JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает динамическую культурную систему для производства контролируемых агрегатов размеров человеческих плюрипотентных стволовых клеток и дальнейшего стимулирования дифференциации мозжечковых органоидов в условиях, свободных от химических и фидерных, с использованием одноразового биореактора.

Аннотация

Мозжечок играет важную роль в поддержании баланса и двигательной координации, а функциональный дефект в различных мозжечковых нейронах может вызвать мозжечковую дисфункцию. Большинство современных знаний о связанных с болезнями фенотипах нейронов основано на посмертных тканях, что затрудняет понимание прогрессирования и развития болезни. Модели животных и увековеченные клеточные линии также используются в качестве моделей для нейродегенеративных расстройств. Тем не менее, они не в полной мере повторить болезни человека. Индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) имеют большой потенциал для моделирования заболеваний и являются ценным источником регенеративных подходов. В последние годы генерация церебральных органоидов из iPSCs, полученных пациентом, улучшила перспективы моделирования нейродегенеративных заболеваний. Тем не менее, протоколы, которые производят большое количество органоидов и высокий выход зрелых нейронов в системах 3D культуры отсутствуют. Представленный протокол представляет если представить новый подход к воспроизводимому и масштабируемому поколению органоидов, полученных человеком iPSC, в химически определенных условиях с использованием масштабируемых одноразових биореакторов, в которых органоиды приобретают мозжечковую идентичность. Генерируемые органоиды характеризуются экспрессией специфических маркеров как на уровне мРНК, так и на уровне белка. Анализ конкретных групп белков позволяет выявлять различные популяции мозжечковых клеток, локализация которых важна для оценки органоидной структуры. Органоидная криозирование и дальнейшее иммуностеление органоидных ломтиков используются для оценки присутствия конкретных популяций мозжечковых клеток и их пространственной организации.

Введение

Появление плюрипотентных стволовых клеток человека (PSCs) представляет собой отличный инструмент для регенеративной медицины и моделирования заболеваний, потому что эти клетки могут быть дифференцированы в большинстве клеточных линийчеловеческого тела 1,2. С момента своего открытия, PSC дифференциации с использованием различных подходов, как сообщается, модели различных заболеваний, в том числе нейродегенеративных расстройств3,,4,,5,,6.

В последнее время появились сообщения о 3D-культурах, полученных из ПХК, напоминающих мозговые структуры человека; они называются органоидами мозга3,,7,,8. Поколение этих структур как из здоровых, так и для конкретных пациентов ПКС предоставляет ценную возможность для моделирования развития человека и расстройств нервного развития. Однако методы, используемые для создания этих хорошо организованных мозговых структур, трудно применить для их крупномасштабного производства. Для получения структур, которые достаточно велики, чтобы резюмировать морфогенез тканей без некроза внутри органоидов, протоколы полагаются на первоначальные нейронные обязательства в статических условиях, а затем инкапсуляции в гидрогелях и последующей культуры в динамическихсистемах 3. Однако такие подходы могут ограничить потенциальное масштабирование органоидного производства. Несмотря на то, что были предприняты усилия, чтобы направить дифференциацию PSC к определенным регионам центральной нервной системы, в том числе корковых, стриатальных, среднего мозга инейронов спинного мозга 9,10,11,12, генерация конкретных областей мозга в динамических условиях по-прежнему является проблемой. В частности, еще предстоит описать генерацию зрелых мозжечковых нейронов в 3D-структурах. Muguruma и др. впервые поколения культурных условий, которые recapitulate раннегомозжечка развития 13 и недавно сообщил протокол, который позволяет для человека эмбриональных стволовых клеток для создания поляризованной структуры напоминает первый триместр мозжечка7. Тем не менее, созревание мозжечковых нейронов в зарегистрированных исследованиях требует диссоциации органоидов, сортировки мозжечковых прародителей, и совместной культуры с клетками подачи всистеме культуры монослой 7,14,15,16. Таким образом, воспроизводимое поколение желаемых мозжечковых органоидов для моделирования заболеваний в определенных условиях по-прежнему является проблемой, связанной с культурой и изменчивостью источника подачи.

