JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר מערכת תרבות דינמית כדי לייצר אגרגטים גודל מבוקר של תאי גזע פלורופוטנטיים אנושיים ולעורר עוד יותר בידול באורגנואידים המוח הקטן תחת תנאים מוגדרים כימית ונטול מאכיל באמצעות bioreactor חד-שימוש.

Abstract

המוח הקטן ממלא תפקיד קריטי בתחזוקה של איזון וקואורדינציה מוטורית, פגם תפקודי בנוירונים המוח שונים יכול לעורר תפקוד המוח הקטן. רוב הידע הנוכחי על פנוטיפים עצביים הקשורים למחלות מבוסס על רקמות שלאחר המוות, מה שהופך את ההבנה של התקדמות המחלה ופיתוח קשה. מודלים של בעלי חיים וקווי תאים מונצחים שימשו גם כמודלים להפרעות ניווניות. עם זאת, הם אינם לגמרי לסיכום מחלות אנושיות. תאי גזע פלורופוטנטיים המושרה על ידי בני אדם (iPSCs) יש פוטנציאל גדול עבור מידול מחלות ולספק מקור יקר ערך עבור גישות רגנרטיביות. בשנים האחרונות, הדור של אורגנואידים מוחיים מ-iPSCs הנגזרים ממטופל שיפר את הסיכויים למודלים של מחלות ניווניות. עם זאת, פרוטוקולים המייצרים מספר גדול של אורגנואידים ותשואה גבוהה של נוירונים בוגרים במערכות תרבות 3D חסרים. הפרוטוקול שהוצג הוא גישה חדשה לדור רפרודוק ומדרגי של אורגנואידים אנושיים הנגזרים מ-iPSC בתנאים המוגדרים כימית באמצעות ביו-כוערים חד-פעמיות מדרגיים, שבהם אורגנואידים רוכשים זהות מוחית. האורבנואידים שנוצרו מאופיינים בביטוי של סמנים ספציפיים הן ברמת mRNA והן ברמת החלבון. הניתוח של קבוצות ספציפיות של חלבונים מאפשר זיהוי של אוכלוסיות שונות של תאים המוח הקטן, אשר התיור חשוב להערכת מבנה אורגנואיד. cryosectioning אורגנואידים וחיסונים נוספים של פרוסות אורגנואיד משמשים כדי להעריך את הנוכחות של אוכלוסיות ספציפיות של תאים המוח הקטן והארגון המרחבי שלהם.

Introduction

הופעתם של תאי גזע פלורופוטנטיים אנושיים (PSCs) מייצגת כלי מצוין לרפואה רגנרטיבית ומידול מחלות, כי תאים אלה יכולים להיות מובדילים לתוך רוב תוחוני התא של גוףהאדם 1,,2. מאז הגילוי שלהם, פידול PSC באמצעות גישות מגוונות דווח המודל מחלות שונות, כולל הפרעות ניווניות3,,4,,5,6.

לאחרונה, היו דיווחים על תרבויות 3D נגזר PSCs דומה מבנים מוחיים אנושיים; אלה נקראים אורגנואידים במוח3,,7,,8. הדור של מבנים אלה הן PSCs בריא וסבלני מספק הזדמנות רבת ערך כדי מודל התפתחות אנושית והפרעות נוירו-התפתחותיות. עם זאת, השיטות המשמשות ליצירת מבנים מוחיים מאורגנים היטב אלה קשה להגיש בקשה לייצור בקנה מידה גדול שלהם. כדי לייצר מבנים גדולים מספיק כדי לתמצת מורפוגנזה רקמה ללא נמק בתוך organoids, פרוטוקולים להסתמך על המחויבות העצבית הראשונית בתנאים סטטיים, ואחריו אנקפולציה הידרוג'לים ותרבות עוקבותבמערכות דינמיות 3. עם זאת, גישות כאלה עשויות להגביל את קנה המידה הפוטנציאלי של ייצור אורגנואידים. למרות נעשו מאמצים לכוון את בידול PSC לאזורים מסוימים של מערכת העצבים המרכזית, כולל קליפת המוח, סטריאטל, המוח האמצעי, ונוירונים חוט השדרה9,10,11,12, הדור של אזורי מוח ספציפיים בתנאים דינמיים הוא עדיין אתגר. בפרט, הדור של נוירונים המוח הקטן בוגר במבנים 3D עדיין לא תואר. Muguruma ואח '. חלוץ הדור של תנאי תרבות כי סיכוםמוקדם המוח הקטן פיתוח 13 ולאחרונה דיווח פרוטוקול המאפשר לתאי גזע עובריים אנושיים ליצור מבנה מקוטב המזכיר את המוח הקטן של השלישהראשון 7. עם זאת, התבגרות של נוירונים המוח הקטן במחקרים שדווחו דורש תנתק של אורגנואידים, מיון של נבונות המוח הקטן, וcoculture עם תאי ההזנהבמערכת תרבות מונו-שכבתית 7,14,15,16. לכן, הדור הניתן לשחזור של אורגנואידים המוח הקטן הרצוי עבור מידול מחלות בתנאים מוגדרים הוא עדיין אתגר הקשורים תרבות ושונות מקור מאכיל.

פרוטוקול זה מציג תנאי תרבות אופטימליים להרחבת תלת-מיתד ובידול יעיל של PSCs אנושיים לנוירונים המוחליים באמצעות ביו-סיבה של גלגל אנכי חד-ספרתי (ראה טבלת חומרים למפרטים), הנקראים להלן ביו-כואבי החיים. ביו-גורם מצוידים במדחף אנכי גדול, אשר בשילוב עם תחתית בצורת U, לספק התפלגות גייה הומוגנית יותר בתוך כלי השיט, המאפשר עדין, ערבוב אחיד ומתלי חלקיקים עם מהירויות תסיסהמופחתת 17. עם מערכת זו, ניתן להשיג אגרגטים של תאים הנשלטים על-ידי צורה וגודל, דבר שחשוב להבדיל הומוגני ויעיל יותר. יתר על כן, מספר גדול יותר של אורגנואידים נגזר iPSC ניתן ליצור באופן פחות מייגע.

התכונה העיקרית של organoids, שהם מבנים רב תאיים 3D בדרך כלל נוצר מתאי גזע, הוא ארגון עצמי של סוגי תאים שונים שיוצרים צורות ספציפיות כמו אלה לראות מורפוגנזהאנושית 18,,19,20. לכן, מורפולוגיה אורגנואידית היא קריטריון חשוב שיש להעריך במהלך תהליך ההבחנה. Cryosectioning של אורגנואידים וחיסונים נוספים של פרוסות אורגנואיד עם קבוצה ספציפית של נוגדנים לאפשר הדמיה מרחבית של סמנים מולקולריים לנתח התפשטות תאים, בידול, זהות אוכלוסיית התא, אפופטוזיס. עם פרוטוקול זה, על ידי קריוסות אורגנואידים חיסוניות, מחויבות עצבית יעילה ראשונית נצפתה על ידי היוםה-7 של בידול. במהלך בידול, מספר אוכלוסיות תאים עם זהות המוח הקטן נצפו. לאחר 35 ימים במערכת דינמית זו, neuroepithelium המוח הקטן מארגן לאורך ציר apicobasal, עם שכבה apical של פרוגניטורים משגשגים ונוירונים פוסט מיתוטיים הממוקמים בהתבססות. במהלך תהליך ההתבגרות, מימים 35-90 של בידול, ניתן לראות סוגים שונים של נוירונים המוח הקטן, כולל תאי Purkinje (קלבינדין+), תאי גרגר (PAX6+/ MAP2+), תאי גולגי (Neurogranin+ ),תאי מברשת חד קוטביים (TBR2+), ונוירונים הקרנת גרעין המוח הקטן עמוק (TBR1+). כמו כן, כמות לא משמעותית של מוות תאים נצפתה באורגנואידים המוח הקטן שנוצר לאחר 90 ימים בתרבות.

במערכת זו, אורגנואידים הנגזרים על-ידי IPSC אנושיים מתבגרים לנוירונים המוח שונים ושורדים עד 3 חודשים ללא צורך בתחוך ומזון coculture, מתן מקור של נוירונים המוח הקטן האנושי עבור מידול מחלות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. מעבר ותחזוקה של iPSCs אנושיים בתרבות חד שכבתית

  1. הכנת צלחות
    1. להפשיר את מטריצת קרום המרתף (ראה טבלת חומרים)מניות ב 4 מעלות צלזיוס ולהכין 60 μL aliquots. הקפא את האליציטוטים ב-20 מעלות צלזיוס.
    2. כדי לכסות את בארות של צלחת 6 באר, להפשיר aliquot אחד של מטריצת קרום המרתף על קרח. לאחר הפשרת להוסיף 60 μL כדי 6 מ"ל של DMEM-F12. בעדינות מחדש על ידי התקפלות למעלה ומטה.
    3. להוסיף 1 מ"ל של פתרון מטריצת קרום מרתף מדולל לכל באר של 6 צלחת באר דגירה ב RT לפחות 1 שעה לפני מעבר או לאחסן ב 4 ° C עד שבוע.
  2. מעבר מושבות IPSC עם EDTA
    1. שמור על iPSCs בתרבות המונו-שכבתית ב-6 לוחות באר באינקובטור ב-37°C, 95% לחות ו-5% CO2.
      הערה: בפרוטוקול זה נעשה שימוש בשלושה קווי iPSC אנושיים נפרדים: F002.1A.1321, קו iPSC אפיזומלי אנושי (iPSC6.2)22, ו-iPS-DF6-9-9T שהושגו באופן מסחרי.B (ראה טבלת חומרים).
    2. לפני המעבר, דגירה את הצלחות המאוחסנות (שלב 1.1) בטמפרטורת החדר (RT) למשך 15 דקות והכנו את המדיום mTesR1(טבלה 1).
    3. שאף את הפתרון מהצלחת באמצעות פיפטה סרולוגית ומיד להוסיף 0.5 מ"ל של mTeSR1 בינוני לכל באר.
    4. לשאוף את המדיום בילה מן הבאר המכילה iPSCs ולשטוף פעם אחת באמצעות 1 מ"ל של 0.5 mM EDTA לכל באר.
    5. הוסף 1 מ"ל של 0.5 mM EDTA לכל באר ותדגם ב- RT במשך 5 דקות.
    6. שאפף EDTA ולהסיר את התאים מהבארות על ידי הוספת בעדינות mTeSR1 בינוני ו pipetting המושבות באמצעות micropipette P1000. לאסוף את התאים בצינור חסונים.
      הערה: אין לתאי פיפטה למעלה ומטה יותר מ- 3x.
    7. הוסף 1 מ"ל של מתלה תא (מדולל 1:4) לכל באר כך שכל באר מכילה 1.5 מ"ל של בינוני לאחר הוספת מתלי התא. החזר תאים לאקובטור ב- 5% CO2, 37 °C.
    8. החלף את המדיום היומי והמעבר שהושקע כל 3 ימים כאשר 75%-80% התכנסות מושגת.

2. זריעת IPSCs אנושיים ביו-סיבה

  1. iPSCs דגירה גדל כמו monolayers ב mTeSR1 בתוספת עם 10 μM של מעכבי רוק Y-27632 (ROCKi). מוסיפים 1 מ"ל של תוספת בינונית לכל באר מצלחת של 6 בארות של תרבות רקמות ותדגירה לשעה אחת ב-37°C, 95% לחות ו-5% CO2.
    הערה: ROCKi משמש להגנה על iPSCs דיסוציאציה מפני אפופטוזיס23.
  2. לאחר 1 שעה של דגירה, לשאוף את המדיום בילה מכל באר ולשטוף 1x עם 1 מ"ל של 1× PBS לכל באר.
  3. הוסף 1 מ"ל של תא ניתוק בינוני (ראה טבלת חומרים)לכל באר של צלחת 6 באר דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 7 דקות עד תאים להתנתק בקלות מן הבארים עם רעד עדין.
  4. פיפטה ניתוק התא בינוני למעלה ומטה עם micropipette P1000 עד התאים לנתק ולנתק לתאים בודדים. להוסיף 2 מ"ל של תא שלם תרבות בינונית לכל באר כדי להשבית עיכול אנזימטי פיפטה התאים בעדינות לתוך צינור חרלי סטרילי.
  5. צנטריפוגה ב 210 × גרם במשך 3 דקות ולהסיר את supernatant.
  6. להשתמש מחדש את גלולת התא במדיום תרבות (כלומר, mTeSR1 בתוספת 10 μM של ROCKi) ולספור את iPSCs עם hemocytometer באמצעות צבע כחול trypan.
  7. זרע 15 × 106 תאים בודדים ביו-סיבה (נפח מרבי של 100 מ"ל) עם 60 מ"ל של mTeSR1 בתוספת 10 μM של ROCKi בצפיפות תא סופית של 250,000 תאים/ מ"ל.
  8. הכנס את כלי המכיל את האיי.פי.אס ביחידת הבסיס האוניברסלית הממוקמת באינקובטור ב- 37°C, 95% לחות ו-5% CO2.
    הערה: ההמולה של היצר הביולוגי נשמרת במשך 24 שעות על-ידי הגדרת בקרת יחידת הבסיס האוניברסלית ל- 27 סל"ד כדי לקדם את צבירת iPSC.

3. בידול והתבגרות של אגרגטים אנושיים הנגזרים על-ידי IPSC באורגנואידים מוחיים

  1. הגדר את היום של זריעת תא יחיד כייום 0.
  2. ביום הראשון, לאסוף 1 מ"ל של מדגם אגרגט iPSC באמצעות פיפטה סרולוגית. שמור על הסיבה הביולוגית תחת עצבנות כמו בעבר על ידי הצבת יחידת הבסיס האוניברסלית עם bioreactor המכיל את הצבירות בזרימה סטרילית לפני איסוף הדגימה. לוח מתלה התא בחיבור אולטרה נמוך 24 צלחת גם. ודא שנוצרים אגרגטים הנגזרים מ- iPSC.
  3. לרכוש תמונות עם מיקרוסקופ אופטי באמצעות הגדלה כוללת של 40x או 100x כדי למדוד קוטר מצטבר.
  4. מדוד את אזור הצבירות בכל תמונה באמצעות תוכנת FIJI.
    1. בחר "נתח | הגדר מדידות" משורת התפריטים ולחץ על "אזור" ו "אישור".
    2. בחר "קובץ | פתחאת " משורת התפריטים כדי לפתוח קובץ תמונה מאוחסן. בחרו בכלי בחירת הקו המוצג בשורת הכלים וצור קו ישר מעל סרגל קנה המידה המוצג בתמונה. בחר "נתח | הגדר קנה מידה" משורת התפריטים.
    3. ב- "מרחק ידוע"הוסף את המרחב של סרגל קנה המידה של התמונה ב- μm. הגדר את "יחידת אורך" כμm. לחץ על "כללי" כדי לשמור על ההגדרות "אישור". בחרו 'בחירה סגלגלה' בשורת הכלים.
    4. עבור כל צבירה, תכלית את האזור בעזרת הכלי הסגלגל. בחר "נתח | "למדוד". חשב את הקוטר שלהם בהתבסס על שטח נמדד, בהתחשב בכך שאצרגטים הם כדוריים בערך באמצעות
      figure-protocol-4842
      עם A כאזור הצבירה.
  5. כאשר הקוטר הממוצע של הצבירות הוא 100 μm, להחליף 80% של המדיום בילה עם mTeSR1 טרי ללא ROCKi. כאשר אגרגטים מגיעים 200-250 μm קוטר, להחליף את כל המדיום בילה עם gfCDM (טבלה 1), לתת אורגנואידים להתיישב בתחתית bioreactor.
    הערה: אם קוטר הצבירה הממוצע עולה על 350 μm אל תתחיל את פרוטוקול ההבידול. חזור על זריעת תאים בודדים. בדרך כלל, זה לוקח סביב 1 יום עבור הצבירה להגיע קוטר ממוצע של 100 μm.
  6. הכנס את הסיבה הביולוגית המכילה את הצבירות ביחידת הבסיס האוניברסלית הממוקמת באינקובטור ב- 37°C, 95% לחות ו- 5% CO2.
  7. הפחת את התסיסה של הסיבה הביולוגית ל- 25 סל"ד.
  8. ביום השני, חזור על שלבים 3.2, 3.3 ו- 3.4 כדי להעריך את הקוטר הצבור. להוסיף 30 μL של FGF2 (ריכוז סופי, 50 ng/mL) ו 60 μL של SB431542 (ריכוז סופי, 10 μM) כדי 60 מ"ל של gfCDM בידול בינוני(טבלה 1). החלף את כל בילה בינוני מן bioreactor עם gfCDM תוסף. חזור על שלב 3.6.
    הערה: SB431542 הוא חיוני כדי לעכב בידול mesendodermal, גורם בידול עצבי24. FGF2 משמש כדי לקדם את הקוודליזציה של רקמת neuroepithelial25.
  9. ביום 5, חזור על שלבים 3.2, 3.3, 3.4 ו- 3.8.
    הערה: גודל צבירה אמור לגדול במהלך פרוטוקול ההבידול. עם זאת, הקוטר הוא קריטי רק כאשר ההבידול מתחיל, מכיוון פרמטר זה יכול להשפיע על יעילות הבידול.
  10. ביום 7, חזור על שלבים 3.2, 3.3 ו- 3.4. דילול FGF2 ו SB431542 כדי 2/3: להוסיף 20 μL של FGF2 ו 40 μL של SB431542 כדי 60 מ"ל של gfCDM בידול בינוני. החלף את כל בילה בינוני מן bioreactor עם gfCDM תוסף. חזור על שלב 3.6 והגביר את התסיסה ביו-סיבה ל-30 סל"ד.
  11. ביום 14, חזור על שלבים 3.2, 3.3 ו- 3.4. להוסיף 60 μL של FGF19 (ריכוז סופי, 100 ng/mL) כדי 60 מ"ל של gfCDM בידול בינוני. החלף את כל בילה בינוני מן bioreactor עם gfCDM בתוספת FGF19. חזור על שלב 3.6.
    הערה: FGF19 משמש לקידום קיטוב של מבנים באמצע ההינדי26.
  12. ביום 18, חזור על שלבים 3.2, 3.3, 3.4 ו- 3.11.
  13. ביום 21, חזור על שלבים 3.2, 3.3 ו- 3.4. החלף את כל הכסף שהוצא מהביו-קטור במדיום נוירו-בסל מלא(טבלה 1). חזור על שלב 3.6.
    הערה: מדיום Neurobasal הוא מדיום בסיס המשמש לשמירה על אוכלוסיית התאים העצביים בתוך אורגנואיד7.
  14. ביום 28, חזור על שלבים 3.2, 3.3 ו- 3.4. להוסיף 180 μL של SDF1 (ריכוז סופי, 300 ng/mL) כדי 60 מ"ל של מדיום neurobasal מלא. החלף את כל הכסף שהוצא מהביו-קטור עם מדיום נוירו-בסל מלא בתוספת SDF1. חזור על שלב 3.6.
    הערה: SDF1 משמש כדי להקל על הארגון של שכבות תא נפרדות27.
  15. ביום 35, חזור על שלבים 3.2, 3.3 ו- 3.4. החלף את כל החברה הנוכלת מהביו-קטור במדיום BrainPhys שלם(טבלה 1). חזור על שלב 3.6.
    הערה: BrainPhys הוא מדיום עצבי התומך נוירונים פעילים מבחינה סינאפטית28.
  16. החלף 1/3 של הנפח הכולל כל 3 ימים עם מלא BrainPhys בינוני עד היום 90 של בידול.

4. הכנת אורגנואידים להקפאה וחיסונים

  1. אוסף אורגנואידים לחיסונים
    1. לאסוף 1 מ"ל של מדגם של אורגנואידים בינוניים המכילים עם פיפטה סרולוגית מהביו-קטור לצינור חרוכי של 15 מ"ל.
      הערה: יש לאסוף אורגנואידים בנקודות זמן שונות כדי להעריך את יעילות ההבידול, כולל ימים 7, 14, 21, 35, 56, 70, 80 ו- 90.
    2. הסר את הסופרנטנט ושטוף פעם אחת עם 1 מ"ל של 1× PBS.
      הערה: אין צנטריפוגה באורגנואידים. תן לאוגן להתיישב בתחתית הצינור על ידי כוח המשיכה.
    3. הסר את supernatant ולהוסיף 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde (PFA). דגירה ב 4 °C במשך 30 דקות. הסר את PFA שהוצא והוסף 1 מ"ל של PBS × 1.
    4. לאחסן את האורבנואידים ב-1 מ"ל של 1× PBS ב-4°C עד לעיבוד לצורך cryosectioning.
      הערה: אחסן את האורבנואידים ב- PBS 1x למשך לא יותר משבוע לאחר קיבעון.
  2. הכנת אורגנואידים להקפאה
    1. הסר את הסופרנטנט מהמאוברנואידים המאוחסנים. הוסף 1 מ"ל של 15% סוכרוז (w /v, מדולל ב 1× PBS), לערבב היטב על ידי מערבולת עדינה, ומדגם לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
    2. הכינו פתרון של 15% סוכרוז/7.5% ג'לטין(טבלה 2) ושמרועל 37°C במהלך ההכנה כדי להימנע מכך שג'לטין יתגבש.
    3. הסר את תמיסת ה-15% סוכרוז, הוסף 1 מ"ל של 15% סוכרוז/7.5% ג'לטין לאוברנואידים, ומערבבים במהירות על ידי מערבולות עדינות. דגירה ב 37 ° C עבור 1 שעה.
    4. הוסף 15% תמיסת ג'לטין סוכרוז/7.5% למכל פלסטיק עד מחצית מנפחו. חכה לגבשות בRT.
    5. לאחר דגירה של שעה אחת, מניחים בזהירות טיפת סוכרוז/ג'לטין המכילה את האורבנואידים על הג'לטין המוצק עם פיפטת פסטר. השאר להתגבש ב RT במשך כ 15 דקות. הקפד להימנע היווצרות בועה.
    6. מניחים 15% סוכרוז/7.5% ג'לטין מעל האורבנואידים עד שהמיכל מתמלא. המתן לגבשות מלאה ב-RT.
    7. לאחר ההתגבשות, דגירה 20 דקות ב 4 ° C.
    8. חותכים את הג'לטין לקוביה המכילה את האורבנואידים במרכז ולתקן את קוביית הג'לטין על חתיכת קרטון עם טיפה של תרכובת O.C.T.
    9. מניחים 250 מל של isopentane ב 500 מל ולמלא מיכל מתאים עם חנקן נוזלי. בעזרת מרטבים וכפפות עבות, מניחים בזהירות את הספל המכיל איזופטן על פני השטח של חנקן נוזלי ומצננים את האפסופנטן ל-80 מעלות צלזיוס.
    10. כאשר מגיעים ל-80°C, מניחים את קוביית הג'לטין בספל המכילה איזופטן עד שהיא קופאת, תוך שמירה על הטמפרטורה ב-80 מעלות צלזיוס. בהתאם לגודל הקוביה, ייתכן שאקח 1-2 דקות.
      הערה: הימנע מטמפרטורות מתחת ל-80°C או מזמן הקפאה מוגזם, מכיוון שהוא עלול לגרום לפיצוח הקוביה.
    11. כאשר קפוא, לאחסן במהירות את קוביית הג'לטין ב -80 °C ולאחסן עד cryosectioning.
  3. קריוסה של אורגנואידים
    1. הפעל את ההקפאה והגדר הן את טמפרטורות הדגימה (OT) והן את טמפרטורות ההקפאה (CT) ב-25°C.
    2. כאשר שתי הטמפרטורות מתייצבות, לתקן את קוביית הג'לטין המכילה את האורבנואידים על הדגימה באמצעות תרכובת O.C.T.
    3. הגדר עובי מקטע ב- 12 μm.
    4. חותכים את הקוביה ואספו 3-4 פרוסות על שקופיות מיקרוסקופ הדבקה (ראה טבלת חומרים).
    5. לאחסן ב -20 °C עד לשימוש.
  4. חיסון של פרוסות אורגנואידים
    1. מקם את שקופיות המיקרוסקופ המכילות מקטעים אורגנואידים בצנצנת התדידות עם 50 מ"ל של PBS 1x חמם מראש, מחזיק עד 10 שקופיות גב אל גב.
      הערה: כל מקטעי האורגונואידים צריכים להיות שקועים בנוזל.
    2. דגירה במשך 45 דקות ב 37 ° C כדי degelatinize שקופיות.
    3. לשטוף 1x עם 50 מ"ל של 1× PBS במשך 5 דקות ב RT: להעביר את השקופיות לצנצנת היתד המכילה PBS 1× טרי.
    4. מעבירים את השקופיות לצנצנת היתד המכילה 50 מ"ל של גלצין טרי (שולחן 2) ותדגירה למשך 10 דקות ב-RT.
    5. מעבירים את השקופיות לצנצנת היתד המכילה 50 מ"ל של טריטון 0.1%(טבלה 2)וחומלים למשך 10 דקות ב-RT.
    6. לשטוף עם 1× PBS במשך 5 דקות 2x.
    7. מכינים את המנה החיסונית עם נייר 3 מ"מ ספוג ב-1× PBS. שקופיות יבשות עם רקמה מסביב לפרוסות ומים אותן על נייר 3 מ"מ. עם פיפטה פסטר, לכסות את כל פני השטח של השקופיות עםפתרון חסימה ( טבלה 2) עם ~ 0.5 מ"ל לכל שקופית. דגירה במשך 30 דקות בRT.
    8. הסר פתרון חסימה עודף וייבש את השקופיות עם רקמה מסביב לפרוסות. מקום 50 μL של הנוגדן הראשי(טבלה 3)מדולל בחסימת פתרון על המקטעים ולכסות עם כיסויים. מניחים את הפרוסות בצלחת חיסונית שהוכנה קודם לכן. דגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
    9. מעבירים את השקופיות לצנצנת היתד עם 50 מ"ל TBST (טבלה 2), תנו לכיסויים ליפול, ושטפו עם TBST למשך 5 דקות ו-3x.
    10. מקום 50 μL של הנוגדן המשני מדולל בחסימת פתרון על המקטעים ולכסות עם כיסויים. מניחים את הפרוסות בצלחת החיסונית שהוכנה קודם לכן. דגירה במשך 30 דקות ב RT, מוגן מפני אור.
    11. מעבירים את השקופיות שוב לצנצנת היתדות ושטפו עם 50 מ"ל TBST למשך 5 דקות ו-3x.
    12. מייבשים את השקופיות עם רקמה מסביב לפרוסות ומנחים את הפרוסות בצלחת חיסונית שהוכנה בעבר. הוסף 0.5 מ"ל של פתרון DAPI על פני כל פני השטח של השקופיות עם פיפטה פסטר. דגירה במשך 5 דקות ב RT.
    13. חזור על שלב 4.4.9.
    14. לייבש בזהירות את השקופיות עם טישו. להוסיף 50 μL של הרכבה בינונית טיפה אחר טיפה לאורך השקופית ולאחר מכן בזהירות להוריד כיסוי על כל שקופית, מעט כיפוף אותו כדי למנוע בועות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הפרוטוקול החל על ידי קידום צבירת תאים באמצעות 0.1 L bioreactors (איור 1A). חסון תא יחיד של iPSCs בוצע, עם 250,000 תאים / מ"ל זרעו ב 60 מ"ל של בינוני עם מהירות תסיסה של 27 סל"ד. זה הוגדר כיהי 0. לאחר 24 שעות, התאים יצרו ביעילות אגרגטים בצורת ספרואיד (יום 1, איור 1B),והמורפולוגיה נשמרה הי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הצורך במספרי תאים גדולים, כמו גם תנאי תרבות מוגדרים כדי ליצור סוגי תאים ספציפיים עבור סינון תרופות ויישומי רפואה רגנרטיבית כבר נהיגה בפיתוח של מערכות תרבות מדרגית. בשנים האחרונות דיווחו מספר קבוצות על הדור המדרגי של תובנים עצבייםונוירונים פונקציונליים 32,33

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים YH ו-SJ הם עובדים של PBS ביוטכנולוגיה. המחבר BL הוא מנכ"ל ומייסד שותף של PBS ביוטכנולוגיה, Inc. מחברים משתפי פעולה אלה השתתפו בפיתוח התורמים הביולוגיים המשמשים בכתב היד. כך אינו משנה את דבקות המחברים בכל המדיניות של היומן על שיתוף נתונים וחומרים. כל שאר המחברים לא מצהירים על ניגוד עניינים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), פורטוגל (UIDB/04565/2020 באמצעות Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, פרויקט N. 007317, PD/BD/105773/2014 ל-T.P.S ו-PD/BD/128376/2017 ל-D.E.S.N), פרויקטים במימון שיתוף של FEDER (POR Lisboa 2020– Programa Operacional Regional de Lisboa פורטוגל 2020) ו-FCT באמצעות מענק PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 ו-CEREBEX Generation של אורגנואידים המוח הקטן למענק מחקר אטקסיה LISBOA-01-0145-FEDER-029298. המימון התקבל גם מתכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי, במסגרת הסכם המענק מספר 739572 – מרכז התגליות לרפואה רגנרטיבית ודיוקה H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
3MM paperWHA3030861Merck
AccutaseA6964 - 500mLSigmacell detachment medium
Anti-BARHL1 AntibodyHPA004809Atlas Antibodies
Anti-Calbindin D-28k AntibodyCB28Millipore
Anti-MAP2 AntibodyM4403Sigma
Anti-N-Cadherin Antibody610921BD Transduction
Anti-NESTIN AntibodyMAB1259-SPR&D
Anti-OLIG2 AntibodyMABN50Millipore
Anti-PAX6 AntibodyPRB-278PCovance
Anti-SOX2 AntibodyMAB2018R&D
Anti-TBR1 AntibodyAB2261Millipore
Anti-TBR2 Antibodyab183991Abcam
Anti-TUJ1 Antibody801213Biolegend
Apo-transferrinT1147Sigma
BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM1 Kit5793 - 500mLStem cell tecnhnologies
Chemically defined lipid concentrate11905031ThermoFisher
Coverslips 24x60mm631-1575VWR
Crystallization-purified BSA5470Sigma
DAPI10236276001Sigma
Dibutyryl cAMPSC- 201567B -500mgFrilabo
DMEM-F1232500-035ThermoFisher
Fetal bovine serumA3840001ThermoFisher
Gelatin from bovine skinG9391Sigma
Glass Copling JarE94ThermoFisher
Glutamax I10566-016ThermoFisher
GlycineMB014001NZYtech
Ham’s F1221765029ThermoFisher
Human Episomal iPSC LineA18945ThermoFisheriPSC6.2
IMDM12440046ThermoFisher
Insulin91077CSigma
iPS DF6-9-9T.BWiCell
Iso-pentanePHR1661-2MLSigma
L-Ascorbic acidA-92902Sigma
Matrigel354230Corningbasement membrane matrix
MonothioglycerolM6154Sigma
Mowiol475904Milliporemounting medium
mTeSR185850 -500mlStem cell technologies
N2 supplement17502048ThermoFisher
Neurobasal12348017ThermoFisher
Paraformaldehyde158127Sigma
PBS-0.1 Single-Use VesselSKU: IA-0.1-D-001PBS Biotech
PBS-MINI MagDrive Base UnitSKU: IA-UNI-B-501PBS Biotech
Recombinant human BDNF450-02Peprotech
Recombinant human bFGF/FGF2100-18BPeprotech
Recombinant human FGF19100-32Peprotech
Recombinant human GDNF450-10Peprotech
Recombinant human SDF1300-28APeprotech
ROCK inhibitor Y-2763272302Stem cell technologies
SB431542S4317Sigma
SucroseS7903Sigma
SuperFrost Microscope slides12372098ThermoFisheradhesion microscope slides
Tissue-Tek O.C.T. Compound25608-930VWR
Tris-HCL 1MT3038-1LSigma
Triton X-1009002-93-1Sigma
Tween-20P1379Sigma
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.015575020ThermoFisher

References

  1. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Thomson, J. A. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  3. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  4. Ishida, Y., et al. Vulnerability of Purkinje Cells Generated from Spinocerebellar Ataxia Type 6 Patient-Derived iPSCs. Cell Reports. 17 (6), 1482-1490 (2016).
  5. Liu, Y., Zhang, S. C. Human stem cells as a model of motoneuron development and diseases. Annals of the New York Academy of Sciences. 1198, 192-200 (2010).
  6. Mariani, J., Coppola, G., Pelphrey, K. A., Howe, J. R., Vaccarino, F. M. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/ Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162 (2), 375-390 (2015).
  7. Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-Organization of Polarized Cerebellar Tissue in 3D Culture of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
  8. Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
  9. Aubry, L., et al. Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (43), 16707-16712 (2008).
  10. Gunhanlar, N., et al. A simplified protocol for differentiation of electrophysiologically mature neuronal networks from human induced pluripotent stem cells. Molecular Psychiatry. 23 (5), 1336-1344 (2018).
  11. Hu, B. Y., Zhang, S. C. Differentiation of spinal motor neurons from pluripotent human stem cells. Nature Protocols. 4 (9), 1295-1304 (2009).
  12. Jo, J., et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
  13. Muguruma, K., et al. Ontogeny-recapitulating generation and tissue integration of ES cell-derived Purkinje cells. Nature Neurosciences. 13 (10), 1171-1180 (2010).
  14. Watson, L. M., Wong, M. M. K., Vowles, J., Cowley, S. A., Becker, E. B. E. A Simplified Method for Generating Purkinje Cells from Human-Induced Pluripotent Stem Cells. The Cerebellum. 17 (4), 419-427 (2018).
  15. Wang, S., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons. Science Reports. 5, 9232(2015).
  16. Tao, O., et al. Efficient generation of mature cerebellar Purkinje cells from mouse embryonic stem cells. Journal of Neuroscience Research. 88 (2), 234-247 (2010).
  17. Croughan, M. S., Giroux, D., Fang, D., Lee, B. Novel Single-Use Bioreactors for Scale-Up of Anchorage-Dependent Cell Manufacturing for Cell Therapies. Stem Cell Manufacturing. , 105-139 (2016).
  18. Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144 (6), 976-985 (2017).
  19. Lou, Y. R., Leung, A. W. Next generation organoids for biomedical research and applications. Biotechnology Advances. 36 (1), 132-149 (2018).
  20. Silva, T. P., et al. Design Principles for Pluripotent Stem Cell-Derived Organoid Engineering. Stem Cells International. 2019, 1-17 (2019).
  21. Silva, T. P., et al. Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture. Frontiers of Bioengineering and Biotechnology. , (2020).
  22. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6 (4), 18293(2011).
  23. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  24. Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).
  25. Yaguchi, Y., et al. Fibroblast growth factor (FGF) gene expression in the developing cerebellum suggests multiple roles for FGF signaling during cerebellar morphogenesis and development. Developmental Dynamics. 238 (8), 2058-2072 (2008).
  26. Fischer, T., et al. Fgf15-mediated control of neurogenic and proneural gene expression regulates dorsal midbrain neurogenesis. Developmental Biology. 350 (2), 496-510 (2011).
  27. Bagri, A., et al. The chemokine SDF1 regulates migration of dentate granule cells. Development. 129 (18), 4249-4260 (2002).
  28. Bardy, C., et al. Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (20), 2725-2734 (2015).
  29. Bauwens, C. L., et al. Control of Human Embryonic Stem Cell Colony and Aggregate Size Heterogeneity Influences Differentiation Trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
  30. Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).
  31. Miranda, C. C., et al. Spatial and temporal control of cell aggregation efficiently directs human pluripotent stem cells towards neural commitment. Biotechnology Journal. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  32. Miranda, C. C., Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. Scaling up a chemically-defined aggregate-based suspension culture system for neural commitment of human pluripotent stem cells. Biotechnology Journal. 11 (12), 1628-1638 (2016).
  33. Bardy, J., et al. Microcarrier Suspension Cultures for High-Density Expansion and Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Neural Progenitor Cells. Tissue Engineering Part C Methods. 19 (2), 166-180 (2013).
  34. Rigamonti, A., et al. Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System. Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).
  35. Arora, N., et al. A process engineering approach to increase organoid yield. Development. 144 (6), 1128-1136 (2017).
  36. Gimeno, L., Martinez, S. Expression of chick Fgf19 and mouse Fgf15 orthologs is regulated in the developing brain by Fgf8 and Shh. Developmental Dynamics. 236 (8), 2285-2297 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

160

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved