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摘要

该协议描述了一个动态培养系统，用于利用一种一种用途的生物反应器，产生控制大小的人类多能干细胞，进一步刺激在化学定义和免饲料条件下小脑器官的分化。

摘要

小脑在维持平衡和运动协调中起着至关重要的作用，不同小脑神经元的功能缺陷可以触发小脑功能障碍。目前关于疾病相关神经元表型的知识大部分基于死后组织，这使得对疾病进展和发育的理解变得困难。动物模型和不朽的细胞系也被用作神经退行性疾病的模型。然而，他们不能完全概括人类疾病。人类诱导多能干细胞（iPSCs）在疾病建模方面潜力巨大，为再生方法提供了宝贵的来源。近年来，来自患者衍生的 iPSC 的脑器官的生成改善了神经退行性疾病建模的前景。然而，在三D培养系统中，缺乏产生大量器官和高产成熟神经元的协议。所提出的协议是使用可扩展的一次使用生物反应器在化学定义条件下可重复和可扩展生成人类 iPSC 衍生器官的新方法，其中有机体获得小脑特性。生成的器官的特点是在mRNA和蛋白质水平上表达特定的标记。对特定蛋白质组的分析可以检测不同的小脑细胞群，其定位对于组织结构的评价非常重要。器官冷冻和进一步免疫污染器官切片用于评估特定小脑细胞群的存在及其空间组织。

引言

人类多能干细胞（PSCs）的出现是再生医学和疾病建模的极佳工具，因为这些细胞可以分化成人体1、2的多数细胞系。自从他们发现以来，PSC分化使用不同的方法被报告为不同的疾病建模，包括神经退行性疾病3，4，5，6。,4,5,6

最近，有报道说，3D培养物来自类似于人类大脑结构的PSC;这些被称为大脑器官3，7，8。,83,这些结构的生成来自健康和患者特定的PSC提供了一个宝贵的机会来模拟人类发展和神经发育障碍。然而，用于生成这些组织良好的脑结构的方法很难应用于其大规模生产。为了产生足够大的结构，以重述组织形态，而不在器官内坏死，协议依赖于在静态条件下的初始神经承诺，然后封装在水凝胶和随后的培养在动态系统3。然而，这种办法可能限制器官生产的潜在扩大。尽管已经努力将PSC分化到中枢神经系统的特定区域，包括皮质、神经、中脑,和脊髓神经元9、10、11、12，,10但动态条件下的特定大脑区域的生成仍然是一个挑战。11,12特别是，3D结构中成熟的小脑神经元的生成尚未描述。Muguruma等人开创了培养条件的产生，重新概括了早期小脑发育13，最近报告了一个方案，允许人类胚胎干细胞产生一个极化结构，让人联想到头三个月小脑7。然而，在报告研究中，小脑神经元的成熟需要器官分离，小脑祖细胞的排序，并在,单层培养系统7、14、15、16,14中与馈养细胞15共同培养。因此，在定义的条件下，用于疾病建模所需的小脑器官的可重复生成仍然是与培养和馈送源变异相关的挑战。

该协议提供了使用一用垂直轮生物反应器（参见规格材料表），即使用一种使用垂直轮生物反应器将人类PSC有效分化成小脑神经元Table of Materials的最佳培养条件，以下简称生物反应器。生物反应器配有大型垂直叶轮，与U形底部结合，在容器内提供更均匀的剪切分布，允许温和、均匀的混合和颗粒悬浮，降低搅拌速度17。有了这个系统，可以获得形状和大小控制的细胞聚合体，这对更均匀、更高效的分化非常重要。此外，更多的 iPSC 衍生器官可以以不太费力的方式生成。

器官的主要特征是通常由干细胞形成的3D多细胞结构，是不同细胞类型的自组织，形成特定形状，如人类形态18、19、20,19,中所看到的形状。因此，有机形态是分化过程中需要评价的重要标准。使用一组特定抗体对器官进行冷冻和进一步免疫渗透，使分子标记在空间上可视化，以分析细胞增殖、分化、细胞种群特性和凋亡。有了这个协议，通过免疫控制器官冷冻，在分化的第7天观察到了一个初始有效的神经承诺。在分化过程中，观察到几个具有小脑特征的细胞群。在这个动态系统中35天后，小脑神经皮皮沿着一个轴线组织，有一个增殖的祖细胞和基本定位的后层神经元。在成熟过程中，从第35~90天的分化，可以看到不同类型的小脑神经元，包括Purkinje细胞（卡尔宾丁+），颗粒细胞（PAX6+/MAP2+），高尔基细胞（神经粒蛋白+），单极刷细胞（TBR2+），和深小脑核投影+神经元（TBR1+）。+此外，在培养的90天后，在生成的小脑器官中观察到不重要的细胞死亡量。

在这个系统中，人类 iPSC 衍生的器官成熟成不同的小脑神经元，存活长达 3 个月，无需分离和喂食共培养，为疾病建模提供了人类小脑神经元的来源。

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研究方案

1. 在单层文化中传传和维护人类 iPSC

  1. 板材的制备
    1. 在4°C下 解冻基底膜基质（见材料表）库存，制备60μL等分。将等分在-20°C下冷冻。
    2. 要覆盖6孔板的孔，在冰上解冻地下室膜基质的一个等分。解冻后，将 DMEM-F12 的 60 μL 添加到 6 mL。通过上下移液轻轻重新暂停。
    3. 将 1 mL 稀释的地下膜基质溶液添加到 6 孔板的每个孔中，并在 RT 中孵育至少 1 小时，然后以 4°C 进行传通或储存长达 1 周。
  2. 与 Edta 的 iPSC 殖民地的传递
    1. 在 37 °C、95% 湿度和 5% CO2下，在孵化器中的 6 个孔板中保持单层培养中的 iPSC。
      注:在该协议中，使用了三条不同的人类 iPSC 线:F002.1A.1321、人类表皮 iPSC 线路 （iPSC6.2）22以及商业获得的 iPS-DF6-9-9T.B（ 参见材料表）。
    2. 在传世前，在室温 （RT） 下孵育存储板（步骤 1.1）15 分钟，并准备 mTesR1 介质（表 1）。
    3. 使用血清移液器从板中吸出溶液，并立即向每个井添加 0.5 mL 的 mTeSR1 介质。
    4. 从含有 iPSC 的井中吸出已用介质，每井使用 1 mL 0.5 mM EDTA 洗涤一次。
    5. 将 1 mL 的 0.5 mM EDTA 添加到每一个井中，并在 RT 中孵育 5 分钟。
    6. 通过轻轻添加 mTeSR1 介质并使用 P1000 微管移液菌落，吸气 EDTA 并从孔中去除细胞。将细胞收集在圆锥管中。
      注:不要移液细胞向上和向下超过3倍。
    7. 在每个井中加入1 mL的细胞悬浮液（稀释的1:4），使每一个井在加入细胞悬浮液后含有1.5 mL的介质。将细胞在5%CO2，37°C下返回培养箱。2
    8. 当达到 75% -80% 的汇合时，每 3 天更换一次已花的介质和通道。

2. 在生物反应器中播种人类 iPSC

  1. 孵育在mTeSR1中作为单层生长的iPSCs，辅以10μM的ROC抑制剂Y-27632（ROCKi）。从6井组织培养板向每井加入1 mL的补充剂介质，在37°C、95%的湿度和5%的CO2下孵育1小时。
    注:ROCKi用于保护分离的iPSCs免受凋亡23。
  2. 孵育1小时后，从每井中吸出花期介质，用每井1 mL的1×PBS洗涤1倍。
  3. 将1 mL的细胞分离介质（ 见材料表）添加到6孔板的每个孔中，并在37°C下孵育7分钟，直到细胞通过轻轻的摇动轻松从孔中分离。
  4. 用P1000微移子上下移液细胞分离介质，直到细胞分离并分离成单个细胞。将2 mL的完整细胞培养培养素添加到每孔中，以灭活酶消化，将细胞轻轻移液到无菌锥形管中。
  5. 在210×3分钟，取出上g一代。
  6. 在培养基中重新发送细胞颗粒（即 mTeSR1 辅以 10 μM 的 ROCKi），并使用 trypan 蓝色染料用血细胞计计数 iPC。
  7. 15 × 106 个 细胞在生物反应器中（最大体积为 100 mL），60 mTeSR1，在最终细胞密度为 250，000 细胞/mL 时辅以 10 μM 的 ROCKi。
  8. 将含有 iPC 的容器插入置于 37 °C、95% 湿度和 5% CO 2 的通用基单元中。
    注:通过将通用基单元控制设置为 27 rpm，将生物反应器搅拌保持 24 小时，以促进 iPSC 聚合。

3. 小脑器官中人类 iPSC 衍生集料的分化和成熟

  1. 将单细胞种子的日定义为第 0 天。
  2. 第 1 天，使用血清移液器收集 1 mL 的 iPSC 聚合样品。在采集样品之前，将通用基单元与含有集料的生物反应器放在无菌流中，将生物反应器保持与以前一样在搅拌下。将电池悬浮板放在超低附件 24 井板中。检查 iPSC 派生的聚合是否形成。
  3. 使用光学显微镜使用 40 倍或 100 倍的总放大倍率测量聚合直径，获取图像。
  4. 使用 FIJI 软件测量每个图像中的聚合区域。
    1. 选择 "分析 | 设置测量" 从菜单栏，然后单击"区域"和"确定"。
    2. 选择"文件 | 从菜单栏中打开"以打开存储的图像文件。选择工具栏中显示的线条选择工具，并在图像中显示的缩放栏上创建直线。选择"分析 | 从菜单栏中设置比例"。
    3. 在 "已知距离"中，以 μm 为单位添加图像比例条的扩展。将 "长度单位"定义为 μm 。点击 [全局] 以维护设置和 [确定].在 工具栏中选择 "椭圆形选择"。
    4. 对于每个聚合，使用椭圆形工具描绘区域。选择"分析 | 测量".计算其直径基于测量面积，考虑到聚合是大约球形使用
      figure-protocol-2764
      A 作为聚合的区域。
  5. 当集料的平均直径为 100 μm 时，将 80% 的已用介质替换为不带 ROCKi 的新鲜 mTeSR1。当集料直径达到200~250μm时，用g方可换的介质（表1），让器官在生物反应器底部沉淀。
    注:如果平均聚合直径超过 350 μm，请勿启动分化协议。重复单细胞的种子。通常，集料大约需要 1 天才能达到 100 μm 的平均直径。
  6. 将含有集料的生物反应器插入置于37°C、95%湿度和5%CO 2的培养箱中的通用基单元中。
  7. 将生物反应器搅拌降低至 25 rpm。
  8. 第 2 天，重复步骤 3.2、3.3 和 3.4 以评估聚合直径。将 30 μL 的 FGF2（最终浓度，50 纳克/mL）和 60 μL 的 SB431542（最终浓度，10 μM）添加到 60 mL 的 gfCDM 分化介质（表 1.用补充的 gfCDM 更换生物反应器中所有已用的介质。重复步骤 3.6。
    注:SB431542是抑制中分分化的关键，诱导神经分化24。FGF2用于促进神经皮内组织25的结化。
  9. 第 5 天，重复步骤 3.2、3.3、3.4 和 3.8。
    注:在差异化协议期间，聚合大小应增加。但是，直径只有在开始区分时才至关重要，因为此参数可能会影响分化的有效性。
  10. 第 7 天，重复步骤 3.2、3.3 和 3.4。将 FGF2 和 SB431542 稀释至 2/3:加入 20 μL 的 FGF2 和 40 μL 的 SB431542 至 60 mL 的 gfCDM 分化介质。用补充的 gfCDM 更换生物反应器中所有已用的介质。重复步骤 3.6，将生物反应器搅拌量提高至 30 rpm。
  11. 第 14 天，重复步骤 3.2、3.3 和 3.4。加入60μL的FGF19（最终浓度，100纳克/mL）到60 mL的g方可分型介质。用与FGF19补充的 gfCDM 更换生物反应器中所有已用的介质。重复步骤 3.6。
    注:FGF19用于促进中后脑结构26的两极分化。
  12. 第 18 天，重复步骤 3.2、3.3、3.4 和 3.11。
  13. 第 21 天，重复步骤 3.2、3.3 和 3.4。用完整的神经基质替换生物反应器上所有已用的介质（表1）。重复步骤 3.6。
    注:神经基础介质是一种基础介质，用于维持器官7内的神经元细胞种群。
  14. 第 28 天，重复步骤 3.2、3.3 和 3.4。加入180μL的SDF1（最终浓度，300纳克/mL）到60mL的完整神经基础介质。用完整的神经基础介质替换生物反应器中所有已用的介质，并辅以SDF1。重复步骤 3.6。
    注:SDF1 用于促进组织不同的单元层27。
  15. 第 35 天，重复步骤 3.2、3.3 和 3.4。用完整的脑物理介质替换生物反应器中所有已用的介质（表1）。重复步骤 3.6。
    注:脑物理是一种神经元介质，支持突触活性神经元28。
  16. 每3天用完整的 BrainPhys 介质替换总体积的 1/3，直到第 90 天分化。

4. 冷冻和免疫组织化学器官的制备

  1. 免疫污素器官的收集
    1. 收集含有有机物的1 mL样品，用血清移液器从生物反应器到15 mL锥形管。
      注:应在不同时间点收集有机体，以评估分化的功效，包括天数7、14、21、35、56、70、80和90。
    2. 拆下上一液，用 1 mL 的 1 ×洗一次。
      注:请勿使器官离心。让器官在管子底部通过重力沉淀。
    3. 去除上经剂并添加 1 mL 的 4% 甲醛 （PFA）。在4°C孵育30分钟。删除已花的 PFA 并添加 1 mL 的 1× PBS。
    4. 将有机体储存在1 mL的1×PBS中，在4°C下，直到处理冷冻。
      注:在固定后不超过1周，将器官存放在1xPBS中。
  2. 冷冻器官的制备
    1. 从储存的器官中去除上一液。加入1 mL的15%蔗糖（w/v，稀释在1× PBS），通过轻轻的旋转混合良好，并在4°C孵育过夜。
    2. 制备15%蔗糖/7.5%明胶溶液（表2），在制备过程中保持37°C，以避免明胶凝固。
    3. 去除 15% 蔗糖溶液，将 1 mL 的 15% 蔗糖/7.5% 明胶加入有机体，通过轻柔的涡旋快速混合。在37°C下孵育1小时。
    4. 将 15% 蔗糖/7.5% 明胶溶液加入到其体积的一半的塑料容器中。等待 RT 的凝固。
    5. 孵育1小时后，小心地将含有有机液的蔗糖/明胶滴放在凝固明胶上，并加有巴斯德移液器。离开在RT凝固约15分钟。确保避免气泡形成。
    6. 将 15% 蔗糖/7.5% 明胶放在有机体顶部，直到容器充满。等待 RT 完全凝固。
    7. 凝固后，在4°C下孵育20分钟。
    8. 将明胶切成含有中心有机物的立方体，用一滴O.C.T.化合物将明胶立方体固定在一块纸板上。
    9. 将 250 mL 的异丙烷放在 500 mL 杯中，并加注适当的容器中。。使用钳子和厚手套，小心地将含有异丙烷的杯子放在液氮表面，将异丙烷冷却至-80°C。
    10. 当达到 -80 °C 时，将明胶立方体放入含有异丙烷的杯子中，直到其冻结，使温度保持 -80°C。 根据立方体的大小，可能需要 1~2 分钟。
      注:避免温度低于-80°C或过度冻结时间，因为它可能会导致立方体开裂。
    11. 冷冻时，迅速将明胶立方体储存在-80°C，并储存至冷冻。
  3. 器官的冷冻
    1. 打开低温恒温器，在 -25 °C 下定义试样 （OT） 和低温 （CT） 温度。
    2. 当两个温度稳定下来时，使用O.T.化合物固定含有有机.C的明胶立方体。
    3. 在 12 μm 下定义截面厚度。
    4. 切割立方体，在粘附显微镜幻灯片上收集 3~4 片（ 参见材料表）。
    5. 储存在-20°C，直到使用。
  4. 有机体切片的免疫污染
    1. 将包含器官部分的显微镜幻灯片放在一个带 50 mL 预预热 1x PBS 的轴罐中，可背对背放置多达 10 张幻灯片。
      注:所有器官部分应用液体浸入水中。
    2. 在37°C下孵育45分钟，使幻灯片脱热化。
    3. 在 RT 上用 50 mL 的 1× Pbs 清洗 1x 5 分钟:将幻灯片转移到包含新鲜 1× PBS 的罐子中。
    4. 将幻灯片转移到含有 50 mL 新鲜准备的甘氨酸 （表2） 的玻璃罐中，并在 RT 孵育 10 分钟。
    5. 将幻灯片转移到包含 0.1% 三吨 50 mL 的玻璃罐 （表 2），并在 RT 渗透 10 分钟。
    6. 用 1× PBS 清洗 5 分钟 2 倍。
    7. 用浸泡在1个PBS中的3毫米纸准备×盘。将切片周围有纸巾干燥，并放在 3 毫米纸上。使用巴氏移液器，用阻塞溶液（表2）覆盖幻灯片的整个表面，每张幻灯片为±0.5 mL。在 Rt 孵育 30 分钟。
    8. 去除多余的阻块溶液，用切片周围的纸巾擦干幻灯片。将原抗体的50μL（表3）稀释在阻断溶液中，在各部分上用盖玻片覆盖。将切片放在先前准备的免疫抹盘中。在4°C孵育过夜。
    9. 将幻灯片转移到具有 50 mST 的带孔罐（表 2），让盖玻片落下，用 TBST 洗涤 5 分钟 3 倍。
    10. 将稀释在阻断溶液中的 50 μL 放在截面上，并盖上盖玻片。将切片放在先前准备的免疫抹菜中。在RT孵育30分钟，防止光线。
    11. 将幻灯片再次转移到一个带孔的罐子中，用 50 mL 的 TBST 洗涤 5 分钟 3 倍。
    12. 将幻灯片与切片周围的纸巾擦干，然后将切片放在先前准备的免疫抹布中。使用巴氏移液器在幻灯片的整个表面上添加 0.5 mL 的 DAPI 溶液。在 Rt 孵育 5 分钟。
    13. 重复步骤 4.4.9。
    14. 用纸巾小心地擦干滑梯。沿幻灯片滴加 50 μL 的安装介质，然后小心地将盖玻片放到每张幻灯片上，稍微弯曲，以避免气泡。

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结果

该协议是通过使用0.1 L生物反应器促进细胞聚合（图1A）启动的。对 iPSC 进行单细胞接种，在 60 mL 的培养中播种 250，000 个细胞/mL，搅拌速度为 27 rpm。这被定义为第 0 天。24小时后，细胞有效形成球形状聚集体（第1天，图1B），形态学一直保持良好，直到第5天，大小逐渐增加，表明随着时间的推移，在聚合形态和大小方面具有高度的同质性。（

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讨论

需要大量的细胞数量以及定义的培养条件来生成特定的细胞类型，用于药物筛选和再生医学应用，这一直在推动可扩展培养系统的发展。近年来，几组报告了可扩展的神经祖代和功能神经元32、33、34等34，为神经退行性疾病新模型的发展提供了重大进展。32,然而，胚胎发育的一些关键事件的回顾仍然缺乏，长期维持在悬浮过程?...

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披露声明

作者 YH 和 SJ 是 PBS 生物技术公司的员工。作者 BL 是 PBS 生物技术公司的首席执行官和联合创始人。这些合作作者参与了手稿中使用的生物反应器的开发。这不会改变作者对期刊关于共享数据和材料的所有政策的遵守。所有其他作者声明没有利益冲突。

致谢

这项工作得到了葡萄牙国家电信协会（FCT）的支持（UIDB/04565/2020通过Lisboa区域项目2020，项目N.007317， PD/BD/105773/2014 至 T.P.S 和 PD/BD/128376/2017 到 D.E.S.N.），项目由 FEDER （POR Lisboa 2020 – 项目区域行动区域葡萄牙 2 和 FCT 通过授予 PAC - 精确 LISBOA - 01 - 0145 - Feder - 016394 和 CEREBEX 生成小脑有机体为 Ataxia 研究授予 LISBOA -01-0145-FEDER-029298。还根据赠款协议第739572号——再生和精密医学发现中心H2020-2020-01-2016-2017年，从欧洲联盟的Horizon 2020研究和创新方案获得资金。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
3MM paperWHA3030861Merck
AccutaseA6964 - 500mLSigmacell detachment medium
Anti-BARHL1 AntibodyHPA004809Atlas Antibodies
Anti-Calbindin D-28k AntibodyCB28Millipore
Anti-MAP2 AntibodyM4403Sigma
Anti-N-Cadherin Antibody610921BD Transduction
Anti-NESTIN AntibodyMAB1259-SPR&D
Anti-OLIG2 AntibodyMABN50Millipore
Anti-PAX6 AntibodyPRB-278PCovance
Anti-SOX2 AntibodyMAB2018R&D
Anti-TBR1 AntibodyAB2261Millipore
Anti-TBR2 Antibodyab183991Abcam
Anti-TUJ1 Antibody801213Biolegend
Apo-transferrinT1147Sigma
BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM1 Kit5793 - 500mLStem cell tecnhnologies
Chemically defined lipid concentrate11905031ThermoFisher
Coverslips 24x60mm631-1575VWR
Crystallization-purified BSA5470Sigma
DAPI10236276001Sigma
Dibutyryl cAMPSC- 201567B -500mgFrilabo
DMEM-F1232500-035ThermoFisher
Fetal bovine serumA3840001ThermoFisher
Gelatin from bovine skinG9391Sigma
Glass Copling JarE94ThermoFisher
Glutamax I10566-016ThermoFisher
GlycineMB014001NZYtech
Ham’s F1221765029ThermoFisher
Human Episomal iPSC LineA18945ThermoFisheriPSC6.2
IMDM12440046ThermoFisher
Insulin91077CSigma
iPS DF6-9-9T.BWiCell
Iso-pentanePHR1661-2MLSigma
L-Ascorbic acidA-92902Sigma
Matrigel354230Corningbasement membrane matrix
MonothioglycerolM6154Sigma
Mowiol475904Milliporemounting medium
mTeSR185850 -500mlStem cell technologies
N2 supplement17502048ThermoFisher
Neurobasal12348017ThermoFisher
Paraformaldehyde158127Sigma
PBS-0.1 Single-Use VesselSKU: IA-0.1-D-001PBS Biotech
PBS-MINI MagDrive Base UnitSKU: IA-UNI-B-501PBS Biotech
Recombinant human BDNF450-02Peprotech
Recombinant human bFGF/FGF2100-18BPeprotech
Recombinant human FGF19100-32Peprotech
Recombinant human GDNF450-10Peprotech
Recombinant human SDF1300-28APeprotech
ROCK inhibitor Y-2763272302Stem cell technologies
SB431542S4317Sigma
SucroseS7903Sigma
SuperFrost Microscope slides12372098ThermoFisheradhesion microscope slides
Tissue-Tek O.C.T. Compound25608-930VWR
Tris-HCL 1MT3038-1LSigma
Triton X-1009002-93-1Sigma
Tween-20P1379Sigma
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.015575020ThermoFisher

参考文献

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