Этот протокол представляет оптимальные культурные условия для 3D-расширения и эффективной дифференциации человеческих ПКС на мозжечковые нейроны с использованием одноразовых вертикальных биореакторов колес (см. таблицу материалов для спецификаций), далее называемых биореакторами. Биореакторы оснащены большим вертикальным импеллером, который в сочетании с U-образным дном обеспечивает более однородное распределение снора внутри сосуда, позволяя нежному, равномерному смешиванию и подвеске частиц с уменьшенной скоростьювозбуждения 17. С помощью этой системы можно получить агрегаты клеток, контролируемые размером, что важно для более однородной и эффективной дифференциации. Кроме того, большее число органоидов, полученных из iPSC, может быть сгенерировано менее трудоемким образом.

Главной особенностью органоидов, которые являются 3D многоклеточные структуры обычно образуются из стволовых клеток, является самоорганизации различных типов клеток, которые образуют конкретные формы, как те, которыевидели в человеческих морфогенеза 18,19,20. Таким образом, органоидная морфология является важным критерием, который должен быть оценен в процессе дифференциации. Криозирование органоидов и дальнейшее иммуностентирование органоидных ломтиков с определенным набором антител позволяют пространственной визуализации молекулярных маркеров анализировать пролиферацию клеток, дифференциацию, идентичность популяции клеток и апоптоз. С помощью этого протокола, путем иммуностения органоидных cryosections, первоначальный эффективный нейронной приверженности наблюдается на7-й день дифференциации. Во время дифференциации наблюдается несколько популяций клеток с мозжечковой идентичностью. После 35 дней в этой динамической системе, мозжечковый нейроэпителий организуется вдоль апикобазальной оси, с апическим слоем размножающихся прародителей и базально расположенных постмитотических нейронов. Во время процесса созревания, с 35-90 дней дифференциации, различные типы мозжечковых нейронов можно увидеть, в том числе клетки Пуркинье (Calbindin+), гранулевые клетки (PAX6+/MAP2), Golgi клетки (Нейрогранин),однополярные клетки кисти (TBR2+), и глубокие мозжечковые ядра проекционныхнейронов(TBR1). Кроме того, незначительное количество клеточной смерти наблюдается в генерируемых мозжечковых органоидов после 90 дней в культуре.

В этой системе органоиды, полученные человеком iPSC, созревают в различные мозжечковые нейроны и выживают до 3 месяцев без необходимости диссоциации и кормушки кокультуры, обеспечивая источник мозжечковых нейронов человека для моделирования заболеваний.

протокол

1. Пассирование и техническое обслуживание человеческих iPSCs в культуре монослойных

  1. Приготовление тарелок
    1. Оттепель мембранной матрицы подвала (см.Таблица материалов) запас при 4 градусов по Цельсию и подготовить 60 йл aliquots. Заморозить aliquots при -20 градусов по Цельсию.
    2. Чтобы покрыть колодцы 6 хорошо пластины, оттепель один aliquot из подвала мембраны матрицы на льду. После размораживания добавьте от 60 мл до 6 мл DMEM-F12. Аккуратно resuspend путем трубопроводов вверх и вниз.
    3. Добавьте 1 мл разбавленного мембранного матричного раствора в каждую колодец из 6 хорошо пластины и инкубировать на RT, по крайней мере 1 ч до прохода или хранить при 4 кк до 1 недели.
  2. Пропуск колоний iPSC с помощью EDTA
    1. Поддержание iPSCs в культуре монослой в 6 пластинах в инкубаторе при 37 градусах Цельсия, 95% влажности и 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе были использованы три отдельные линии iPSC человека: F002.1A.1321, линия iPSC человека (iPSC6.2)22, и коммерчески полученная iPS-DF6-9-9T.B (см. таблицу материалов).
    2. Перед проходом инкубировать сохраненные пластины (шаг 1.1) при комнатной температуре (RT) в течение 15 минут и подготовить mTesR1 среды (Таблица 1).
    3. Аспирировать раствор из пластины с помощью серологического пипетки и сразу же добавить 0,5 мл mTeSR1 среды к каждой хорошо.
    4. Аспирировать оттябатый носитель из хорошо содержащего iPSCs и мыть один раз с помощью 1 мл 0,5 мМ EDTA на колодец.
    5. Добавьте 1 мл 0,5 мМ EDTA к каждой колодец и инкубировать на RT в течение 5 мин.
    6. Аспират EDTA и удалить клетки из скважин, аккуратно добавив mTeSR1 среды и трубопроводов колоний с помощью P1000 микропипец. Соберите клетки в конической трубке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не пипетки клетки вверх и вниз более чем в 3x.
    7. Добавьте 1 мл клеточной суспензии (разбавленной 1:4) к каждой хорошо, так что каждая хорошо содержит 1,5 мл среды после добавления подвески клетки. Возвращение ячеек в инкубатор при 5% CO2, 37 градусов по Цельсию.
    8. Замените израсходованную среду ежедневно и проход каждые 3 дня, когда достигается 75%-80% слияния.

2. Посев человеческих iPSCs в биореакторе

  1. Инкубировать iPSCs, выращенные в качестве монослой в mTeSR1 дополняется 10 МКМ ингибитора ROCK Y-27632 (ROCKi). Добавьте 1 мл дополненной среды к каждому хорошо из 6 хорошо пластины культуры ткани и инкубировать в течение 1 ч при 37 градусов по Цельсию, 95% влажности, и 5% CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ROCKi используется для защиты диссоциированных iPSCs от апоптоза23.
  2. После 1 ч инкубации, аспирировать провел среды из каждой хорошо и мыть 1x с 1 мл 1× PBS на колодец.
  3. Добавьте 1 мл среды отслоения клеток (см. Таблицу материалов)к каждому колодец 6 хорошо пластины и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 7 мин, пока клетки легко отделиться от колодцев с нежной тряски.
  4. Pipette клеточного отслоения среды вверх и вниз с P1000 микропипетты, пока клетки отсоединиться и разобщиться на одиночные клетки. Добавьте 2 мл полной клеточной культуры среды к каждому хорошо, чтобы инактивировать энзиматическое пищеварение и пипетки клетки осторожно в стерильной конической трубки.
  5. Центрифуга при 210 × г в течение 3 мин и удалить супернатант.
  6. Повторное использование клеточных гранул в среде культуры (т.е. mTeSR1, дополненное 10 МКМ ROCKi) и подсчитайте iPSCs с гемоцитометром с помощью трипан-голубого красителя.
  7. Семя 15 × 106 одиночных клеток в биореакторе (максимальный объем 100 мл) с 60 мл mTeSR1 дополнено 10 МКМ ROCKi при конечной плотности клеток 250 000 клеток/мл.
  8. Вставьте сосуд, содержащий iPSCs, в универсальный базовый блок, помещенный в инкубатор при 37 градусах Цельсия, влажности 95% и 5% CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Биореактор перемешивания поддерживается в течение 24 ч, установив универсальный базовый блок управления до 27 об / мин для содействия агрегации iPSC.

3. Дифференциация и созревание агрегатов, полученных человеком iPSC, в мозжечковых органоидах

  1. Определите день посева одной клетки как день 0.
  2. На 1 день соберите 1 мл образца агрегатов iPSC с помощью серологического пипетки. Поддерживайте биореактор под агитацией, как и прежде, помещая универсальный базовый блок с биореактором, содержащим агрегаты в стерильном потоке перед сбором образца. Плита клеточной подвески в ультра-низком крепление 24 хорошо пластины. Убедитесь, что формируются агрегаты, полученные из iPSC.
  3. Приобретайте изображения с помощью оптического микроскопа, используя общее увеличение 40x или 100x для измерения совокупного диаметра.
  4. Измерьте область агрегатов на каждом изображении с помощью программного обеспечения FIJI.
    1. Выберите "Анализ Установите измерения "из бара меню и нажмите на "Area" и "OK".
    2. Выбрать" Файл Откройте" из бара меню, чтобы открыть сохраненный файл изображения. Выберите инструмент выбора строки, представленный в баре инструментов, и создайте прямую линию над строкой масштаба, представленной на изображении. Выберите" Анализ Установите шкалу" из бара меню.
    3. В "Известноерасстояние" добавить просторы масштаба бар изображения в мкм. Определите"Единицу длины"как мкм. Нажмите накнопку"Глобальный", чтобы сохранить настройки и"OK". Выберите Овальный выбор в баре инструментов.
    4. Для каждого агрегата разграничить область овальным инструментом. Выберите" Анализ Мера". Рассчитайте их диаметр на основе измеренной площади, учитывая, что агрегаты примерно сферические
      figure-protocol-6143
      с A в качестве области агрегата.
  5. Когда средний диаметр агрегатов составляет 100 мкм, замените 80% отраченной среды свежим mTeSR1 без ROCKi. Когда агрегаты достигают 200–250 мкм в диаметре, замените всю оттяженную среду на gfCDM(таблица 1), позволяяорганоидам осесть в нижней части биореактора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если средний совокупный диаметр превышает 350 мкм, не начинайте протокол дифференциации. Повторите посев одиночных клеток. Как правило, это занимает около 1 дня для совокупности, чтобы достичь среднего диаметра 100 мкм.
  6. Вставьте биореактор, содержащий агрегаты, в универсальный базовый блок, помещенный в инкубатор при 37 градусах Цельсия, 95% влажности и 5% CO2.
  7. Снижение биореакторной агитации до 25 об/мин.
  8. На второй день повторите шаги 3.2, 3.3 и 3.4 для оценки совокупного диаметра. Добавьте 30 МКЛ FGF2 (окончательная концентрация, 50 нг/мл) и 60 мкл SB431542 (окончательная концентрация, 10 МКМ) до 60 мл среды дифференциации gfCDM(таблица 1). Замените всю оттяготую среду из биореактора на дополненный gfCDM. Повторите шаг 3.6.
    ПРИМЕЧАНИЕ: SB431542 имеет решающее значение для ингибирования мезендодермальной дифференциации, вызывая нейроннуюдифференциацию 24. FGF2 используется для содействия каудализации нейроэпителиальной ткани25.
  9. На 5-й день повторите шаги 3.2, 3.3, 3.4 и 3.8.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Совокупный размер должен увеличиваться во время протокола дифференциации. Тем не менее, диаметр имеет решающее значение только тогда, когда начинается дифференциация, потому что этот параметр может повлиять на эффективность дифференциации.
  10. На 7-й день повторите шаги 3.2, 3.3 и 3.4. Разбавить FGF2 и SB431542 до 2/3: Добавить 20 МКЛ FGF2 и 40 МКЛ SB431542 до 60 мл gfCDM дифференциации среды. Замените всю оттяготую среду из биореактора на дополненный gfCDM. Повторите шаг 3.6 и увеличьте возбуждение биореактора до 30 об/мин.
  11. На 14-й день повторите шаги 3.2, 3.3 и 3.4. Добавьте 60 мл FGF19 (окончательная концентрация, 100 нг/мл) до 60 мл среды дифференциации gfCDM. Замените всю оттяготую среду из биореактора на gfCDM, дополненную FGF19. Повторите шаг 3.6.
    ПРИМЕЧАНИЕ: FGF19 используется для содействия поляризации структур среднего заднего мозга26.
  12. На 18-й день повторите шаги 3.2, 3.3, 3.4 и 3.11.
  13. На 21-й день повторите шаги 3.2, 3.3 и 3.4. Замените всю оттягченную среду биореактора полной нейробазальной средой(таблица 1). Повторите шаг 3.6.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нейробазальная среда является базальной средой, используемой для поддержания популяции нейронных клеток ворганоиде 7.
  14. На 28-й день повторите шаги 3.2, 3.3 и 3.4. Добавьте 180 МЛ SDF1 (окончательная концентрация, 300 нг/мл) до 60 мл полной нейробазальной среды. Замените всю оттяготую среду биореактора полной нейробазальной средой, дополненной SDF1. Повторите шаг 3.6.
    ПРИМЕЧАНИЕ: SDF1 используется для облегчения организации различных слоев клеток27.
  15. На 35-й день повторите шаги 3.2, 3.3 и 3.4. Замените всю оттяготую среду из биореактора на полную среду BrainPhys(таблица 1). Повторите шаг 3.6.
    ПРИМЕЧАНИЕ: BrainPhys является нейрональной среды, которая поддерживает синаптически активных нейронов28.
  16. Заменить 1/3 от общего объема каждые 3 дня с полным BrainPhys среды до дня 90 дифференциации.

4. Подготовка органоидов для криозирования и иммуногистохимии

  1. Сбор органоидов для иммуностимулирования
    1. Соберите 1 мл образца среды, содержащей органоиды с серологическим пипеткой от биореактора до конической трубки 15 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды должны быть собраны в разные моменты времени для оценки эффективности дифференциации, в том числе дней 7, 14, 21, 35, 56, 70, 80 и 90.
    2. Удалить супернатант и мыть один раз с 1 мл 1× PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не центрифугировать органоиды. Пусть органоиды оседают на дне трубки под действием силы тяжести.
    3. Удалите супернатант и добавьте 1 мл 4% параформальдегида (PFA). Инкубировать при 4 градусов по Цельсию в течение 30 мин. Удалите оттраченную PFA и добавьте 1 мл 1× PBS.
    4. Храните органоиды в 1 мл 1× при 4 градусов по Цельсию до обработки для криозирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Храните органоиды в 1x PBS в течение не более 1 недели после фиксации.
  2. Подготовка органоидов для криозирования
    1. Удалите супернатант из хранимых органоидов. Добавить 1 мл 15% сахарозы (w/v, разбавленной в 1× PBS), хорошо перемешать нежным закрученного, и инкубировать на ночь при 4 градусов по Цельсию.
    2. Приготовьте раствор 15% сахарозы/7,5% желатина(таблица 2)и поддерживайте при 37 градусах цельсия во время приготовления, чтобы избежать затвердеть желатина.
    3. Удалите 15% раствор сахарозы, добавьте 1 мл 15% сахарозы/7,5% желатина в органоиды и быстро перемешайте с помощью нежного закрученного. Инкубационный при 37 градусов по Цельсию в течение 1 ч.
    4. Добавьте 15% раствора сахарозы/7,5% желатина в пластиковый контейнер до половины его объема. Дождись затвердевания в RT.
    5. После инкубации 1 ч осторожно поместите сахарозу/желатиновую каплю, содержащую органоиды, на затвердеевого желатина с пипеткой Pasteur. Оставьте затвердевать на RT около 15 минут. Убедитесь в том, чтобы избежать образования пузырьков.
    6. Поместите 15% сахарозы/7,5% желатина поверх органоидов до тех пор, пока контейнер не будет заполнен. Дождись полной затвердевания на RT.
    7. После затвердевания инкубировать 20 мин при 4 градусов по Цельсию.
    8. Разрежьте желатин на кубик, содержащий органоиды в центре, и зафиксните кубик желатина на куске картона каплей соединения O.C.T.
    9. Поместите 250 мл изопентанов в чашку 500 мл и заполните соответствующий контейнер жидким азотом. Используя типсы и толстые перчатки, аккуратно поместите чашку, содержащую изопентан, на поверхность жидкого азота и охладьте изопентан до -80 градусов по Цельсию.
    10. Когда -80 градусов по Цельсию достигнут, поместите кубик желатина в чашку, содержащую изопентан, пока он не замерзнет, сохраняя температуру на уровне -80 градусов по Цельсию. В зависимости от размера куба, это может занять 1-2 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте температуры ниже -80 градусов по Цельсию или чрезмерного времени замораживания, потому что это может привести к растрескиванию куба.
    11. При заморозке быстро храните кубик желатина при -80 градусов по Цельсию и храните до криозирования.
  3. Криозирование органоидов
    1. Включите криостат и определите температуру как образца (OT), так и криокамбера (КТ) при температуре -25 градусов по Цельсию.
    2. Когда обе температуры стабилизируются, зафиксните кубик желатина, содержащий органоиды на образце, используя соединение O.C.T.
    3. Определите толщину секции на уровне 12 мкм.
    4. Вырезать куб и собирать 3-4 ломтика на слайдах адгезионные микроскопы (см. Таблицу материалов).
    5. Хранить при -20 градусов по Цельсию до использования.
  4. Иммуностимулирование ломтиков органоидов
    1. Поместите слайды микроскопа, содержащие органоидные секции, в коплинг банку с 50 мл предварительно 1x PBS, держа до 10 слайдов спина к спине.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все органоидные секции должны быть погружены в жидкость.
    2. Инкубировать в течение 45 мин при 37 градусов по Цельсию, чтобы дегелатинизировать слайды.
    3. Вымойте 1x с 50 мл 1× PBS в течение 5 минут на RT: Передача слайдов в коплинг банку, содержащую свежие 1× PBS.
    4. Перенесите слайды в коплинг банку, содержащую 50 мл свежеприготовленногоглицина (таблица 2)и инкубировать в течение 10 минут на RT.
    5. Перенесите слайды в коплинговую банку, содержащую 50 мл 0,1% тритона(таблица 2)и пронизываете в течение 10 минут на RT.
    6. Вымойте с 1× PBS в течение 5 мин 2x.
    7. Приготовьте иммуностеинированную тарелку с 3-мм бумагой, пропитанной 1× PBS. Сухие слайды с тканью вокруг ломтиков и поместить их на 3 мм бумаги. С помощью пипетки Pasteur накройте всю поверхность слайдов блокирующимраствором (таблица 2)с 0,5 мл на слайд. Инкубация в течение 30 минут на RT.
    8. Удалите избыток блокирующего раствора и высушите слайды салфеткой по всему ломтикам. Поместите 50 МКЛ первичного антитела(таблица 3), разбавленного блокирующим раствором над секциями и накройте крышками. Поместите ломтики в ранее приготовленное иммуностеинирование блюдо. Инкубировать на ночь при 4 градусов по Цельсию.
    9. Перенесите слайды в банку коплинга с 50 мл TBST(таблица 2),пусть крышки падают, и мыть с TBST в течение 5 мин 3x.
    10. Поместите 50 МКЛ вторичного антитела, разбавленного в блокирующий раствор над секциями и накройте крышками. Поместите ломтики в ранее приготовленное иммуностеинирование блюдо. Инкубировать в течение 30 минут на RT, защищены от света.
    11. Передача слайдов в коплинг банку снова и мыть с 50 мл TBST в течение 5 мин 3x.
    12. Высушите горки с тканью вокруг ломтиков и поместите ломтики в ранее приготовленное блюдо иммуностеинирования. Добавьте 0,5 мл раствора DAPI по всей поверхности слайдов с пипеткой Pasteur. Инкубация в течение 5 минут на RT.
    13. Повторите шаг 4.4.9.
    14. Аккуратно высушите горки салфеткой. Добавьте 50 МКЛ монтажа среднего капля за каплей вдоль слайда, а затем осторожно опустите крышку на каждый слайд, слегка согнув его, чтобы избежать пузырьков.

Результаты

Протокол был инициирован путем поощрения агрегации клеток с использованием биореакторов 0,1 л(рисунок 1A). Была проведена одноклеточная прививка iPSCs, при этом 250 000 клеток/мл посеяны в 60 мл среды со скоростью возбуждения 27 об/мин. Это было определено как день 0. После 24 ч, клет...

Обсуждение

Потребность в больших количествах клеток, а также определенных культурных условиях для создания конкретных типов клеток для скрининга наркотиков и применения регенеративной медицины является движущей силой развития масштабируемых систем культуры. В последние годы несколько групп с...

Раскрытие информации

Авторы YH и SJ являются сотрудниками PBS Biotech. Автор BL является генеральным директором и соучредителем PBS Biotech, Inc. Эти сотрудничающие авторы участвовали в разработке биореакторов, используемых в рукописи. Это не меняет приверженности авторов всем политикам журнала по обмену данными и материалами. Все остальные авторы не заявляют о конфликте интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Funda'o para a Ci'ncia e a Tecnologia (FCT), Португалия (UIDB/04565/2020 через Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Проект N. 007317, PD/BD/105773/2014 до T.P.S и PD/BD/128376/2017 до D.E.S.N.), проекты, совместно финансируемые FEDER (POR Lisboa 2020-Programa Operacional Regional de Lisboa) PORTUGAL 2020) и FCT через грант PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 и CEREBEX Поколение мозжечковых органоидов для Ataxia Research грант LISBOA-01-0145-FEDER-029298. Финансирование было также получено из Программы исследований и инноваций Европейского союза Horizon 2020 в соответствии с Грант-соглашением No 739572 -Центр регенеративной и точной медицины H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
3MM paperWHA3030861Merck
AccutaseA6964 - 500mLSigmacell detachment medium
Anti-BARHL1 AntibodyHPA004809Atlas Antibodies
Anti-Calbindin D-28k AntibodyCB28Millipore
Anti-MAP2 AntibodyM4403Sigma
Anti-N-Cadherin Antibody610921BD Transduction
Anti-NESTIN AntibodyMAB1259-SPR&D
Anti-OLIG2 AntibodyMABN50Millipore
Anti-PAX6 AntibodyPRB-278PCovance
Anti-SOX2 AntibodyMAB2018R&D
Anti-TBR1 AntibodyAB2261Millipore
Anti-TBR2 Antibodyab183991Abcam
Anti-TUJ1 Antibody801213Biolegend
Apo-transferrinT1147Sigma
BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM1 Kit5793 - 500mLStem cell tecnhnologies
Chemically defined lipid concentrate11905031ThermoFisher
Coverslips 24x60mm631-1575VWR
Crystallization-purified BSA5470Sigma
DAPI10236276001Sigma
Dibutyryl cAMPSC- 201567B -500mgFrilabo
DMEM-F1232500-035ThermoFisher
Fetal bovine serumA3840001ThermoFisher
Gelatin from bovine skinG9391Sigma
Glass Copling JarE94ThermoFisher
Glutamax I10566-016ThermoFisher
GlycineMB014001NZYtech
Ham’s F1221765029ThermoFisher
Human Episomal iPSC LineA18945ThermoFisheriPSC6.2
IMDM12440046ThermoFisher
Insulin91077CSigma
iPS DF6-9-9T.BWiCell
Iso-pentanePHR1661-2MLSigma
L-Ascorbic acidA-92902Sigma
Matrigel354230Corningbasement membrane matrix
MonothioglycerolM6154Sigma
Mowiol475904Milliporemounting medium
mTeSR185850 -500mlStem cell technologies
N2 supplement17502048ThermoFisher
Neurobasal12348017ThermoFisher
Paraformaldehyde158127Sigma
PBS-0.1 Single-Use VesselSKU: IA-0.1-D-001PBS Biotech
PBS-MINI MagDrive Base UnitSKU: IA-UNI-B-501PBS Biotech
Recombinant human BDNF450-02Peprotech
Recombinant human bFGF/FGF2100-18BPeprotech
Recombinant human FGF19100-32Peprotech
Recombinant human GDNF450-10Peprotech
Recombinant human SDF1300-28APeprotech
ROCK inhibitor Y-2763272302Stem cell technologies
SB431542S4317Sigma
SucroseS7903Sigma
SuperFrost Microscope slides12372098ThermoFisheradhesion microscope slides
Tissue-Tek O.C.T. Compound25608-930VWR
Tris-HCL 1MT3038-1LSigma
Triton X-1009002-93-1Sigma
Tween-20P1379Sigma
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.015575020ThermoFisher

Ссылки

  1. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Thomson, J. A. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  3. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  4. Ishida, Y., et al. Vulnerability of Purkinje Cells Generated from Spinocerebellar Ataxia Type 6 Patient-Derived iPSCs. Cell Reports. 17 (6), 1482-1490 (2016).
  5. Liu, Y., Zhang, S. C. Human stem cells as a model of motoneuron development and diseases. Annals of the New York Academy of Sciences. 1198, 192-200 (2010).
  6. Mariani, J., Coppola, G., Pelphrey, K. A., Howe, J. R., Vaccarino, F. M. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/ Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162 (2), 375-390 (2015).
  7. Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-Organization of Polarized Cerebellar Tissue in 3D Culture of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
  8. Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
  9. Aubry, L., et al. Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (43), 16707-16712 (2008).
  10. Gunhanlar, N., et al. A simplified protocol for differentiation of electrophysiologically mature neuronal networks from human induced pluripotent stem cells. Molecular Psychiatry. 23 (5), 1336-1344 (2018).
  11. Hu, B. Y., Zhang, S. C. Differentiation of spinal motor neurons from pluripotent human stem cells. Nature Protocols. 4 (9), 1295-1304 (2009).
  12. Jo, J., et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
  13. Muguruma, K., et al. Ontogeny-recapitulating generation and tissue integration of ES cell-derived Purkinje cells. Nature Neurosciences. 13 (10), 1171-1180 (2010).
  14. Watson, L. M., Wong, M. M. K., Vowles, J., Cowley, S. A., Becker, E. B. E. A Simplified Method for Generating Purkinje Cells from Human-Induced Pluripotent Stem Cells. The Cerebellum. 17 (4), 419-427 (2018).
  15. Wang, S., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons. Science Reports. 5, 9232 (2015).
  16. Tao, O., et al. Efficient generation of mature cerebellar Purkinje cells from mouse embryonic stem cells. Journal of Neuroscience Research. 88 (2), 234-247 (2010).
  17. Croughan, M. S., Giroux, D., Fang, D., Lee, B. Novel Single-Use Bioreactors for Scale-Up of Anchorage-Dependent Cell Manufacturing for Cell Therapies. Stem Cell Manufacturing. , 105-139 (2016).
  18. Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144 (6), 976-985 (2017).
  19. Lou, Y. R., Leung, A. W. Next generation organoids for biomedical research and applications. Biotechnology Advances. 36 (1), 132-149 (2018).
  20. Silva, T. P., et al. Design Principles for Pluripotent Stem Cell-Derived Organoid Engineering. Stem Cells International. 2019, 1-17 (2019).
  21. Silva, T. P., et al. Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture. Frontiers of Bioengineering and Biotechnology. , (2020).
  22. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6 (4), 18293 (2011).
  23. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  24. Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).
  25. Yaguchi, Y., et al. Fibroblast growth factor (FGF) gene expression in the developing cerebellum suggests multiple roles for FGF signaling during cerebellar morphogenesis and development. Developmental Dynamics. 238 (8), 2058-2072 (2008).
  26. Fischer, T., et al. Fgf15-mediated control of neurogenic and proneural gene expression regulates dorsal midbrain neurogenesis. Developmental Biology. 350 (2), 496-510 (2011).
  27. Bagri, A., et al. The chemokine SDF1 regulates migration of dentate granule cells. Development. 129 (18), 4249-4260 (2002).
  28. Bardy, C., et al. Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (20), 2725-2734 (2015).
  29. Bauwens, C. L., et al. Control of Human Embryonic Stem Cell Colony and Aggregate Size Heterogeneity Influences Differentiation Trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
  30. Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).
  31. Miranda, C. C., et al. Spatial and temporal control of cell aggregation efficiently directs human pluripotent stem cells towards neural commitment. Biotechnology Journal. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  32. Miranda, C. C., Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. Scaling up a chemically-defined aggregate-based suspension culture system for neural commitment of human pluripotent stem cells. Biotechnology Journal. 11 (12), 1628-1638 (2016).
  33. Bardy, J., et al. Microcarrier Suspension Cultures for High-Density Expansion and Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Neural Progenitor Cells. Tissue Engineering Part C Methods. 19 (2), 166-180 (2013).
  34. Rigamonti, A., et al. Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System. Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).
  35. Arora, N., et al. A process engineering approach to increase organoid yield. Development. 144 (6), 1128-1136 (2017).
  36. Gimeno, L., Martinez, S. Expression of chick Fgf19 and mouse Fgf15 orthologs is regulated in the developing brain by Fgf8 and Shh. Developmental Dynamics. 236 (8), 2285-2297 (2007).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

160

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены