و 3.4. استبدال كل المتوسط المستهلك من مفاعل حيوي مع المتوسطة اصبية كاملة(الجدول 1). كرر الخطوة 3.6.
    ملاحظة: Neurobasal المتوسطة هي وسيلة القاعدية المستخدمة للحفاظ على الخلايا العصبية في داخل الجهاز7.
  14. في يوم 28 كرر الخطوات 3.2 و 3.3 و 3.4. إضافة 180 ميكرولتر من SDF1 (التركيز النهائي، 300 نانوغرام/مل) إلى 60 مل من الوسط العصبي الكامل. استبدال جميع المتوسطة المستهلكة من مفاعل حيوي مع المتوسطة والأعصاب كاملة تستكمل مع SDF1. كرر الخطوة 3.6.
    ملاحظة: يستخدم SDF1 لتسهيل تنظيم طبقات الخلايا المتميزة27.
  15. في يوم 35 كرر الخطوات 3.2 و 3.3 و 3.4. استبدال كل المتوسط المستهلك من مفاعل حيوي مع كامل BrainPhys المتوسطة(الجدول 1). كرر الخطوة 3.6.
    ملاحظة: BrainPhys هو وسط الخلايا العصبية التي تدعم الخلايا العصبية النشطة متشابك28.
  16. استبدال 1/3 من الحجم الكلي كل 3 أيام مع كامل BrainPhys المتوسطة حتى اليوم 90 من التمايز.

4. إعداد العضيات للكبري والكيمياء المناعية

  1. جمع العضيات للمناعة
    1. جمع 1 مل من عينة من متوسطة تحتوي على organoids مع ماصة المصلية من مفاعل حيوي إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
      ملاحظة: ينبغي جمع العضيات العضوية في نقاط زمنية مختلفة لتقييم فعالية التمايز، بما في ذلك الأيام 7 و14 و21 و35 و56 و70 و80 و90.
    2. إزالة افرا وغسل مرة واحدة مع 1 مل من 1× برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: لا الطرد المركزي الأجهزة. دع الأعضاء تستقر في قاع الأنبوب عن طريق الجاذبية.
    3. إزالة فائقة وإضافة 1 مل من 4٪ شبهformaldehyde (PFA). احتضان في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. إزالة PFA المستهلكة وإضافة 1 مل من 1× برنامج تلفزيوني.
    4. تخزين organoids في 1 مل من 1× برنامج تلفزيوني في 4 درجة مئوية حتى معالجة للتبريد.
      ملاحظة: تخزين organoids في برنامج تلفزيوني 1X لمدة لا تزيد عن 1 أسبوع بعد التثبيت.
  2. إعداد العضيات للتبريد
    1. إزالة افرا من organoids المخزنة. إضافة 1 مل من 15٪ السكروز (ث / الخامس، المخفف في 1× برنامج تلفزيوني)، مزيج جيد عن طريق دوامة لطيف، واحتضان بين عشية وضحاها في 4 °C.
    2. إعداد حل من 15٪ السكروز/7.5٪ الجيلاتين(الجدول 2)والحفاظ على 37 درجة مئوية أثناء التحضير لتجنب الجيلاتين لترسيخ.
    3. إزالة محلول السكروز 15٪ ، إضافة 1 مل من 15 ٪ سكروز / 7.5 ٪ الجيلاتين إلى organoids ، ومزيج بسرعة عن طريق دوامة لطيف. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    4. إضافة 15% السكروز/7.5% حل الجيلاتين إلى حاوية بلاستيكية تصل إلى نصف حجمها. انتظر التصلب في RT.
    5. بعد حضانة 1 ساعة، ضع بعناية قطرة السكروز/الجيلاتين التي تحتوي على العضيات على الجيلاتين المتوطد مع ماصة باستور. اترك لترسخ في RT لمدة 15 دقيقة. تأكد من تجنب تشكيل فقاعة.
    6. مكان 15٪ السكروز/7.5٪ الجيلاتين على رأس organoids حتى يتم تعبئة الحاوية. انتظر حتى التوطد الكامل في RT.
    7. بعد التصلب، احتضان 20 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    8. قطع الجيلاتين إلى مكعب يحتوي على organoids في المركز وإصلاح مكعب الجيلاتين على قطعة من الورق المقوى مع قطرة من مركب O.C.T.
    9. ضع 250 مل من الليسبنتان في كوب 500 مل وملء حاوية مناسبة مع النيتروجين السائل. باستخدام ملقط وقفازات سميكة، ضع بعناية الكأس التي تحتوي على ال isopentane على سطح النيتروجين السائل وتبريد ال isopentane إلى -80 درجة مئوية.
    10. عندما يتم الوصول إلى -80 درجة مئوية، ضع مكعب الجيلاتين في الكوب الذي يحتوي على اليسوبنتان حتى يتجمد، مع الحفاظ على درجة الحرارة عند -80 درجة مئوية. اعتمادا على حجم المكعب، قد يستغرق 1-2 دقيقة.
      ملاحظة: تجنب درجات الحرارة أقل من -80 درجة مئوية أو الإفراط في تجميد الوقت، لأنه قد يسبب تكسير المكعب.
    11. عندما المجمدة، بسرعة تخزين مكعب الجيلاتين في -80 درجة مئوية وتخزينها حتى التبريد.
  3. اباكات من العضيات
    1. قم بتشغيل التبريد وحدد كلاً من العينة (OT) ودرجات حرارة cryochamber (CT) عند -25 درجة مئوية.
    2. عندما تستقر كلتا درجات الحرارة، قم بإصلاح مكعب الجيلاتين الذي يحتوي على الأعضاء على العينة باستخدام مركب O.C.T.
    3. تحديد سمك القسم عند 12 ميكرومتر.
    4. قطع المكعب وجمع 3-4 شرائح على شرائح المجهر التصاق (انظر جدول المواد).
    5. يُخزن عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  4. مناعة شرائح الأعضاء
    1. ضع شرائح المجهر التي تحتوي على أقسام أعضاءية في جرة القذف مع 50 مل من PBS 1x مسبقًا ، وعقد ما يصل إلى 10 شرائح من الخلف إلى الخلف.
      ملاحظة: يجب أن تكون جميع الأجزاء العضوية مغمورة بالسائل.
    2. احتضان لمدة 45 دقيقة في 37 درجة مئوية ل degelatinize الشرائح.
    3. غسل 1x مع 50 مل من 1× برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في RT: نقل الشرائح إلى جرة القذف التي تحتوي على 1× برنامج تلفزيوني جديد.
    4. نقل الشرائح إلى جرة القذف التي تحتوي على 50 مل من الجليسين الطازجة(الجدول 2)واحتضان لمدة 10 دقيقة في RT.
    5. نقل الشرائح إلى جرة القذف التي تحتوي على 50 مل من 0.1٪ تريتون(الجدول 2)و permeabilize لمدة 10 دقيقة في RT.
    6. غسل مع 1× برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق 2x.
    7. إعداد طبق مناعة مع ورقة 3 مم غارقة في 1× برنامج تلفزيوني. الشرائح الجافة مع نسيج في جميع أنحاء شرائح ووضعها على ورقة 3 ملم. مع ماصة باستور، تغطية السطح كله من الشرائح مع حل حظر(الجدول 2)مع ~ 0.5 مل لكل شريحة. احتضان لمدة 30 دقيقة في RT.
    8. إزالة حل حظر الزائدة وتجفيف الشرائح مع الأنسجة في جميع أنحاء شرائح. مكان 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية (الجدول 3) المخفف في محلول الحجب على الأقسام والغطاء مع الأغطية. ضع الشرائح في طبق مناعي تم إعداده مسبقًا. احتضان ليلة وضحاها في 4 °C.
    9. نقل الشرائح إلى جرة القذف مع 50 مل من TBST(الجدول 2)،والسماح للأغطية تقع، وغسل مع TBST لمدة 5 دقائق 3x.
    10. ضع 50 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المخفف في محلول الحجب على الأقسام واغطيه بالأغطية. ضع الشرائح في طبق المناعة المعد مسبقًا. احتضان لمدة 30 دقيقة في RT، محمية من الضوء.
    11. نقل الشرائح إلى جرة copling مرة أخرى وغسل مع 50 مل من TBST لمدة 5 دقائق 3x.
    12. جفف الشرائح بمنسجة حول الشرائح ووضع الشرائح في طبق مناعي تم إعداده مسبقًا. أضف 0.5 مل من محلول DAPI على السطح الكامل للشرائح مع ماصة باستور. احتضان لمدة 5 دقائق في RT.
    13. كرر الخطوة 4.4.9.
    14. جفف الشرائح بعناية مع نسيج. إضافة 50 μL من تصاعد متوسطة قطرة قطرة على طول الشريحة ومن ثم خفض بعناية غطاء على كل شريحة، والانحناء قليلا لتجنب فقاعات.

النتائج

وقد بدأ البروتوكول عن طريق تعزيز تجميع الخلايا باستخدام 0.1 لتر المفاعلات الحيوية (الشكل 1A). تم إجراء التلقيح في الخلايا المفردة من iPSCs ، مع 250،000 خلية / مل بذر في 60 مل من المتوسط مع سرعة الانفعالات من 27 دورة في الدقيقة. تم تعريف هذا اليوم 0. بعد 24 ح، شكلت الخلايا بكفاءة المجاميع ع...

Discussion

وقد أدت الحاجة إلى أعداد كبيرة من الخلايا وكذلك الظروف الثقافية المحددة لتوليد أنواع محددة من الخلايا لفحص الأدوية وتطبيقات الطب التجديدي إلى تطوير نظم ثقافة قابلة للتطوير. في السنوات الأخيرة, وقد أبلغت عدة مجموعات جيل قابلة للتطوير من السلف العصبية والخلايا العصبية الوظيفية32<...

Disclosures

المؤلفين YH وSJ هم من موظفي برنامج تلفزيوني للتكنولوجيا الحيوية. الكاتب BL هو الرئيس التنفيذي والمؤسس المشارك لشركة PBS Biotech ، وشركة شارك هؤلاء المؤلفون المتعاونون في تطوير المفاعلات الحيوية المستخدمة في المخطوطة. وهذا لا يغير من التزام المؤلفين بجميع سياسات المجلة بشأن تبادل البيانات والمواد. ويعلن جميع المؤلفين الآخرين عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)، البرتغال (UIDB/04565/2020 من خلال Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Project N. 007317, PD/BD/105773/2014 إلى T.P.S و PD/BD/128376/2017 إلى D.E.S.N.)، وهي مشاريع يشارك في تمويلها فيدر (POR Lisboa 2020-Programa Operacional Regional de Lisboa PORTUGAL 2020) وFCT من خلال منحة PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 وCEREBEX جيل من Organoids Cerebellar للأبحاث Ataxia منحة لشبونة-01-0145-فيدر-029298. كما تم تلقي التمويل من برنامج الاتحاد الأوروبي للبحوث والابتكار في أفق 2020، تحت رقم اتفاقية المنح 739572 - مركز الاكتشافات للطب التجديدي والدقة H2020-واسع الانتشار-01-2016-2017.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
3MM paperWHA3030861Merck
AccutaseA6964 - 500mLSigmacell detachment medium
Anti-BARHL1 AntibodyHPA004809Atlas Antibodies
Anti-Calbindin D-28k AntibodyCB28Millipore
Anti-MAP2 AntibodyM4403Sigma
Anti-N-Cadherin Antibody610921BD Transduction
Anti-NESTIN AntibodyMAB1259-SPR&D
Anti-OLIG2 AntibodyMABN50Millipore
Anti-PAX6 AntibodyPRB-278PCovance
Anti-SOX2 AntibodyMAB2018R&D
Anti-TBR1 AntibodyAB2261Millipore
Anti-TBR2 Antibodyab183991Abcam
Anti-TUJ1 Antibody801213Biolegend
Apo-transferrinT1147Sigma
BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM1 Kit5793 - 500mLStem cell tecnhnologies
Chemically defined lipid concentrate11905031ThermoFisher
Coverslips 24x60mm631-1575VWR
Crystallization-purified BSA5470Sigma
DAPI10236276001Sigma
Dibutyryl cAMPSC- 201567B -500mgFrilabo
DMEM-F1232500-035ThermoFisher
Fetal bovine serumA3840001ThermoFisher
Gelatin from bovine skinG9391Sigma
Glass Copling JarE94ThermoFisher
Glutamax I10566-016ThermoFisher
GlycineMB014001NZYtech
Ham’s F1221765029ThermoFisher
Human Episomal iPSC LineA18945ThermoFisheriPSC6.2
IMDM12440046ThermoFisher
Insulin91077CSigma
iPS DF6-9-9T.BWiCell
Iso-pentanePHR1661-2MLSigma
L-Ascorbic acidA-92902Sigma
Matrigel354230Corningbasement membrane matrix
MonothioglycerolM6154Sigma
Mowiol475904Milliporemounting medium
mTeSR185850 -500mlStem cell technologies
N2 supplement17502048ThermoFisher
Neurobasal12348017ThermoFisher
Paraformaldehyde158127Sigma
PBS-0.1 Single-Use VesselSKU: IA-0.1-D-001PBS Biotech
PBS-MINI MagDrive Base UnitSKU: IA-UNI-B-501PBS Biotech
Recombinant human BDNF450-02Peprotech
Recombinant human bFGF/FGF2100-18BPeprotech
Recombinant human FGF19100-32Peprotech
Recombinant human GDNF450-10Peprotech
Recombinant human SDF1300-28APeprotech
ROCK inhibitor Y-2763272302Stem cell technologies
SB431542S4317Sigma
SucroseS7903Sigma
SuperFrost Microscope slides12372098ThermoFisheradhesion microscope slides
Tissue-Tek O.C.T. Compound25608-930VWR
Tris-HCL 1MT3038-1LSigma
Triton X-1009002-93-1Sigma
Tween-20P1379Sigma
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.015575020ThermoFisher

References

  1. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Thomson, J. A. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  3. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  4. Ishida, Y., et al. Vulnerability of Purkinje Cells Generated from Spinocerebellar Ataxia Type 6 Patient-Derived iPSCs. Cell Reports. 17 (6), 1482-1490 (2016).
  5. Liu, Y., Zhang, S. C. Human stem cells as a model of motoneuron development and diseases. Annals of the New York Academy of Sciences. 1198, 192-200 (2010).
  6. Mariani, J., Coppola, G., Pelphrey, K. A., Howe, J. R., Vaccarino, F. M. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/ Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162 (2), 375-390 (2015).
  7. Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-Organization of Polarized Cerebellar Tissue in 3D Culture of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
  8. Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
  9. Aubry, L., et al. Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (43), 16707-16712 (2008).
  10. Gunhanlar, N., et al. A simplified protocol for differentiation of electrophysiologically mature neuronal networks from human induced pluripotent stem cells. Molecular Psychiatry. 23 (5), 1336-1344 (2018).
  11. Hu, B. Y., Zhang, S. C. Differentiation of spinal motor neurons from pluripotent human stem cells. Nature Protocols. 4 (9), 1295-1304 (2009).
  12. Jo, J., et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
  13. Muguruma, K., et al. Ontogeny-recapitulating generation and tissue integration of ES cell-derived Purkinje cells. Nature Neurosciences. 13 (10), 1171-1180 (2010).
  14. Watson, L. M., Wong, M. M. K., Vowles, J., Cowley, S. A., Becker, E. B. E. A Simplified Method for Generating Purkinje Cells from Human-Induced Pluripotent Stem Cells. The Cerebellum. 17 (4), 419-427 (2018).
  15. Wang, S., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons. Science Reports. 5, 9232 (2015).
  16. Tao, O., et al. Efficient generation of mature cerebellar Purkinje cells from mouse embryonic stem cells. Journal of Neuroscience Research. 88 (2), 234-247 (2010).
  17. Croughan, M. S., Giroux, D., Fang, D., Lee, B. Novel Single-Use Bioreactors for Scale-Up of Anchorage-Dependent Cell Manufacturing for Cell Therapies. Stem Cell Manufacturing. , 105-139 (2016).
  18. Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144 (6), 976-985 (2017).
  19. Lou, Y. R., Leung, A. W. Next generation organoids for biomedical research and applications. Biotechnology Advances. 36 (1), 132-149 (2018).
  20. Silva, T. P., et al. Design Principles for Pluripotent Stem Cell-Derived Organoid Engineering. Stem Cells International. 2019, 1-17 (2019).
  21. Silva, T. P., et al. Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture. Frontiers of Bioengineering and Biotechnology. , (2020).
  22. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6 (4), 18293 (2011).
  23. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  24. Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).
  25. Yaguchi, Y., et al. Fibroblast growth factor (FGF) gene expression in the developing cerebellum suggests multiple roles for FGF signaling during cerebellar morphogenesis and development. Developmental Dynamics. 238 (8), 2058-2072 (2008).
  26. Fischer, T., et al. Fgf15-mediated control of neurogenic and proneural gene expression regulates dorsal midbrain neurogenesis. Developmental Biology. 350 (2), 496-510 (2011).
  27. Bagri, A., et al. The chemokine SDF1 regulates migration of dentate granule cells. Development. 129 (18), 4249-4260 (2002).
  28. Bardy, C., et al. Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (20), 2725-2734 (2015).
  29. Bauwens, C. L., et al. Control of Human Embryonic Stem Cell Colony and Aggregate Size Heterogeneity Influences Differentiation Trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
  30. Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).
  31. Miranda, C. C., et al. Spatial and temporal control of cell aggregation efficiently directs human pluripotent stem cells towards neural commitment. Biotechnology Journal. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  32. Miranda, C. C., Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. Scaling up a chemically-defined aggregate-based suspension culture system for neural commitment of human pluripotent stem cells. Biotechnology Journal. 11 (12), 1628-1638 (2016).
  33. Bardy, J., et al. Microcarrier Suspension Cultures for High-Density Expansion and Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Neural Progenitor Cells. Tissue Engineering Part C Methods. 19 (2), 166-180 (2013).
  34. Rigamonti, A., et al. Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System. Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).
  35. Arora, N., et al. A process engineering approach to increase organoid yield. Development. 144 (6), 1128-1136 (2017).
  36. Gimeno, L., Martinez, S. Expression of chick Fgf19 and mouse Fgf15 orthologs is regulated in the developing brain by Fgf8 and Shh. Developmental Dynamics. 236 (8), 2285-2297 (2007).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

160

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved