إنشاء نموذج بورسين السابقين فيفو القرنية لدراسة العلاجات الدوائية ضد التهاب القرنية البكتيرية

Summary

توضح هذه المقالة بروتوكول خطوة بخطوة لإعداد نموذج مُنَقَر vivo السابقين من التهاب القرنية البكتيري. يستخدم Pseudomonas aeruginosa ككائن اضروبي. هذا النموذج المبتكر يحاكي في العدوى الجسمية كما تكاثر البكتيريا يعتمد على قدرة البكتيريا على تلف أنسجة القرنية.

Abstract

عند تطوير مضادات الميكروبات الجديدة ، يعتمد نجاح التجارب الحيوانية على استقراء دقيق لنجاعة مضادات الميكروبات من الاختبارات المختبرية إلى العدوى الحيوانية في الجسم الحي. وعادة ما تبالغ الاختبارات المختبرية الموجودة في تقدير فعالية مضادات الميكروبات لأن وجود الأنسجة المضيفة كحاجز للنشر لا يُحَدَّد. للتغلب على هذا عنق الزجاجة، قمنا بتطوير نموذج القرنية السابق vivo porecine من التهاب القرنية البكتيري باستخدام Pseudomonas aeruginosa ككائن حي نموذجي. توضح هذه المقالة إعداد القرنية بورسين والبروتوكول لإنشاء العدوى. قوالب الزجاج مفصل تمكين الإعداد مباشرة من القرنية لدراسات العدوى. نموذج يحاكي في العدوى الجسمية كما تكاثر البكتيريا يعتمد على قدرة البكتيريا على تلف أنسجة القرنية. يتم التحقق من إنشاء العدوى كزدّة في عدد وحدات تشكيل المستعمرة التي تم تقييمها عبر عد الصفائح القابلة للتطبيق. النتائج تثبت أنه يمكن أن تنشأ العدوى بطريقة استنساخها للغاية في القرنيات السابقين vivo باستخدام الطريقة الموصوفة هنا. ويمكن توسيع النموذج في المستقبل لتقليد التهاب القرنية الناجم عن الكائنات الحية الدقيقة غير P. aeruginosa. الهدف النهائي من هذا النموذج هو التحقيق في تأثير العلاج الكيميائي المضاد للميكروبات على تقدم العدوى البكتيرية في سيناريو أكثر تمثيلاً في العدوى الجسمية. وبذلك، فإن النموذج الموصوف هنا سيقلل من استخدام الحيوانات للاختبار، ويحسن معدلات النجاح في التجارب السريرية، وفي نهاية المطاف سيمكن من الترجمة السريعة لمضادات الميكروبات الجديدة إلى العيادة.

Introduction

31 - تعد عدوى القرنية من الأسباب الهامة للعمى، وتحدث بنسب وبائية في البلدان المنخفضة الدخل والبلدان المتوسطة الدخل. وتختلف مسببات المرض من منطقة إلى أخرى ولكن البكتيريا تمثل أغلبية كبيرة من هذه الحالات. Pseudomonas aeruginosa هو الممرض المهم الذي يسبب مرض تقدمية بسرعة. في كثير من الحالات، ويترك المرضى مع تندب stromal، الاستجماتيزم غير النظامية، تتطلب زرع أو في أسوأ سيناريو، تفقد العين^1،2.

التهاب القرنية البكتيرية الناجمة عن P. aeruginosa هو عدوى العين صعبة لعلاج خاصة بسبب الظهور المتزايد لسلالات مقاومة مضادات الميكروبات من P. aeruginosa. خلال العقد الماضي، أصبح من الواضح أن اختبار وتطوير علاجات جديدة لالتهابات القرنية، بشكل عام، وتلك التي تسببها Pseudomonas sp.، على وجه الخصوص، ضرورية لمكافحة الاتجاه الحالي في مقاومة المضادات الحيوية³.

لاختبار فعالية العلاجات الجديدة لالتهابات القرنية ، والأساليب التقليدية في المختبرات الميكروبيولوجية هي بديل الفقراء بسبب الفرق في علم وظائف الأعضاء البكتيرية خلال الثقافة المختبرية ، وخلال الالتهابات في الجسم الحي وكذلك بسبب عدم وجود واجهة المضيف^4،5. في نماذج الحيوانات الحية، ومع ذلك، هي مكلفة، تستغرق وقتا طويلا، لا يمكن إلا أن تقديم عدد قليل من النسخ المتماثلة وإثارة المخاوف بشأن رعاية الحيوان.

في هذه المقالة، ونحن نبرهن على بسيطة وقابلة للاستنساخ organotypic السابقين vivo porcine نموذج من التهاب القرنية التي يمكن استخدامها لاختبار العلاجات المختلفة للعدوى الحادة والمزمنة. لقد استخدمنا P. aeruginosa لهذه التجربة ولكن النموذج يعمل أيضا بشكل جيد مع البكتيريا الأخرى، والكائنات الحية مثل الفطريات والخميرة التي تسبب التهاب القرنية.

Protocol

تم التضحية بالأرانب مختبر ألبينو في المختبر من أجل غيرها من الأعمال التجريبية المخطط لها في إطار بروتوكولات وزارة الداخلية المعتمدة. لم تكن العيون مطلوبة للاستخدام التجريبي في تلك الدراسات لذلك تم استخدامها لهذا البروتوكول.

1- التعقيم

1. الخطوة الحرجة: تطهير جميع ملقط ومقص عن طريق نقع لمدة 1 ساعة في 5٪ (الخامس / الخامس) حل من Distel في الماء المقطر، وتنظيف مع فرشاة، وشطف مع ماء الصنبور وتعقيم في فرن في 185 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 2 ساعة.
2. تعقيم جميع الأواني الزجاجية والكواشف الأخرى عن طريق autoclaving في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة أو إعداد الكواشف وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تنفيذ الإجراءات التالية في مجلس الوزراء سلامة الميكروبيولوجيا من الدرجة الثانية.

2. عينة جمع

1. جمع عيون بورسين
   1. بذرات لاندراس بيضاء كبيرة، تم استخدام صليب مع خنزير هامبشاير. وقد ذهلت الحيوانات مع تيار كهربائي وكانت العينين enucleated 2 ساعة في وقت لاحق في المسلخ.
   2. الخطوة الحرجة: مرة واحدة enucleated، نقل العينين إلى المختبر في محلول الفوسفات المعقم المخزنة (PBS) لمنعهم من الجفاف ومعالجتها على الفور عند الوصول.
2. جمع عيون الأرانب
   1. اُخراج القرنيات وإرسالها إلى المختبر في برنامج تلفزيوني معقمة.

3. إعداد زر الكورنيا

1. استخدام ملقط العقيمة لعقد الأنسجة المحيطة مقلة العين ونقلها إلى طبق بيتري. إزالة الملتحمة والأنسجة العضلية حول مقلة العين على طبق بيتري باستخدام شفرة مشرط رقم 15 والملذات.
2. رفع بلطف مقلة العين في حين عقد العصب البصري مع ملقط ونقلها إلى جرة 0.5 لتر مليئة برنامج تلفزيوني عقيم.
3. مرة واحدة يتم مسح جميع العيون من الأنسجة المحيطة بها، ونقلها باستخدام ملقط العقيمة إلى آخر 0.5 لتر جرة مليئة 3٪ (الخامس / الخامس) بودينيد في برنامج تلفزيوني وترك لمدة 1 دقيقة.
4. نقل مقل العيون إلى آخر 0.5 لتر جرة مع برنامج تلفزيوني عقيمة.
5. استخدام ملقط لعقد العين لا يزال على طبق بيتري وجعل قطع بالقرب من القرنية مع شفرة مشرط لا 10A.
6. الخطوة الحرجة: عقد حافة قطع واستخدام مقص لاستخراج القرنية ترك حوالي 3 مم من صلب المحيطة القرنية. ضمان نهاية حادة من مقص لا تخترق القزحية أو الأنسجة المشيمية، وهو في الفضاء فوق المشيمية.
7. عقد زر corneoscleral مع ملقط واستخدام زوج آخر من ملقط نهاية مدببة لفصل بلطف أنسجة أوفيال.
8. رفع زر corneoscleral من الكرة الأرضية المتبقية وشطف لفترة وجيزة في 1.5٪ (الخامس / الخامس) محلول اليود povidone في برنامج تلفزيوني في لوحة 12 جيدا.
9. ضع الزر الكورني في لوحة أخرى 12 بئر مليئة PBS العقيمة.
10. بعد تجهيز جميع العيون(أوصت الحد الأقصى 40 عيون في دفعة واحدة)،ضع كل زر القرنية إلى طبق بيتري الفردية (34 مم قطر) الجانب الظهارية حتى وتصب في 3 مل من المتوسطة الثقافة قبل warmed إلى 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: تكوين الوسط الثقافة هو على النحو التالي: متوسط النسر Dulbecco المعدلة (DMEM): لحم الخنزير [1:1] تكملها 5 ميكروغرام •مل^-1 الأنسولين و 10 نانوغرام •مل^-1 عامل نمو البشرة (EGF)، 10٪ (v/v) مصل عجل الجنين (FCS)، 100 U∙mL^-1 البنسلين 100 U∙ مل^-1 ستريبتوميسين و 2.5 μg∙ mL^-1 أمفوترريسين B. وكخطوة اختيارية، يمكن استكمال الوسيلة بـ 50^{جرامًا من} دكستران -1 ل- لمنع تورم القرنية المُخترة أثناء خطوات الحضانة الإضافية.
11. احتضان في 37 درجة مئوية في حاضنة استزراع الأنسجة المرطبة.

4. صيانة أزرار الكورنيا

1. بعد 24 ساعة، استخدم تقنية معقمة لإزالة الوسائط واستبدالها بـ 3 مل من وسائل الإعلام الطازجة التي تحتوي على المضادات الحيوية قبل تسخينها. الحفاظ على أزرار القرنية في وسائل الإعلام مع المضادات الحيوية لمدة 48 ساعة لتطهير القرنيات. احتضان في 37 درجة مئوية في حاضنة استزراع الأنسجة المرطبة.
2. الخطوة الحرجة: بعد 48 ساعة، وإزالة وسائل الإعلام وشطف القرنيات مع 2 مل من برنامج تلفزيوني. ثم الحفاظ على أزرار القرنية في وسائل الإعلام خالية من المضادات الحيوية لمدة لا تقل عن يومين أو مثالي ثلاثة أيام قبل العدوى التجريبية، لإزالة المضادات الحيوية المتبقية من الأنسجة.
3. احتضان في 37 درجة مئوية في حاضنة استزراع الأنسجة المرطبة. تغيير الوسائط مرة واحدة على الأقل خلال هذه الأيام الثلاثة. تخلص من القرنيات إذا تطور أي عكر في الوسط الخالي من المضادات الحيوية.

5- إعداد التلقيح

1. صب 10 مل من مرق LB في قارورة مخروطية 50 مل مع سدادة رغوة.
2. نقل مستعمرة من P. aeruginosa سلالة PAO1 أو سلالة PA14 من لوحة أجار الطازجة واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 3-4 ح حتى البكتيريا في منتصف مرحلة السجل.
3. نقل ثقافة البكتيريا إلى أنبوب 50 مل والطرد المركزي في 3000 س ز لمدة 5 دقائق. إزالة فائقة وإعادة تعليق بيليه الخلية في برنامج تلفزيوني.
4. كرر الخطوة 5.3 مرتين أكثر لغسل الخلايا. إعادة تعليق بيليه الخلية في برنامج تلفزيوني وضبط الكثافة البصرية في 600 نانومتر إلى حوالي 0.6 باستخدام برنامج تلفزيوني عقيمة كفراغ.

6. إصابة زر corneoscleral

1. إزالة وسائل الإعلام من طبق بيتري وشطف القرنيات مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني عقيم.
2. ضغط بلطف ملقط في حين عقد القرنية في ما بين. استخدام مشرط 10A لجعل أربعة تخفيضات - اثنين عمودي، اثنين أفقيا - في القسم المركزي من زر الكورنيا من خلال طبقة الظهارية إلى ستروما الأساسية.
3. وضع قالب زجاجي معقمة في لوحة 6-جيدا مع جزء واسع حتى ووضع القرنية في منتصف القالب الزجاجي، الجانب ظهارة تواجه إلى أسفل. جعل خفض الحق في وسط الجزء السفلي من القالب الزجاجي.
4. الخطوة الحرجة: صب 1 مل من 1٪ (ث / الخامس) انخفاض نقطة ذوبان أجار حل في DMEM لملء القالب الزجاجي مع القرنية تماما.
5. السماح لأجار لتعيين ثم عكس القالب الزجاجي بحيث ظهارة القرنية تواجه صعودا.
6. Pipette 15 ميكرولتر من الثقافة البكتيرية مع_600nm OD = 0.6 (لP. aeruginosa وهذا يعادل ما يقرب من 1 × 10⁷ وحدات تشكيل مستعمرة (CFU) في 15 ميكرولتر) مباشرة في منطقة قطع ومن ثم إضافة 85 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني إلى الأعلى للحفاظ على ظهارة القرنية رطبة. تمييع الثقافة البكتيرية المتبقية وطبق على أجار لحساب وحدات تشكيل مستعمرة ل inoculum.
7. إضافة 1 مل من DMEM دون المضادات الحيوية إلى الجزء السفلي من كل بئر مع القالب الزجاجي. احتضان لوحة 6-جيدا مع أزرار الكورنيا كلية المصابة في حاضنة مرطب في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂ لمدة تصل إلى 24 ساعة.
8. إعداد القرنية السيطرة غير المصابة جنبا إلى جنب مع كل تجربة. لإعداد التحكم غير المصاب، استبدل 15 ميكرولتر من الثقافة البكتيرية في الخطوة 6.6 مع برنامج تلفزيوني عقيم.

7. التجانس للقرنية لحصاد البكتيريا

1. تجاهل المتوسط DMEM من الجزء السفلي من لوحة 6 جيدا وإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني عقيم لشطف الجزء السفلي من البئر.
2. إزالة برنامج تلفزيوني بلطف عن طريق pipetting دون لمس الجزء المركزي من زر corneoscleral. إزالة حلقة الزجاج باستخدام ملقط العقيمة ووضعها في Distel 5٪ .
3. شطف بلطف الجزء العلوي من زر corneoscleral مع 1 مل من برنامج تلفزيوني مرتين [اختياري].
4. اضغط على حافة زر corneoscleral مع ملقط تلميح ناعم وفصله عن أجار تحت.
5. نقل القرنية إلى أنبوب 50 مل مليئة الجليد الباردة 1-2 مل من برنامج تلفزيوني.
6. استخدام التجانس تلميح غرامة لمجرد الجزء العلوي من القرنية المصابة. لا يجب أن يتم االنسيج بشكل كامل. يساعد المُجنّز على فصل البكتيريا عن ظهارة القرنية ومنطقة القطع.
7. دوامة القرنية في برنامج تلفزيوني لبضع ثوان لخلط المحتويات.
8. إضافة 20 ميكرولتر من التجانس إلى 180 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وتنفيذ التخفيفات التسلسلية في لوحة 96 جيدا.
9. تخفيف التعليق بشكل متسلسل إلى^10-4 و 10^-5 تخفيف والماصة 10 ميكرولتر من التجانس المخفف مع البكتيريا على صفيحة أجار الدم. احتضان لوحة لمدة 8 ساعات ، وعدد من CFU. عند اختبار تأثير مضادات الميكروبات، يجب التوصل إلى عامل التخفيف المناسب في تجريبيا.

النتائج

تصميم القوالب الزجاجية هي فكرة مبتكرة ومبتكرة، واستخدام التي سمحت لنا لاقامة نموذج بطريقة متسقة مع الحد الأدنى / لا قضايا التلوث. تم إعداد قوالب من قبل منفاخ الزجاج في جامعة شيفيلد على أساس تصميم (الشكل 1A). الإعداد التجريبي يحافظ على شكل محدب للقرنية ويحمل البكتيريا على الج...

Discussion

المحرك الرئيسي وراء تطوير هذا النموذج التهاب القرنية باستخدام القرنية السابقين vivo porcine هو تزويد الباحثين النامية مضادات الميكروبات الجديدة مع نموذج تمثيلي في المختبر لتحديد فعالية مضادات الميكروبات بدقة أكبر في المراحل قبل الظهر. وهذا سيوفر للباحثين المشاركين في تطوير مضادات الميكروبا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL Falcon tube	SLS	352070
Amphotericin B	Sigma	A2942
Cellstar 12 well plate	Greiner Bio-One	665180
Dextran	Sigma	31425-100mg-F
Distel	Fisher Scientific	12899357
DMEM + glutamax	SLS	D0819
Dual Oven Incubator	SLS	OVe1020	Sterilising oven
Epidermal growth factor	SLS	E5036-200UG
F12 HAM	Sigma	N4888
Foetal calf serum	Labtech International	CA-115/500
Forceps	Fisher Scientific	15307805
Handheld homogeniser 220	Fisher Scientific	15575809	Homogeniser
Heracell VIOS 160i	Thermo Scientific	15373212	Tissue culture incubator
Heraeus Megafuge 16R	VWR	521-2242	Centrifuge
Insulin, recombinant Human	SLS	91077C-1G
LB agar	Sigma	L2897
Multitron	Infors	Not appplicable	Bacterial incubator
PBS	SLS	P4417
Penicillin-Streptomycin	SLS	P0781
Petri dish	Fisher Scientific	12664785
Petri dish 35x10mm CytoOne	Starlab	CC7672-3340
Povidone iodine	Weldricks pharmacy	2122828
Safe 2020	Fisher Scientific	1284804	Class II microbiology safety cabinet
Scalpel blade number 15	Fisher Scientific	O305
Scalpel Swann Morton	Fisher Scientific	11849002