JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, insan pluripotent kök hücrelerinin kontrollü boyut agregaları üretmek ve daha da kimyasal olarak tanımlanmış ve besleyici içermeyen koşullar altında serebellar organoidlerde farklılaşma uyarmak için dinamik bir kültür sistemi açıklar tek kullanımlık biyoreaktör kullanarak.

Özet

Beyincik denge ve motor koordinasyonun korunmasında kritik bir rol oynar ve farklı serebellar nöronlarda fonksiyonel bir defekt serebellar disfonksiyonu tetikleyebilir. Hastalığa bağlı nöronal fenotipler hakkındaki mevcut bilginin çoğu postmortem dokular dayanmaktadır, bu da hastalığın ilerlemesini ve gelişimini zorlaştırır. Hayvan modelleri ve ölümsüzleştirilmiş hücre hatları da nörodejeneratif bozukluklar için model olarak kullanılmıştır. Ancak, onlar tam olarak insan hastalığı özetlemek yok. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPSCs) hastalık modelleme için büyük bir potansiyele sahip ve rejeneratif yaklaşımlar için değerli bir kaynak sağlar. Son yıllarda, hasta kaynaklı iPSCs gelen serebral organoidlerin nesil nörodejeneratif hastalık modelleme için umutları geliştirdi. Ancak, organoidler çok sayıda ve 3D kültür sistemlerinde olgun nöronların yüksek verim üreten protokoller eksiktir. Sunulan protokol, organoidlerin serebeller kimlik elde ettiği ölçeklenebilir tek kullanımlık biyoreaktörler kullanılarak kimyasal olarak tanımlanmış koşullar altında insan iPSC kaynaklı organoidlerin tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir üretimi için yeni bir yaklaşımdır. Oluşturulan organoidler hem mRNA hem de protein düzeyinde spesifik belirteçlerin ekspresyonu ile karakterizedir. Belirli protein gruplarının analizi, lokalizasyonu organoid yapının değerlendirilmesi nde önemli olan farklı serebellar hücre popülasyonlarının saptanmasına olanak sağlar. Organoid kriyoselve organoid dilimlerin daha fazla immünboyama belirli serebellar hücre popülasyonlarının varlığını ve mekansal organizasyonlarını değerlendirmek için kullanılır.

Giriş

İnsan pluripotent kök hücrelerinin ortaya çıkması (PSCs) rejeneratif tıp ve hastalık modelleme için mükemmel bir araç temsil eder, Bu hücrelerin insan vücudunun en hücre soyları içine ayırt edilebilir çünkü1,2. Onların keşfinden bu yana, PSC farklılaşma farklı yaklaşımlar kullanarak farklı hastalıkların model bildirilmiştir, nörodejeneratif bozukluklar da dahil olmak üzere3,4,5,6.

Son zamanlarda, insan serebral yapıları andıran PSCs türetilen 3D kültürlerin raporlar olmuştur; bu beyin organoidlerdenir 3,7,8. Bu yapıların hem sağlıklı hem de hastaya özel SPK'lardan üretimi, insan gelişimi ve nörogelişimsel bozuklukları modellemek için değerli bir fırsat sağlamaktadır. Ancak, bu iyi organize serebral yapılar oluşturmak için kullanılan yöntemler onların büyük ölçekli üretim için uygulamak zordur. Organoidler içinde nekroz olmadan doku morfogenezini özetleyecek kadar büyük yapılar üretmek için protokoller statik koşullarda ilk nöral bağlılığa dayanır, ardından hidrojellerde kapsülleme ve dinamik sistemlerde sonraki kültür3. Ancak, bu tür yaklaşımlar organoid üretimin potansiyel ölçek-up sınırlayabilir. Kortikal, striatal, orta beyin ve omurilik nöronlar9,10,,11,,1012dahil olmak üzere merkezi sinir sisteminin belirli bölgelerine PSC farklılaşma doğrudan psc farklılaşma için yapılmış olsa da, dinamik koşullarda belirli beyin bölgelerinin üretimi hala bir sorundur. Özellikle, 3D yapılarda olgun serebellar nöronların nesil henüz tarif edilmemiştir. Muguruma ve ark. erken serebellar gelişim13 recapitulate kültür koşullarının nesil öncülük ve son zamanlarda insan embriyonik kök hücrelerin in ilk trimester serebellum anımsatan polarize bir yapı oluşturmak için izin veren bir protokol bildirdi7. Ancak, bildirilen çalışmalarda serebellar nöronların olgunlaşmaorganoidlerin ayrışması gerektirir, serebellar atalarının sıralama, ve tek katmanlı kültür sisteminde besleyici hücreleri ile coculture7,14,15,16. Bu nedenle, tanımlanmış koşullar altında hastalık modelleme için istenilen serebellar organoidlerin tekrarlanabilir nesil hala kültür ve besleyici kaynak değişkenliği ile ilişkili bir sorundur.

Bu protokol, tek kullanımlık dikey tekerlek biyoreaktörleri kullanarak 3D genişleme ve insan PsC'lerinin serebellar nöronlara etkin bir şekilde farklılaşması için en uygun kültür koşullarını sunar (spesifikasyonlar için Malzeme Tablosuna bakınız), bundan böyle biyoreaktörler olarak adlandırılır. Biyoreaktörler büyük bir dikey çark ile donatılmıştır, Hangi U-şekilli alt ile birlikte, damar içinde daha homojen bir kesme dağılımı sağlamak, azaltılmış ajitasyon hızları ile nazik sağlayan, düzgün karıştırma ve parçacık süspansiyon17. Bu sistem le daha homojen ve verimli bir farklılaşma için önemli olan şekil ve boyut kontrollü hücre agregaları elde edilebilir. Ayrıca, daha az zahmetli bir şekilde iPSC kaynaklı organoidler daha fazla sayıda oluşturulabilir.

Genellikle kök hücrelerden oluşan 3D çok hücreli yapılar olan organoidlerin ana özelliği, insan morfogenezinde görülenlere benzer şekiller oluşturan farklı hücre tiplerinin kendi kendini organizasyonudur18,19,20. Bu nedenle organoid morfolojisi farklılaşma sürecinde değerlendirilmek üzere önemli bir kriterdir. Organoidlerin kriyoseksiyonu ve organoid dilimlerinin belirli bir antikor seti ile daha fazla immünboyizasyonu, hücre çoğalması, farklılaşma, hücre popülasyon uyruk kimliği ve apoptozu analiz etmek için moleküler belirteçlerin mekansal görselleştirmesine olanak sağlar. Bu protokol ile organoid kriyokesilerin immünboyboya ilefarklılaşmanın 7. Farklılaşma sırasında serebellar kimliğe sahip çeşitli hücre popülasyonları gözlenir. Bu dinamik sistemde 35 gün sonra, serebellar nöroepitel bir apikobazal eksen boyunca organize, çoğalan atalar bir apikal tabaka ve bazal bulunan postmitotik nöronlar. Olgunlaşma sürecinde, gün 35-90 farklılaşma, serebellar nöronların farklı türleri görülebilir, Purkinje hücreleri de dahil olmak üzere (Calbindin+), granül hücreleri (PAX6+/ MAP2+), Golgi hücreleri (Nörogranin+), unipolar fırça hücreleri (TBR2+), ve derin serebellar çekirdekleri projeksiyon nöronlar (TBR1+ ). Ayrıca kültürde 90 gün sonra oluşturulan serebellar organoidlerde önemli miktarda hücre ölümü gözlenmektedir.

Bu sistemde, insan iPSC kaynaklı organoidler farklı serebellar nöronlar içine olgun ve dissociation ve besleyici coculture gerek kalmadan 3 aya kadar hayatta, hastalık modelleme için insan serebellar nöronkaynağı sağlayan.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Tek katmanlı kültürde insan iPSC'lerinin geçişi ve bakımı

  1. Plakaların hazırlanması
    1. 4 °C'de temel membran matrisini (Bkz. Malzeme Tablosu)eritin ve 60°L aliquots hazırlayın. -20 °C'de aliquotları dondurun.
    2. 6 kuyu plakasının kuyularını kaplamak için, bodrum membran matrisinin bir aliquot'unu buz üzerinde eritin. Çözüldükten sonra 6mL'den 6 mL'ye 60°L DMEM-F12 ekleyin. Yavaşça yukarı ve aşağı borular tarafından askıya.
    3. 6 kuyuplakasının her kuyusuna 1 mL seyreltilmiş bazal membran matris çözeltisi ekleyin ve 4 °C'de 1 haftaya kadar saklamadan önce RT'de en az 1 saat kuluçkaya yatırın.
  2. EDTA ile iPSC kolonilerinin geçişi
    1. 37 °C, %95 nem ve %5 CO 2'de kuvözde 6 kuyu plakasında tek katmanlı kültürde iPSC'lerikoruyun.
      NOT: Bu protokolde, üç farklı insan iPSC hattı kullanılmıştır: F002.1A.1321, insan epizomal iPSC hattı (iPSC6.2)22ve ticari olarak elde edilen iPS-DF6-9-9T.B (Bkz. Malzeme Tablosu).
    2. Geçişten önce, depolanan tabakları (adım 1.1) oda sıcaklığında (RT) 15 dakika kuluçkaya yatırın ve mTesR1 ortamını hazırlayın(Tablo 1).
    3. Serolojik bir pipet kullanarak plakadan çözeltiyi aspire edin ve hemen her kuyuya 0,5 mL mTeSR1 orta ekleyin.
    4. Harcanan ortamı kuyuiçeren iPSC'lerden aspire edin ve kuyu başına 0,5 mM EDTA'nın 1 mL'sini kullanarak yıkayın.
    5. Her kuyuya 1 mL 0,5 mM EDTA ekleyin ve 5 dakika boyunca RT'de kuluçkaya yatırın.
    6. EDTA'yı aspire edin ve hücreleri mTeSR1 ortamını hafifçe ekleyerek ve kolonileri P1000 mikropipet kullanarak borulandırarak kuyulardan çıkarın. Konik bir tüp içinde hücreleri toplamak.
      NOT: Pipet hücrelerini 3x'ten fazla yukarı ve aşağı yapmayın.
    7. Her kuyuya 1 mL hücre süspansiyonu (seyreltilmiş 1:4) ekleyin, böylece her kuyu hücre süspansiyonu eklendikten sonra 1,5 mL orta madde içerir. Hücreleri %5 CO2, 37 °C'de kuvöze geri döndürün.
    8. %75-80'lik biraraya geldiğinde her 3 günde bir harcanan orta ve geçişi değiştirin.

2. Biyoreaktörde insan iPSC'lerinin tohumlanması

  1. MTeSR1'de monolayers olarak yetiştirilen ve 10 μM ROCK inhibitörü Y-27632 (ROCKi) ile desteklenen inkübatif iPSC'ler. 6 kuyudoku kültür plakasından her kuyuya 1 mL takviyeli ortam ekleyin ve 37 °C'de 1 saat kuluçka, %95 nem ve %5 CO2 ekleyin.
    NOT: ROCKi, ayrık iPSC'leri apoptosoz23'ten korumak için kullanılır.23
  2. Kuluçka dan sonra, her kuyudan harcanan ortamı aspire edin ve 1 mL 1× PBS ile iyi yıkayın.
  3. Hücre ayırma ortamının 1 mL'sini (Bkz. Malzeme Tablosu)6 kuyuluk tabakasının her kuyusuna ekleyin ve hücreler hafif sallayarak kuyulardan kolayca ayrışana kadar 37 °C'de 7 dakika kuluçkaya yatırın.
  4. Pipet hücreler ayrıştırıp tek hücrelere ayrışana kadar hücre ayırma orta yukarı ve aşağı bir P1000 mikropipet ile. Enzimatik sindirimi inaktive etmek için her kuyuya 2 mL tam hücre kültürü ortamı ekleyin ve hücreleri steril konik bir tüpe hafifçe pipetlendirin.
  5. Santrifüj 210 × g 3 dk ve supernatant kaldırın.
  6. Kültür ortamındaki hücre peletini yeniden askıya alın (yani, mTeSR1 10 μM ROCKi ile desteklenir) ve trypan mavi boya kullanarak iPSC'leri hemositometre ile sayın.
  7. Tohum 15 × 1010 6 tek hücre biyoreaktör (maksimum hacim 100 mL) ile 60 mL mTeSR1 250.000 hücre/mL son hücre yoğunluğunda 10 μM ROCKi ile desteklenmiştir.
  8. IPSC'leri içeren kabı 37 °C, %95 nem ve %5 CO 2'de kuvöze yerleştirilen evrensel taban ünitesineyerleştirin.
    NOT: Biyoreaktör karıştırma 24 saat boyunca iPSC toplama teşvik etmek için 27 rpm evrensel temel birim kontrolü ayarlayarak korunur.

3. Serebellar organoidlerde insan iPSC kaynaklı agregaların farklılaşması ve olgunlaşması

  1. Tek hücre tohumlama gününü 0 gün olarak tanımlayın.
  2. 1. günde, serolojik pipet kullanarak iPSC agrega örneğinin 1 mL'sini toplayın. Numuneyi toplamadan önce agregaları içeren biyoreaktöre evrensel baz ünitesini yerleştirerek biyoreaktörü ajitasyon altında koruyun. Hücre süspansiyonuna ultra düşük eki 24 iyi bir plaka yla plaka koyun. iPSC kaynaklı agregaların oluşmuş olduğundan denetleyin.
  3. Toplam çapı ölçmek için toplam 40x veya 100x büyütme kullanarak optik mikroskopla görüntüler elde edin.
  4. FIJI yazılımını kullanarak her görüntüdeki agregaların alanını ölçün.
    1. Seçin "Analiz | Ölçümlerimenü çubuğundanayarlayın ve "Alan" ve "Tamam" düğmesine tıklayın.
    2. "Dosyayı Seçin | Depolanmış bir resim dosyasını açmak için menü çubuğundan "açın. Araç çubuğunda sunulan çizgi seçim aracını seçin ve resimde sunulan ölçek çubuğunun üzerinde düz bir çizgi oluşturun. Seçin "Analiz | Menü çubuğundan ölçek " ayarlayın.
    3. "Bilinen uzaklıkta"olarak görüntünün ölçek çubuğunun genişliğini μm'de ekleyin. "Uzunluk birimi" μm olarak tanımlayın. Ayarları korumak için "Global" ve "Ok" düğmesine tıklayın. Araç çubuğunda Oval Seçim'i seçin.
    4. Her agrega için oval araç ile alanı çizgi. Seçin "Analiz | Ölçü ". Agregaların yaklaşık küresel
      figure-protocol-5598
      agrega alanı olarak A ile.
  5. Agregaların ortalama çapı 100 μm olduğunda, harcanan ortamın %80'ini ROCKi olmadan taze mTeSR1 ile değiştirin. Agregalar çapı 200-250 μm ulaştığında, tüm harcanan ortamı gfCDM(Tablo 1)ile değiştirin ve organoidlerin biyoreaktörün altına yerleşmelerine izin olun.
    NOT: Ortalama toplam çapı 350 μm'yi aşarsa, farklılaşma protokolünü başlatmayın. Tek hücrelerin tohumlama tekrarlayın. Genellikle, toplam ın ortalama çapı100 μm'ye ulaşması yaklaşık 1 gün sürer.
  6. Kuvöze yerleştirilen evrensel baz ünitesinde agregaları içeren biyoreaktörü 37 °C, %95 nem ve %5 CO2'yeyerleştirin.
  7. Biyoreaktör ajitasyonını 25 rpm'ye düşürün.
  8. 2. günde, toplam çapı değerlendirmek için 3.2, 3.3 ve 3.4 adımlarını tekrarlayın. 30 μL FGF2 (son konsantrasyon, 50 ng/mL) ve 60 μL SB431542 (son konsantrasyon, 10 μM) ila 60 mL gfCDM farklılaştırma ortamı(Tablo 1). Biyoreaktörden harcanan tüm ortamı eklenmiş gfCDM ile değiştirin. Adımı 3.6'yı tekrarlayın.
    NOT: SB431542 mezendodermal farklılaşmayı inhibe etmek için çok önemlidir, nöral farklılaşma indükleyen24. FGF2 nöroepitelyal doku25kaudalizasyon teşvik etmek için kullanılır.
  9. 5. günde, 3.2, 3.3, 3.4 ve 3.8 adımlarını tekrarlayın.
    NOT: Ayırım protokolü sırasında toplam boyutu artmalıdır. Ancak, bu parametre farklılaşmanın etkinliğini etkileyebileceğinden, çap yalnızca farklılaşma başladığında önemlidir.
  10. 7. günde, 3.2, 3.3 ve 3.4 adımlarını tekrarlayın. Seyreltik FGF2 ve SB431542 ila 2/3: 20 μL FGF2 ve 40 μL SB431542 ila 60 mL gfCDM farklılaşma ortamı ekleyin. Biyoreaktörden harcanan tüm ortamı takviye gfCDM ile değiştirin. Adımı 3.6 tekrarlayın ve biyoreaktör ajitasyonunu 30 rpm'e yükseltin.
  11. 14. günde, 3.2, 3.3 ve 3.4 adımlarını tekrarlayın. 60 mL gfCDM farklılaştırma ortamına 60 μL FGF19 (son konsantrasyon, 100 ng/mL) ekleyin. Biyoreaktörden harcanan tüm ortamı FGF19 ile desteklenen gfCDM ile değiştirin. Adımı 3.6'yı tekrarlayın.
    NOT: FGF19 orta-arka beyin yapılarının polarizasyon teşvik etmek için kullanılır26.
  12. 18. günde, 3.2, 3.3, 3.4 ve 3.11 adımlarını tekrarlayın.
  13. 21. günde, 3.2, 3.3 ve 3.4 adımlarını tekrarlayın. Biyoreaktörden harcanan tüm ortamı komple nörobazal ortamla değiştirin(Tablo 1). Adımı 3.6'yı tekrarlayın.
    NOT: Nörobazal orta organoid içinde nöronal hücre popülasyonunu korumak için kullanılan bir bazal orta7.
  14. 28. günde, 3.2, 3.3 ve 3.4 adımlarını tekrarlayın. 60 mL tam nörobazal ortama 180 μL SDF1 (son konsantrasyon, 300 ng/mL) ekleyin. Biyoreaktörden harcanan tüm ortamı SDF1 ile desteklenen komple nörobazal ortamla değiştirin. Adımı 3.6'yı tekrarlayın.
    NOT: SDF1 farklı hücre katmanları27organizasyonu kolaylaştırmak için kullanılır.
  15. 35. günde, 3.2, 3.3 ve 3.4 adımlarını tekrarlayın. Biyoreaktörden harcanan tüm ortamı tam BrainPhys ortamıyla değiştirin(Tablo 1). Adımı 3.6'yı tekrarlayın.
    NOT: BrainPhys sinaptically aktif nöronlar destekleyen bir nöronal orta28.
  16. Her 3 günde bir toplam hacmin 1/3'unu tam BrainPhys ortamı ile 90 güne kadar değiştirin.

4. Kriyoding ve immünohistokimya için organoidlerin hazırlanması

  1. İmmünoboyama için organoidlerin toplanması
    1. Biyoreaktörden 15 mL konik tüpe serolojik pipet li organoidlerden 1 mL numune alın.
      NOT: 7, 14, 21, 35, 56, 70, 80 ve 90 gün lerini de içeren farklılaşmanın etkinliğini değerlendirmek için organoidler farklı zaman noktalarında toplanmalıdır.
    2. Supernatant çıkarın ve 1 × PBS 1 mL ile bir kez yıkayın.
      NOT: Organoidleri santrifüj etmeyin. Organoidler yer çekimi ile tüpün dibinde yerleşmek sağlar.
    3. Supernatant çıkarın ve% 4 paraformaldehit (PFA) 1 mL ekleyin. 30 dk için 4 °C'de kuluçka. Harcanan PFA'yı çıkarın ve 1 × PBS'nin 1 mL'sini ekleyin.
    4. Organoidleri 1 mL × PBS'de 4 °C'de kriyozeksiyon için yapılana kadar saklayın.
      NOT: Fiksasyondan sonra organoidleri en fazla 1 hafta boyunca 1x PBS'de saklayın.
  2. Kriyoding için organoidlerin hazırlanması
    1. Depolanan organoidlerden süpernatantçıkarın. 1 mL% 15 sakaroz (w / v, 1× PBS seyreltilmiş), nazik girdap tarafından iyice karıştırın ve 4 ° C gecede kuluçka.
    2. %15 sakaroz/%7,5 jelatin(Tablo 2)çözeltisi hazırlayın ve jelatinin katılaşmasını önlemek için hazırlık sırasında 37 °C'de muhafaza edin.
    3. %15 sakaroz çözeltisini çıkarın, organoidlere %15 sakaroz/%7,5 jelatin 1 mL ekleyin ve hafif girdapile hızlı bir şekilde karıştırın. 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
    4. Hacminin yarısına kadar plastik bir kap için% 15 sakaroz /% 7.5 jelatin çözeltisi ekleyin. RT'de katılaşmayı bekleyin.
    5. 1 saat kuluçkadan sonra, pasteur pipetli katılaşmış jelatinin üzerine organoidleri içeren bir sakaroz/jelatin damlasını dikkatlice yerleştirin. Yaklaşık 15 dakika RT katılaşmak için bırakın. Kabarcık oluşumunu önlemek için emin olun.
    6. Konteyner dolana kadar organoidlerin üzerine %15 sakaroz/%7.5 jelatin yerleştirin. RT'de tam bir katılaşma bekleyin.
    7. Katılaşmadan sonra 4 °C'de 20 dk kuluçkaya yatırın.
    8. Jelatini merkezdeki organoidleri içeren bir küp şeklinde kesin ve o.C.T. bileşik bir damla ile karton bir parça üzerinde jelatin küp düzeltmek.
    9. 500 mL'lik bir kapta 250 mL isopentane yerleştirin ve uygun bir kabı sıvı nitrojenle doldurun. Forceps ve kalın eldivenler kullanarak, sıvı nitrojen yüzeyine isopentane içeren kabı dikkatlice yerleştirin ve isopentane'yi -80 °C'ye kadar soğutun.
    10. -80 °C'ye ulaşıldığında jelatin küpü donana kadar isopentane içeren bardağa yerleştirin ve sıcaklığı -80 °C'de tutarak. Küpün boyutuna bağlı olarak 1-2 dakika sürebilir.
      NOT: -80 °C'nin altındaki sıcaklıklardan veya aşırı donma süresinden kaçının, çünkü küpün çatlamasını önleyebilir.
    11. Dondurulduğunda jelatin küpü hızla -80 °C'de saklayın ve kriyokesit e kadar saklayın.
  3. Organoidlerin kriyoseksiyonu
    1. Kriyostat'ı açın ve -25 °C'de hem numune (OT) hem de kriyooda (CT) sıcaklıklarını tanımlayın.
    2. Her iki sıcaklık da dengelendiğinde, o.C.T. bileşiği kullanarak numuneüzerindeki organoidleri içeren jelatin küpü düzeltin.
    3. Kesit kalınlığını 12 μm olarak tanımlayın.
    4. Küpü kesin ve yapışma mikroskobu slaytlarında 3-4 dilim toplayın (bkz. Malzeme Tablosu).
    5. Kullanıma kadar -20 °C'de saklayın.
  4. Organoid dilimlerinin immünolemi
    1. Organoid kesitler içeren mikroskop slaytlarını, arka arkaya 10 slayt tutarak, 50 mL önceden ısıtılmış 1x PBS içeren bir başa çıkma kavanozuna yerleştirin.
      NOT: Tüm organoid kesitler sıvı ile batırılmalıdır.
    2. Slaytları dejelatinize etmek için 37 °C'de 45 dakika kuluçka.
    3. 1x'i 50 mL 1× PBS ile 5 dakika boyunca RT'de yıkayın: Slaytları taze 1× PBS içeren bir copling kavanozuna aktarın.
    4. Slaytları 50 mL taze hazırlanmış glisin içeren bir kavanoza aktarın(Tablo 2) ve 10 dakika boyunca RT'de kuluçkaya yatırın.
    5. Slaytları %0,1 triton(Tablo 2)50 mL içeren bir copling kavanozuna aktarın ve RT'de 10 dakika permeabilize edin.
    6. 5 dk 2x için 1× PBS ile yıkayın.
    7. 1× PBS'de ıslatılmış 3 mm kağıt ile immünboyama kabını hazırlayın. Dilimlerin her yerine bir doku ile kuru slaytlar ve 3 mm kağıt üzerine yerleştirin. Pasteur pipetiyle, slayt başına ~0,5 mL ile bloklama çözeltisi(Tablo 2)ile slaytların tüm yüzeyini kaplayın. RT'de 30 dakika kuluçka.
    8. Fazla engelleme çözeltisini çıkarın ve slaytları dilimlerin her yerinde bir doku yla kurulayın. Ana antikordan 50 μL(Tablo 3)kesitler üzerinde bloklama çözeltisi içinde seyreltilmiş ve kapaklı dudaklarla kaplayın. Daha önce hazırlanmış bir immunostaining çanak dilimleri yerleştirin. Gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
    9. Slaytları 50 mL TBST(Tablo 2)içeren bir copling kavanozuna aktarın, kapaklar düşer ve 5 dk 3x tbst ile yıkayın.
    10. Bloklama çözeltisinde seyreltilmiş ikincil antikordan 50 μL'lik kısmı bölümlerin üzerine yerleştirin ve kapaklı dudaklarla kaplayın. Dilimleri önceden hazırlanmış immün boyama kabına yerleştirin. RT'de 30 dakika boyunca ışıktan korunan kuluçka.
    11. Slaytları tekrar bir copling kavanozuna aktarın ve 5 dk 3x için 50 mL TBST ile yıkayın.
    12. Dilimlerin her yerine bir doku ile slaytlar kuruve daha önce hazırlanmış bir immunostaining çanak dilimleri yerleştirin. Pasteur pipeti ile slaytların tüm yüzeyine 0,5 mL DAPI çözeltisi ekleyin. RT 5 dakika kuluçka.
    13. Adımı 4.4.9'u tekrarlayın.
    14. Slaytları bir doku ile dikkatlice kurulayın. Slayt boyunca damla damla 50 μL montaj orta damla ekleyin ve sonra dikkatlice kabarcıklar önlemek için hafifçe bükerek, her slayt üzerine bir coverslip indirin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Protokol, 0.1 L biyoreaktörler(Şekil 1A)kullanılarak hücre agregasyonu teşvik edilerek başlatılmıştır. 250.000 hücre/mL ile 60 mL orta alanda 27 rpm ajitasyon hızıile tek hücreli aşılama yapıldı. Bu gün 0 olarak tanımlanmıştır. 24 saat sonra hücreler spheroid şekilli agregaları (gün 1, Şekil 1B)verimli bir şekilde oluşturdular ve morfoloji 5. (Şekil 1B). Mikroskopi ile yapılan bir kantitatif analizde,...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Uyuşturucu taraması ve rejeneratif tıp uygulamaları için belirli hücre tipleri oluşturmak için büyük hücre numaralarının yanı sıra tanımlanmış kültür koşullarına duyulan ihtiyaç ölçeklenebilir kültür sistemlerinin gelişmesine yol açmıştır. Son yıllarda, çeşitli gruplar nöral atalar ve fonksiyonel nöronların ölçeklenebilir nesil bildirdin32,33,34, nörodejeneratif bozukluklar için yeni mod...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar YH ve SJ PBS Biotech çalışanlarıdır. Yazar BL, PBS Biotech, Inc.'in CEO'su ve kurucu ortağıdır. Bu işbirlikçi yazarlar el yazmasında kullanılan biyoreaktörlerin geliştirilmesine katıldılar. Bu, yazarların veri ve materyallerin paylaşılmasına ilişkin derginin tüm ilkelerine bağlılığını değiştirmez. Diğer tüm yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmez.

Teşekkürler

Bu çalışma Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portekiz (UIDB/04565/2020 programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Project N. 007317, PD/BD/105773/2014 to T.P.S ve PD/BD/128376/2017 to D.E.S.N., FEDER tarafından ortaklaşa finanse edilen projeler (POR Lisboa 2020—Programa Operacional Regional de Lisboa PORTEKIZ 2020) ve FCT hibe PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 ve CEREBEX Nesil Serebellar Organoidler AtaksiA Araştırma hibe LISBOA-01-0145-FEDER-029298. 739572 sayılı Hibe Anlaşması kapsamında Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 Araştırma ve İnovasyon Programı'ndan da fon alındı- Keşifler Rejeneratif ve Hassas Tıp Keşifler Merkezi H2020-GENİş-01-2016-2017.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
3MM paperWHA3030861Merck
AccutaseA6964 - 500mLSigmacell detachment medium
Anti-BARHL1 AntibodyHPA004809Atlas Antibodies
Anti-Calbindin D-28k AntibodyCB28Millipore
Anti-MAP2 AntibodyM4403Sigma
Anti-N-Cadherin Antibody610921BD Transduction
Anti-NESTIN AntibodyMAB1259-SPR&D
Anti-OLIG2 AntibodyMABN50Millipore
Anti-PAX6 AntibodyPRB-278PCovance
Anti-SOX2 AntibodyMAB2018R&D
Anti-TBR1 AntibodyAB2261Millipore
Anti-TBR2 Antibodyab183991Abcam
Anti-TUJ1 Antibody801213Biolegend
Apo-transferrinT1147Sigma
BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM1 Kit5793 - 500mLStem cell tecnhnologies
Chemically defined lipid concentrate11905031ThermoFisher
Coverslips 24x60mm631-1575VWR
Crystallization-purified BSA5470Sigma
DAPI10236276001Sigma
Dibutyryl cAMPSC- 201567B -500mgFrilabo
DMEM-F1232500-035ThermoFisher
Fetal bovine serumA3840001ThermoFisher
Gelatin from bovine skinG9391Sigma
Glass Copling JarE94ThermoFisher
Glutamax I10566-016ThermoFisher
GlycineMB014001NZYtech
Ham’s F1221765029ThermoFisher
Human Episomal iPSC LineA18945ThermoFisheriPSC6.2
IMDM12440046ThermoFisher
Insulin91077CSigma
iPS DF6-9-9T.BWiCell
Iso-pentanePHR1661-2MLSigma
L-Ascorbic acidA-92902Sigma
Matrigel354230Corningbasement membrane matrix
MonothioglycerolM6154Sigma
Mowiol475904Milliporemounting medium
mTeSR185850 -500mlStem cell technologies
N2 supplement17502048ThermoFisher
Neurobasal12348017ThermoFisher
Paraformaldehyde158127Sigma
PBS-0.1 Single-Use VesselSKU: IA-0.1-D-001PBS Biotech
PBS-MINI MagDrive Base UnitSKU: IA-UNI-B-501PBS Biotech
Recombinant human BDNF450-02Peprotech
Recombinant human bFGF/FGF2100-18BPeprotech
Recombinant human FGF19100-32Peprotech
Recombinant human GDNF450-10Peprotech
Recombinant human SDF1300-28APeprotech
ROCK inhibitor Y-2763272302Stem cell technologies
SB431542S4317Sigma
SucroseS7903Sigma
SuperFrost Microscope slides12372098ThermoFisheradhesion microscope slides
Tissue-Tek O.C.T. Compound25608-930VWR
Tris-HCL 1MT3038-1LSigma
Triton X-1009002-93-1Sigma
Tween-20P1379Sigma
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.015575020ThermoFisher

Referanslar

  1. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Thomson, J. A. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  3. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  4. Ishida, Y., et al. Vulnerability of Purkinje Cells Generated from Spinocerebellar Ataxia Type 6 Patient-Derived iPSCs. Cell Reports. 17 (6), 1482-1490 (2016).
  5. Liu, Y., Zhang, S. C. Human stem cells as a model of motoneuron development and diseases. Annals of the New York Academy of Sciences. 1198, 192-200 (2010).
  6. Mariani, J., Coppola, G., Pelphrey, K. A., Howe, J. R., Vaccarino, F. M. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/ Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162 (2), 375-390 (2015).
  7. Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-Organization of Polarized Cerebellar Tissue in 3D Culture of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
  8. Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
  9. Aubry, L., et al. Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (43), 16707-16712 (2008).
  10. Gunhanlar, N., et al. A simplified protocol for differentiation of electrophysiologically mature neuronal networks from human induced pluripotent stem cells. Molecular Psychiatry. 23 (5), 1336-1344 (2018).
  11. Hu, B. Y., Zhang, S. C. Differentiation of spinal motor neurons from pluripotent human stem cells. Nature Protocols. 4 (9), 1295-1304 (2009).
  12. Jo, J., et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
  13. Muguruma, K., et al. Ontogeny-recapitulating generation and tissue integration of ES cell-derived Purkinje cells. Nature Neurosciences. 13 (10), 1171-1180 (2010).
  14. Watson, L. M., Wong, M. M. K., Vowles, J., Cowley, S. A., Becker, E. B. E. A Simplified Method for Generating Purkinje Cells from Human-Induced Pluripotent Stem Cells. The Cerebellum. 17 (4), 419-427 (2018).
  15. Wang, S., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons. Science Reports. 5, 9232(2015).
  16. Tao, O., et al. Efficient generation of mature cerebellar Purkinje cells from mouse embryonic stem cells. Journal of Neuroscience Research. 88 (2), 234-247 (2010).
  17. Croughan, M. S., Giroux, D., Fang, D., Lee, B. Novel Single-Use Bioreactors for Scale-Up of Anchorage-Dependent Cell Manufacturing for Cell Therapies. Stem Cell Manufacturing. , 105-139 (2016).
  18. Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144 (6), 976-985 (2017).
  19. Lou, Y. R., Leung, A. W. Next generation organoids for biomedical research and applications. Biotechnology Advances. 36 (1), 132-149 (2018).
  20. Silva, T. P., et al. Design Principles for Pluripotent Stem Cell-Derived Organoid Engineering. Stem Cells International. 2019, 1-17 (2019).
  21. Silva, T. P., et al. Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture. Frontiers of Bioengineering and Biotechnology. , (2020).
  22. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6 (4), 18293(2011).
  23. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  24. Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).
  25. Yaguchi, Y., et al. Fibroblast growth factor (FGF) gene expression in the developing cerebellum suggests multiple roles for FGF signaling during cerebellar morphogenesis and development. Developmental Dynamics. 238 (8), 2058-2072 (2008).
  26. Fischer, T., et al. Fgf15-mediated control of neurogenic and proneural gene expression regulates dorsal midbrain neurogenesis. Developmental Biology. 350 (2), 496-510 (2011).
  27. Bagri, A., et al. The chemokine SDF1 regulates migration of dentate granule cells. Development. 129 (18), 4249-4260 (2002).
  28. Bardy, C., et al. Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (20), 2725-2734 (2015).
  29. Bauwens, C. L., et al. Control of Human Embryonic Stem Cell Colony and Aggregate Size Heterogeneity Influences Differentiation Trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
  30. Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).
  31. Miranda, C. C., et al. Spatial and temporal control of cell aggregation efficiently directs human pluripotent stem cells towards neural commitment. Biotechnology Journal. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  32. Miranda, C. C., Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. Scaling up a chemically-defined aggregate-based suspension culture system for neural commitment of human pluripotent stem cells. Biotechnology Journal. 11 (12), 1628-1638 (2016).
  33. Bardy, J., et al. Microcarrier Suspension Cultures for High-Density Expansion and Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Neural Progenitor Cells. Tissue Engineering Part C Methods. 19 (2), 166-180 (2013).
  34. Rigamonti, A., et al. Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System. Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).
  35. Arora, N., et al. A process engineering approach to increase organoid yield. Development. 144 (6), 1128-1136 (2017).
  36. Gimeno, L., Martinez, S. Expression of chick Fgf19 and mouse Fgf15 orthologs is regulated in the developing brain by Fgf8 and Shh. Developmental Dynamics. 236 (8), 2285-2297 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendislikSay 160insan kaynakl pluripotent k k h crelerserebellar farkl la madinamik sistemtan mlanm k lt r ko ullarkriyositasyonimm nboyama

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır