세균성 각막염에 대하여 약 처리를 공부하기 위한 돼지 Ex Vivo Cornea 모형 을 설치합니다

요약

이 문서에서는 세균 성 각질염의 전 생체 돼지 모델을 설정하는 단계별 프로토콜을 설명합니다. 슈도모나스 아에루기노사는 대생 유기체로 사용된다. 이 혁신적인 모델은 세균성 증식이 각막 조직을 손상시키는 박테리아의 능력에 달려 있기 때문에 생체 내 감염을 모방합니다.

초록

새로운 항균제가 개발될 때, 동물 실험의 성공은 생체 외 실험에서 생체 내 동물 감염에 항균 효능의 정확한 외삽에 달려 있습니다. 기존 시험관내 시험은 전형적으로 확산 장벽으로서 숙주 조직의 존재가 고려되지 않기 때문에 항균 효능을 과대 평가한다. 이 병목 현상을 극복하기 위하여는, 우리는 초원 유기체로 슈도모나스 aeruginosa를 사용하여 세균 각질염의 전 생체 돼지 각막 모형을 개발했습니다. 이 문서에서는 감염의 확립을 위한 돼지 각막 및 프로토콜의 준비를 설명합니다. 맞춤형 유리 금형은 감염 연구를 위해 각막의 간단한 설정을 가능하게 합니다. 이 모델은 세균성 증식이 각막 조직을 손상시키는 박테리아의 능력에 따라 생체 내 감염을 모방합니다. 감염의 확립은 실행 가능한 플레이트 수를 통해 평가된 식민지 형성 단위의 수의 증가로 확인됩니다. 결과는 여기에 설명된 방법을 사용하여 전 생체 내 각막에서 매우 재현 가능한 방식으로 감염이 확립될 수 있음을 보여준다. 이 모델은 P. aeruginosa이외의 미생물에 의한 각질염을 모방하기 위해 미래에 확장 될 수있다. 모델의 궁극적인 목표는 생체 내 감염을 더 대표하는 시나리오에서 세균 감염의 진행에 항균 화학 요법의 효과를 조사하는 것입니다. 이렇게함으로써, 여기에서 기술된 모형은 시험을 위한 동물의 사용을 감소시키고, 임상 시험에서 성공률을 향상하고 궁극적으로 병원에 새로운 항균제의 급속한 번역을 가능하게 할 것입니다.

서문

각막 감염은 실명의 중요한 원인이며 저소득 및 중간 소득 국가에서 전염병 비율에서 발생합니다. 질병의 병인학은 지역마다 다르지만 박테리아는 이러한 경우의 대부분을 차지합니다. 슈도모나스 아에루기노사는 급속하게 진보적인 질병을 일으키는 원인이 되는 중요한 병원체입니다. 많은 경우에, 환자는 기질 흉터, 불규칙한 난시로 남아, 이식을 요구하거나 최악의 시나리오에서, 눈^1을잃고^1,2.

P. aeruginosa에 기인한 세균성 각질염은 P. aeruginosa의항균 저항긴장의 증가 출현 때문에 특히 취급하기 어려운 눈 감염입니다. 지난 10 년 이내에, 각막 감염에 대한 새로운 치료법을 테스트하고 개발하는 것이 명백해졌으며, 일반적으로 슈도모나스 스프에 의해 유발된 치료법은 특히 항생 저항^3의현재 추세에 대처하는 데 필수적입니다.

각막 감염에 대한 새로운 치료법의 효능을 시험하기 위해, 기존의 체외 미생물 방법은 실험실 배양 중 및 생체 내 감염 시 세균성 생리학의 차이로 인해 대리가 좋지 않은 반면, 호스트 인터페이스^4,5의부족으로 인한 것이다. 그러나 생체 내 동물 모델은 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요되며 소수의 복제본만 전달하고 동물 복지에 대한 우려를 제기할 수 있습니다.

이 기사에서는 급성 및 만성 감염에 대한 다양한 치료를 테스트하는 데 사용할 수있는 각질염의 간단하고 재현 가능한 organotypic ex vivo 돼지 모델을 시연합니다. 우리는 이 실험을 위해 P. aeruginosa를 사용했습니다 그러나 모형은 또한 다른 박테리아및 각질염을 일으키는 원인이 되는 균류 및 효모와 같은 유기체와 잘 작동합니다.

프로토콜

Albino 실험실 토끼는 홈 오피스 승인 프로토콜에서 다른 계획된 실험 작업을 위해 실험실에서 희생되었습니다. 눈은 이 프로토콜에 사용되었기 때문에 그 연구 결과에 있는 실험적인 사용을 위해 필요하지 않았습니다.

1. 살균

1. 중요 단계: 증류수에 디스텔의 5% (v/v) 용액에서 1h로 담그고, 브러시로 청소하고, 수돗물로 헹구고, 최소 2시간 동안 185°C의 오븐에서 멸균하여 모든 집게와 가위를 소독합니다.
2. 121°C에서 15분 동안 자동화하여 다른 모든 유리제품 및 시약을 살균하거나 제조업체의 지시에 따라 시약을 준비합니다. 클래스 II 미생물학 안전 캐비닛에서 다음과 같은 절차를 수행합니다.

2. 샘플 컬렉션

1. 돼지 눈의 컬렉션
   1. 커다란 하얀 땅이 뿌리고, 햄프셔 멧돼지와 십자가가 사용되었다. 동물들은 전류에 깜짝 놀랐고, 눈은 2시간 후 아바토이르에서 방출되었다.
   2. 중요 단계: 일단 에뉴클레오면, 멸균 인산염 완충식염(PBS) 용액으로 실험실로 눈을 옮겨 건조되는 것을 방지하고 도착하자마자 즉시 처리합니다.
2. 토끼 눈의 컬렉션
   1. 각막을 소비하고 멸균 PBS로 실험실로 보냅니다.

3. 코네클레럴 버튼 준비

1. 멸균 집게를 사용하여 안구주변의 조직을 잡고 페트리 접시로 옮으시다. 메스 블레이드 15번과 집게를 사용하여 페트리 접시에 안구 주위의 결막과 근육 조직을 제거합니다.
2. 시신경을 집게로 잡고 멸균 PBS로 채워진 0.5 L 항아리로 옮기면서 안구를 부드럽게 들어 올립니다.
3. 모든 눈이 주변 조직을 지워지면 멸균 집게를 사용하여 PBS에서 3 % (v / v) 포비도요오드로 채워진 또 다른 0.5 L 항아리로 이동하여 1 분 동안 둡니다.
4. 멸균 PBS와 다른 0.5 L 항아리에 안구를 전송합니다.
5. 집게를 사용하여 페트리 접시에 여전히 눈을 잡고 메스 블레이드 없음 10A로 각막 근처에서 잘라냅니다.
6. 중요 단계 : 절단의 가장자리를 잡고 각막을 둘러싼 약 3mm의 clera를 떠나 각막을 소비하기 위해 가위를 사용합니다. 가위의 날카로운 끝이 홍채 또는 코로이드 조직을 관통하지 않고 수프라 코로이드 공간에 있는지 확인합니다.
7. 집게로 코네클레랄 버튼을 잡고 다른 뾰족한 끝 집게를 사용하여 비경 조직을 부드럽게 분리합니다.
8. 남은 글로브에서 코네클레랄 버튼을 들어 올리고 12웰 플레이트에서 PBS의 1.5%(v/v) 포비도네 요오드 용액으로 잠시 헹구세요.
9. 부식성 버튼을 멸균 PBS로 채워진 또 다른 12 개의 우물 접시에 넣습니다.
10. 모든눈(최대 40개의 눈을 한 번에 권장)한후, 각 코네클레랄 버튼을 개별 페트리 접시(직경 34mm)에 놓고 3mL의 배양 배지를 3mL로 미리 데워 3mL로 부어 37°C로 미리 데워버로 한다.
    참고: 배양 매체의 구성은 다음과 같습니다: 덜벡코의 수정된 독수리 의 매체 (DMEM): 햄의 [1:1] 5 μg(@mL^-1 인슐린 과 10 ng∙mL^-1 표피 성장 인자 (EGF), 10% (v/v) 태아 송아지 혈청 (FCS),¹⁰⁰ Upenill 100 U∙mL^-1 연쇄상 구균 및 2.5 μg∙mL^-1 암포테리신 B. 선택적 단계로, 배지는 추가 인큐베이션 단계 동안 절제된 각막의 부종을 방지하기 위해 50g∙L-1 dextran으로 보충될 수 있다.
11. 가습 조직 배양 인큐베이터에서 37°C에서 배양한다.

4. 코네클레럴 버튼 의 유지 보수

1. 24 시간 후에, 매체를 제거하고 항생제를 포함하는 신선한 미리 온전한 문화 매체의 3 mL로 대체하기 위하여 무균 기술을 사용합니다. 각막을 소독하기 위해 48 h에 대한 항생제로 미디어에 코네클레랄 버튼을 유지합니다. 가습 조직 배양 인큐베이터에서 37°C에서 배양한다.
2. 중요 단계: 48시간 후에 미디어를 제거하고 PBS 2mL로 각막을 헹구세요. 그런 다음 실험 감염 전에 최소 2 일 또는 이상적으로 3 일 동안 항생제없는 매체에 코네클레랄 버튼을 보관하여 조직에서 잔류 항생제를 제거하십시오.
3. 가습 조직 배양 인큐베이터에서 37°C에서 배양한다. 이 3일 이내에 미디어를 하나 이상 변경합니다. 어떤 탁도항생제없는 매체에서 발전하는 경우에 각막을 폐기하십시오.

5. 접종 준비

1. LB 국물 10mL를 50mL 원추형 플라스크에 거품 스토퍼로 붓습니다.
2. P. aeruginosa 균주 PAO1 또는 변형 PA14의 식민지를 신선한 한천 판에서 전송하고 박테리아가 중간 로그 단계에 될 때까지 3-4 시간 동안 37 °C에서 배양한다.
3. 5분 동안 3,000 x g에서 50mL 튜브 및 원심분리기로 박테리아의 배양을 옮긴다. 상체를 제거하고 PBS에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다.
4. 5.3을 반복하여 세포를 세척합니다. PBS에서 셀 펠릿을 다시 일시 중단하고 멸균 PBS를 공백으로 사용하여 600 nm에서 약 0.6으로 광학 밀도를 조정합니다.

6. 코네클레럴 버튼 감염

1. 페트리 접시에서 미디어를 제거하고 멸균 PBS 1mL로 각막을 두 번 헹구습니다.
2. 각막을 그 사이에 들고 있는 동안 집게를 부드럽게 짜냅니다. 10A 메스를 사용하여 상피 층을 통해 상피 층에서 기본 스트로마에 대한 진피성 버튼의 중앙 섹션에서 두 개의 수직, 2 개의 수평 의 네 컷을 만듭니다.
3. 멸균 유리 몰드를 6웰 플레이트에 놓고 넓은 부분을 위로 놓고 각막을 유리 금형 의 중간에 놓고 상피 쪽을 아래로 향합니다. 유리 금형의 하단 부분의 중앙에 절단을 바로 만듭니다.
4. 임계 단계: DMEM에 용해된 1mL(w/v) 낮은 융점 한천을 부어 유리 금형을 각막으로 완전히 채웁니다.
5. 각막 상피가 위쪽으로 향하도록 한천을 설정한 다음 유리 금형을 반전시키십시오.
6. 오드_600nm = 0.6(P. aeruginosa의 경우 15 μL에서 약 1x 10⁷ 콜로니 형성 유닛(CFU)에 해당되는 세균 배양의 파이펫 15 μL을 절단 부위에 직접 넣은 다음, 각막 에피텔륨 모이를 유지하기 위해 85μL의 PBS를 상단에 추가한다. 무접종을 위한 식민지 형성 단위를 계산하기 위하여 천원에 남아 있는 세균 배양 및 접시를 희석합니다.
7. 유리 금형과 함께 각 우물의 바닥에 항생제없이 DMEM 1 mL을 추가합니다. 감염된 코네오클레럴 버튼으로 6웰 플레이트를 37°C의 가습된 인큐베이터에 최대 24시간 동안 5%_CO2로 배양한다.
8. 모든 실험과 함께 감염되지 않은 대조군 각막을 설정합니다. 감염되지 않은 제어를 설정하려면 6.6 단계에서 세균 배양의 15 μL을 멸균 PBS로 대체하십시오.

7. 박테리아를 수확하기 위해 각막의 균질화

1. 6웰 플레이트의 바닥에서 DMEM 배지를 버리고 멸균 PBS 1mL을 추가하여 우물의 바닥을 헹구십시오.
2. 코네클레럴 버튼의 중앙 부분을 만지지 않고 파이프팅으로 PBS를 부드럽게 제거합니다. 멸균 집게를 사용하여 유리 링을 제거하고 5 % 디스텔에 놓습니다.
3. 부드럽게 PBS의 1 mL [선택 사항]로 코네클레럴 버튼의 상단을 헹구십시오.
4. 미세 한 팁 집게와 코네클레럴 버튼의 가장자리를 잡고 아래 의 한천에서 분리.
5. 각막을 PBS의 얼음 차가운 1-2 mL로 채워진 50 mL 튜브로 옮춥춥습니다.
6. 감염된 각막의 상단을 깎아 미세 한 팁 균질화제를 사용합니다. 조직은 완전히 청산 될 필요가 없습니다. 균질화는 각막 상피와 절단 영역에서 박테리아를 분리하는 데 도움이됩니다.
7. 내용내용을 혼합하기 위해 몇 초 동안 PBS에서 각막을 소용돌이.
8. PBS의 180 μL에 균주 20 μL을 추가하고 96 웰 플레이트에서 직렬 희석을 수행합니다.
9. 희석된 균주형의 현탁액을^10-4 및^10-5 희석 및 파이펫 10 μL로 혈액 천막판에 박테리아로 희석하였다. 접시를 8시간 동안 배양하고 CFU 수를 계산합니다. 항균제의 효과를 테스트할 때 적절한 희석 계수는 실험적으로 도착해야 합니다.

결과

유리 금형의 디자인은 혁신적이고 독창적 인 아이디어이며, 이를 통해 오염에 대한 최소한의 문제 / 전혀 문제가없는 일관된 방식으로 모델을 설정할 수 있었습니다. 금형은설계(그림 1A)에기초하여 셰필드 대학의 유리 송풍기로 제조하였다. 실험용 설정은 각막의 볼록 모양을 유지하고 감염이 발생하는 상피의 상단에 박테리아를 보유합니다(도1B).

...

토론

전 생체 돼지 각막을 이용한 이 각막염 모델의 개발의 주된 원동력은 임상 전 단계에서 항균 효능을 보다 정확하게 결정하기 위해 체외 모델을 대표하는 새로운 항균제 개발 연구원을 제공하는 것이다. 이것은 새로운 항균제 개발에 관여하는 연구원을 제공 할 것입니다 전 임상 단계에서 약물 디자인 및 제형에 대한 더 큰 제어, 임상 시험에서 성공을 증가, 대상 연구를 가능하게하여 동물의 사용?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL Falcon tube	SLS	352070
Amphotericin B	Sigma	A2942
Cellstar 12 well plate	Greiner Bio-One	665180
Dextran	Sigma	31425-100mg-F
Distel	Fisher Scientific	12899357
DMEM + glutamax	SLS	D0819
Dual Oven Incubator	SLS	OVe1020	Sterilising oven
Epidermal growth factor	SLS	E5036-200UG
F12 HAM	Sigma	N4888
Foetal calf serum	Labtech International	CA-115/500
Forceps	Fisher Scientific	15307805
Handheld homogeniser 220	Fisher Scientific	15575809	Homogeniser
Heracell VIOS 160i	Thermo Scientific	15373212	Tissue culture incubator
Heraeus Megafuge 16R	VWR	521-2242	Centrifuge
Insulin, recombinant Human	SLS	91077C-1G
LB agar	Sigma	L2897
Multitron	Infors	Not appplicable	Bacterial incubator
PBS	SLS	P4417
Penicillin-Streptomycin	SLS	P0781
Petri dish	Fisher Scientific	12664785
Petri dish 35x10mm CytoOne	Starlab	CC7672-3340
Povidone iodine	Weldricks pharmacy	2122828
Safe 2020	Fisher Scientific	1284804	Class II microbiology safety cabinet
Scalpel blade number 15	Fisher Scientific	O305
Scalpel Swann Morton	Fisher Scientific	11849002