Bakteriyel Keratite Karşı İlaç Tedavilerini İncelemek İçin Porcine Ex Vivo Kornea Modeli Kurulması

Özet

Bu makalede, bakteriyel keratitin ex vivo porcine modelini kurmak için adım adım bir protokol açıklanmaktadır. Pseudomonas aeruginosa prototipik bir organizma olarak kullanılır. Bu yenilikçi model in vivo enfeksiyonu taklit eder, çünkü bakteri çoğalması bakterinin kornea dokusuna zarar verme yeteneğine bağlıdır.

Özet

Yeni antimikrobiyaller geliştirirken, hayvan deneylerinin başarısı in vitro testlerden in vivo hayvan enfeksiyonlarına kadar antimikrobiyal etkinliğin doğru bir şekilde tahmin edilmesine bağlıdır. Mevcut in vitro testler tipik olarak antimikrobiyal etkinliği abartır, çünkü bir difüzyon bariyeri olarak konak dokusunun varlığı hesaba katmaz. Bu darboğazın üstesinden gelmek için, prototipik bir organizma olarak Pseudomonas aeruginosa kullanarak bakteriyel keratitin ex vivo porcine kornea modelini geliştirdik. Bu makalede, porcine korneasının hazırlanması ve enfeksiyonun kurulması için protokol açıklanmaktadır. ısmarlama cam kalıplar, enfeksiyon çalışmaları için korneanın basit kurulumunu sağlar. Bakteriyel çoğalma kornea dokusuna zarar verme yeteneğine bağlı olduğu için model in vivo enfeksiyonu taklit eder. Enfeksiyonun kurulması, uygun plaka sayımları ile değerlendirilen koloni oluşturan birimlerin sayısında bir artış olarak doğrulanır. Sonuçlar, burada açıklanan yöntem kullanılarak ex vivo kornealarda enfeksiyonun oldukça tekrarlanabilir bir şekilde kurulabileceğini göstermektedir. Model gelecekte P. aeruginosadışındaki mikroorganizmaların neden olduğu keratitleri taklit etmek için genişletilebilir. Modelin nihai amacı, in vivo enfeksiyonları daha fazla temsil eden bir senaryoda antimikrobiyal kemoterapinin bakteriyel enfeksiyonun ilerlemesi üzerindeki etkisini araştırmaktır. Bunu yaparken, burada açıklanan model, hayvanların test için kullanımını azaltacak, klinik çalışmalarda başarı oranlarını artıracak ve sonuçta yeni antimikrobiyallerin kliniğe hızlı bir şekilde çevrilmesini sağlayacaktır.

Giriş

Kornea enfeksiyonları körlüğün önemli nedenleridir ve düşük ve orta gelirli ülkelerde salgın oranlarında ortaya çıkar. Hastalığın etiyolojisi bölgeden bölgeye değişmekle birlikte bakteriler bu vakaların büyük bir çoğunluğunu oluşturmektedir. Pseudomonas aeruginosa, hızla ilerleyen bir hastalığa neden olan önemli bir patojendir. Çoğu durumda, hastalar stromal skar, düzensiz astigmatizma ile bırakılır, nakil gerektirir veya en kötü senaryoda, bir göz kaybeder^1,2.

P. aeruginosa'nın neden olduğu bakteriyel keratit, özellikle P. aeruginosa'nın antimikrobiyal dirençli suşlarının artan ortaya çıkması nedeniyle tedavisi zor birgöz enfeksiyonudur. Son on yıl içinde, genel olarak kornea enfeksiyonları ve pseudomonas sp.'nin neden olduğu testler ve yeni tedaviler geliştirmek, antibiyotik direncindeki mevcut eğilimle mücadele etmek için gerekli olduğu ortaya çıktı³.

Kornea enfeksiyonları için yeni tedavilerin etkinliğini test etmek için, geleneksel in vitro mikrobiyolojik yöntemler, laboratuvar kültürü sırasında ve in vivo enfeksiyonlar sırasında bakteriyel fizyolojinin farklılığı ve konak arayüzünün olmaması nedeniyle zayıf bir vekildir^4,5. Bununla birlikte, in vivo hayvan modelleri pahalıdır, zaman alıcıdır, sadece az sayıda çoğaltma sağlayabilir ve hayvan refahı konusunda endişeleri artırabilir.

Bu yazıda, akut ve kronik enfeksiyonlar için çeşitli tedavileri test etmek için kullanılabilecek basit ve tekrarlanabilir bir organotipik ex vivo porcine keratit modeli göstermektedir. Bu deney için P. aeruginosa'yı kullandık, ancak model diğer bakteriler ve keratite neden olan mantar ve maya gibi organizmalarla da iyi çalışıyor.

Protokol

Albino laboratuvar tavşanları, ev ofisi onaylı protokoller altında planlanan diğer deneysel çalışmalar için laboratuvarda feda edildi. Bu çalışmalarda deneysel kullanım için gözler gerekli değildi, bu yüzden bu protokol için kullanıldılar.

1. Sterilizasyon

1. KRİtİk ADIM: Distel'in %5 (v/v) çözeltisinde 1 saat boyunca damıtılarak tüm forsepsleri ve makasları dezenfekte edin, fırçayla temizleyin, musluk suyuyla durulayın ve 185 °C'de bir fırında minimum 2 saat sterilize edin.
2. Diğer tüm cam eşyaları ve reaktifleri 121 °C'de 15 dakika otomatik olarak kapatarak sterilize edin veya üreticinin talimatlarına göre reaktifler hazırlayın. Sınıf II mikrobiyoloji güvenlik kabininde aşağıdaki prosedürleri uygulayın.

2. Örnek toplama

1. Gözenekli gözlerin toplanması
   1. Büyük beyaz landrace ekimleri, Hampshire domuzu ile bir haç kullanıldı. Hayvanlar elektrik akımıyla sersemledi ve gözler 2 saat sonra abattoir'de enükle edildi.
   2. KRİtİk ADIM: Enükle edildikten sonra, gözleri kurumasını önlemek için steril fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisi içinde laboratuvara aktarın ve varışta hemen işleyin.
2. Tavşan gözleri koleksiyonu
   1. Korneaları kesin ve steril PBS ile laboratuvara gönderin.

3. Korneoskleral düğmenin hazırlanması

1. Göz küresini çevreleyen dokuyu tutmak ve bir Petri kabına aktarmak için steril tokmaklar kullanın. 15 numaralı neşter bıçağı ve tostips kullanarak bir Petri kabındaki göz küresinin etrafındaki konjonktiva ve kas dokusunu çıkarın.
2. Optik siniri asalarla tutarken göz küresini hafifçe kaldırın ve steril PBS ile dolu 0,5 L'lik bir kavanoza aktarın.
3. Tüm gözler çevre dokudan temizlendikten sonra, steril forseps kullanarak PBS'de% 3 (v / v) povidon iyot ile dolu başka bir 0.5 L kavanoza taşıyın ve 1 dakika bekletin.
4. Gözleri steril PBS'li başka bir 0,5 L kavanoza aktarın.
5. Gözü hala bir Petri kabında tutmak ve korneanın yakınında 10A numaralı neşter bıçağıyla bir kesim yapmak için önps kullanın.
6. KRİtİk ADIM: Kesmenin kenarını tutun ve korneayı çevreleyen yaklaşık 3 mm sklera bırakarak korneayı çıkarmak için makas kullanın. Makasın keskin ucunun iris veya koroidal dokuyu delmediğinden ve supra-koroidal alanda olduğundan emin olun.
7. Korneoskleral düğmeyi tokmaklarla tutun ve uveal dokuyu hafifçe ayırmak için başka bir çift sivri uçlu uzunlayıp kullanın.
8. Korneoskleral düğmeyi kalan dünyadan kaldırın ve PBS'deki %1,5 (v/v) povidon iyot çözeltisinde 12 kuyu plakasında kısa bir süre durulayın.
9. Korneoskleral düğmeyi steril PBS ile dolu başka bir 12 kuyu plakasına yerleştirin.
10. Tüm gözleri işledikten sonra(bir partide önerilen maksimum 40 göz),her korneoskleral düğmeyi tek bir Petri kabına (34 mm çapında) epitel tarafına yerleştirin ve önceden 37 ° C'ye ısıtılmış 3 mL kültür ortamına dökün.
    NOT: Kültür ortamının bileşimi aşağıdaki gibidir: Dulbecco'nun modifiye Eagle ortası (DMEM): Ham'ın [1:1] 5 μg⭐mL^-1 insülin ve 10 ng⭐mL^-1 epidermal büyüme faktörü (EGF), %10 (v/v) foetal baldır serumu (FCS), 100 Uφ•mL^-1 penisilin ile desteklenmiştir. 100 Uφ mL^-1 streptomisiin ve 2,5 μg•mL^-1 amfoterisikin B. İsteğe bağlı bir adım olarak, ortam, daha sonraki kuluçka adımları sırasında eksizyon korneasının şişmesini önlemek için 50 g⭐L^-1 dektran ile desteklenebilir.
11. Nemlendirilmiş doku kültürü inkübatöründe 37 °C'de kuluçkaya yatır.

4. Korneoskleral düğmelerin bakımı

1. 24 saat sonra, medyayı çıkarmak ve antibiyotik içeren 3 mL taze önceden ısıtılmış kültür ortamı ile değiştirmek için aseptik teknik kullanın. Korneaları dezenfekte etmek için kornea düğmelerini 48 saat boyunca antibiyotiklerle medyada tutun. Nemlendirilmiş doku kültürü inkübatöründe 37 °C'de kuluçkaya yatır.
2. KRİtİk ADIM: 48 saat sonra, ortamı çıkarın ve korneaları 2 mL PBS ile durulayın. Daha sonra korneoskleral düğmeleri, dokudaki artık antibiyotikleri çıkarmak için deneysel enfeksiyondan en az iki veya ideal olarak üç gün önce antibiyotiksiz ortamda tutun.
3. Nemlendirilmiş doku kültürü inkübatöründe 37 °C'de kuluçkaya yatır. Bu üç gün içinde medyayı en az bir kez daha değiştirin. Antibiyotik içermeyen ortamda herhangi bir bulanıklık gelişirse korneaları atın.

5. Bir inoculum hazırlanması

1. Köpük durduruculu 50 mL konik şişeye 10 mL LB et suyu dökün.
2. P. aeruginosa suşu PAO1 kolonisini aktarın veya PA14'ü taze bir agar plakasından süzün ve bakteriler orta kütük fazında olana kadar 37 °C'de 3-4 saat kuluçkaya yatırın.
3. Bakteri kültürünü 5 dakika boyunca 3.000 x g'da 50 mL tüp ve santrifüje aktarın. Süpernatant çıkarın ve PBS hücre peletini yeniden askıya alın.
4. Hücreleri yıkamak için 5.3 adımını iki kez daha tekrarlayın. PBS'deki hücre peletini yeniden askıya alın ve steril PBS'yi boş olarak kullanarak 600 nm'deki optik yoğunluğu yaklaşık 0,6'ya ayarlayın.

6. Korneoskleral düğmenin enfekte olması

1. Ortamı Petri kabından çıkarın ve korneaları 1 mL steril PBS ile iki kez durulayın.
2. Korneayı arada tutarken hafifçe sıkın. Korneoskleral düğmenin orta bölümünde, epitel tabakasından alttaki stromaya kadar dört kesim yapmak için 10A neşter kullanın.
3. Steril bir cam kalıbı geniş kısmı yukarı bakacak şekilde 6 kuyulu bir tabağa yerleştirin ve korneayı cam kalıbın ortasına, epitel tarafı aşağı bakacak şekilde yerleştirin. Kesmeyi cam kalıbın alt kısmının tam ortasında yapın.
4. KRİtİk ADIM: Cam kalıbı tamamen kornea ile doldurmak için DMEM'de çözünmüş % 1 (w/v) düşük erime noktası agarının 1 mL'sini dökün.
5. Agarın ayarlamasına izin verin ve ardından cam kalıbı ters çevirin, böylece kornea epitel yukarı bakacak şekilde.
6. OD_{600nm = 0.6} ile bakteri kültürünün pipeti 15 μL (P. aeruginosa için bu, 15 μL'de yaklaşık 1 x^{10 7} koloni şekillendirme ünitesine (CFU) doğrudan bir kesim alanına eşittir ve daha sonra kornea epitelini nemli tutmak için üste 85 μL PBS ekleyin. İnoculum için koloni oluşturan birimleri saymak için kalan bakteri kültürünü ve plakasını agar üzerinde seyreltin.
7. Cam kalıp ile her kuyunun dibine antibiyotiksiz 1 mL DMEM ekleyin. 6 kuyulu plakayı enfekte korneoskleral düğmelerle 37 °C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde₂₄ saate kadar% 5 CO 2 ile kuluçkaya yatırın.
8. Her deneyin yanında enfekte olmayan kontrol korneası kurun. Enfekte olmayan kontrolü kurmak için, 6.6 adımındaki 15 μL bakteri kültürünü steril PBS ile değiştirin.

7. Bakterileri hasat etmek için korneanın homojenizasyonu

1. DMEM ortamını 6 kuyu plakasının altından atın ve kuyunun altını durulamak için 1 mL steril PBS ekleyin.
2. Korneoskleral düğmenin orta kısmına dokunmadan pipetleme yaparak PBS'yi yavaşça çıkarın. Cam halkayı steril asalar kullanarak çıkarın ve% 5 Distel'e yerleştirin.
3. Korneoskleral düğmenin üst kısmını 1 mL PBS ile iki kez [isteğe bağlı] hafifçe durulayın.
4. Korneoskleral düğmenin kenarını ince uçlu asalarla tutun ve altındaki agardan ayırın.
5. Korneayı buz gibi soğuk 1-2 mL PBS ile dolu 50 mL'lik bir tüpe aktarın.
6. Enfekte korneanın üst kısmını saf hale getirmek için ince bir uç homojenizatörü kullanın. Dokunun tamamen tasfiye edilmesi gerekmez. Homojenizatör bakterileri kornea epitelinden ve kesim bölgesinden ayırmaya yardımcı olur.
7. İçeriği karıştırmak için korneayı PBS'de birkaç saniye boyunca girdaplayın.
8. 180 μL PBS'ye 20 μL homojen ekleyin ve 96 kuyu plakasında seri seyreltmeler gerçekleştirin.
9. Süspansiyonu seri olarak 10^-4 ve 10^-5 seyreltme ve pipet 10 μL seyreltilmiş homojenatı bakterilerle bir kan agar plakasına seyreltin. Plakayı 8 saat kuluçkaya yatırın ve CFU sayısını sayın. Antimikrobiyallerin etkisini test ederken, uygun seyreltme faktörü deneysel olarak gelmelidir.

Sonuçlar

Cam kalıpların tasarımı, kullanımı modeli kontaminasyonla ilgili minimum / hiç sorun olmadan tutarlı bir şekilde kurmamızı sağlayan yenilikçi ve orijinal bir fikirdir. Kalıplar Sheffield Üniversitesi'nde bir cam üfleyici tarafından bir tasarıma dayanarak hazırlanmıştır (Şekil 1A). Deneysel kurulum korneanın dışbükey şeklini korur ve enfeksiyonun gerçekleştiği epitelin üstünde bakteri tutar (Şekil 1B).

Tartışmalar

Ex vivo porcine kornea kullanılarak bu keratit modelinin geliştirilmesinin arkasındaki ana sürücü, preklinik aşamalarda antimikrobiyal etkinliği daha doğru bir şekilde belirlemek için yeni antimikrobiyaller geliştiren araştırmacılara temsili bir in vitro model sağlamaktır. Bu, yeni antimikrobiyallerin klinik öncesi aşamalarda ilaç tasarımı ve formülasyonu üzerinde daha fazla kontrol geliştirmesine, klinik çalışmalarda başarıyı artırmasına, hedeflenen çalışmalara olanak sağlayarak hayv...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL Falcon tube	SLS	352070
Amphotericin B	Sigma	A2942
Cellstar 12 well plate	Greiner Bio-One	665180
Dextran	Sigma	31425-100mg-F
Distel	Fisher Scientific	12899357
DMEM + glutamax	SLS	D0819
Dual Oven Incubator	SLS	OVe1020	Sterilising oven
Epidermal growth factor	SLS	E5036-200UG
F12 HAM	Sigma	N4888
Foetal calf serum	Labtech International	CA-115/500
Forceps	Fisher Scientific	15307805
Handheld homogeniser 220	Fisher Scientific	15575809	Homogeniser
Heracell VIOS 160i	Thermo Scientific	15373212	Tissue culture incubator
Heraeus Megafuge 16R	VWR	521-2242	Centrifuge
Insulin, recombinant Human	SLS	91077C-1G
LB agar	Sigma	L2897
Multitron	Infors	Not appplicable	Bacterial incubator
PBS	SLS	P4417
Penicillin-Streptomycin	SLS	P0781
Petri dish	Fisher Scientific	12664785
Petri dish 35x10mm CytoOne	Starlab	CC7672-3340
Povidone iodine	Weldricks pharmacy	2122828
Safe 2020	Fisher Scientific	1284804	Class II microbiology safety cabinet
Scalpel blade number 15	Fisher Scientific	O305
Scalpel Swann Morton	Fisher Scientific	11849002