Stabilire un modello di Cornea ex vivo suina per lo studio dei trattamenti farmacologici contro la cheratite batterica

Riepilogo

Questo articolo descrive un protocollo passo-passo per impostare un modello suino ex vivo di cheratite batterica. Pseudomonas aeruginosa è usato come organismo prototipico. Questo modello innovativo imita l'infezione in vivo in quanto la proliferazione batterica dipende dalla capacità del batterio di danneggiare il tessuto corneale.

Abstract

Quando si sviluppano nuovi antimicrobici, il successo delle sperimentazioni sugli animali dipende da un'accurata estrapolazione dell'efficacia antimicrobica dai test in vitro alle infezioni animali in vivo. I test in vitro esistenti in genere sopravvalutano l'efficacia antimicrobica in quanto la presenza del tessuto ospite come barriera di diffusione non è contabilizzata. Per superare questo collo di bottiglia, abbiamo sviluppato un modello corneale suino ex vivo di cheratite batterica usando Pseudomonas aeruginosa come organismo prototipico. Questo articolo descrive la preparazione della cornea suina e il protocollo per l'istituzione dell'infezione. Gli stampi in vetro su misura consentono una configurazione semplice della cornea per gli studi sulle infezioni. Il modello imita l'infezione in vivo poiché la proliferazione batterica dipende dalla capacità del batterio di danneggiare il tessuto corneale. L'accertamento dell'infezione è verificato come un aumento del numero di unità di formazione della colonia valutate tramite conteggio delle piastre vitali. I risultati dimostrano che l'infezione può essere stabilita in modo altamente riproducibile nelle cornee ex vivo utilizzando il metodo qui descritto. Il modello può essere esteso in futuro per imitare la cheratite causata da microrganismi diversi da P. aeruginosa. Lo scopo finale del modello è quello di indagare l'effetto della chemioterapia antimicrobica sui progressi dell'infezione batterica in uno scenario più rappresentativo delle infezioni in vivo. In tal modo, il modello qui descritto ridurrà l'uso di animali per i test, migliorerà i tassi di successo negli studi clinici e, in ultima analisi, consentirà una rapida traduzione di nuovi antimicrobici in clinica.

Introduzione

Le infezioni corneali sono importanti cause di cecità e si verificano in proporzioni epidemiche nei paesi a basso e medio reddito. L'eziologia della malattia varia da regione a regione, ma i batteri rappresentano la grande maggioranza di questi casi. Pseudomonas aeruginosa è un importante agente patogeno che causa una malattia rapidamente progressiva. In molti casi, i pazienti sono lasciati con cicatrici stromali, astigmatismo irregolare, richiedono trapianto o, nel peggiore dei casi, perdono un^{occhio 1,2}.

La cheratite batterica causata da P. aeruginosa è un'infezione oculare difficile da trattare, in particolare a causa della crescente comparsa di ceppi antimicrobici resistenti di P. aeruginosa. Nell'ultimo decennio, è diventato evidente che i test e lo sviluppo di nuovi trattamenti per le infezioni corneali, in generale, e quelli causati da Pseudomonas sp., in particolare, sono essenziali per combattere l'attuale tendenza nella resistenza agli antibiotici³.

Per testare l'efficacia di nuovi trattamenti per le infezioni corneali, i metodi microbiologici convenzionali in vitro sono un surrogato scadente a causa della differenza nella fisiologia batterica durante la coltura di laboratorio e durante le infezioni in vivo, nonché a causa della mancanza dell'interfaccia ospite^4,5. I modelli animali in vivo, tuttavia, sono costosi e dispendiosi in termini di tempo, possono fornire solo un piccolo numero di repliche e sollevare preoccupazioni sul benessere degli animali.

In questo articolo, dimostriamo un modello di cheratite organotipica ex vivo semplice e riproducibile che può essere utilizzato per testare vari trattamenti per infezioni acute e croniche. Abbiamo usato P. aeruginosa per questo esperimento, ma il modello funziona bene anche con altri batteri e organismi come funghi e lieviti che causano cheratite.

Protocollo

I conigli da laboratorio albini sono stati sacrificati in laboratorio per altri lavori sperimentali pianificati secondo protocolli approvati dall'ufficio domestico. Gli occhi non erano necessari per l'uso sperimentale in quegli studi, quindi sono stati utilizzati per questo protocollo.

1. Sterilizzazione

1. FASE CRITICA: Disinfettare tutte le forcep e le forbici immergendo per 1 h in soluzione 5% (v/v) di Distel in acqua distillata, pulire con una spazzola, risciacquare con acqua del rubinetto e sterilizzare in forno a 185 °C per un minimo di 2 ore.
2. Sterilizzare tutte le altre vetrerie e reagenti in autoclave a 121 °C per 15 minuti o preparare reagenti secondo le istruzioni del produttore. Eseguire le seguenti procedure in un armadio di sicurezza microbiologica di classe II.

2. Raccolta dei campioni

1. Collezione di occhi suini
   1. Grandi scrofe landrace bianche, fu usata una croce con un cinghiale dell'Hampshire. Gli animali sono rimasti sbalorditi da una corrente elettrica e gli occhi sono stati enucleati 2 ore dopo nel mattatoio.
   2. FASE CRITICA: Una volta enucleata, trasferire gli occhi in laboratorio in una soluzione salina tamponata di fosfato sterile (PBS) per evitare che si asciughino e li elaborino immediatamente all'arrivo.
2. Collezione di occhi di coniglio
   1. Asportare le cornee e inviarle al laboratorio in PBS sterile.

3. Preparazione del pulsante corneosclerale

1. Utilizzare forcelle sterili per tenere il tessuto che circonda il bulbo oculare e trasferirlo in una piastra di Petri. Rimuovere la congiuntiva e il tessuto muscolare attorno al bulbo oculare su una piastra di Petri usando la lama bisturi n. 15 e le fasci.
2. Sollevare delicatamente il bulbo oculare tenendo il nervo ottico con le forcep e trasferirlo in un barattolo da 0,5 L riempito con PBS sterile.
3. Una volta che tutti gli occhi sono stati liberati dal tessuto circostante, spostarli usando forcelle sterili in un altro barattolo da 0,5 L riempito con iodio povidone 3% (v / v) in PBS e lasciare per 1 minuto.
4. Trasferire i bulbi oculari in un altro barattolo da 0,5 L con PBS sterile.
5. Utilizzare le forcep per tenere fermo l'occhio su una piastra di Petri e fare un taglio vicino alla cornea con una lama bisturi n. 10A.
6. FASE CRITICA: Tenere il bordo del taglio e utilizzare le forbici per asportare la cornea lasciando circa 3 mm di sclera che circondano la cornea. Assicurarsi che l'estremità affilata delle forbici non perfori l'iride o il tessuto coroiroidale e si trova nello spazio sopracoroidale.
7. Tenere il pulsante corneosclerale con le forcelle e utilizzare un altro paio di forcelle appuntite per separare delicatamente il tessuto uveale.
8. Sollevare il pulsante corneosclerale dal globo rimanente e sciacquarlo brevemente in una soluzione di iodio povidone 1,5% (v/v) in PBS in una piastra da 12 po po.
9. Posizionare il pulsante corneosclerale in un'altra piastra di 12 pozzi piena di PBS sterile.
10. Dopo aver elaborato tutti gli occhi(consigliato massimo 40 occhi in un lotto),posizionare ogni pulsante corneosclerale su una singola piastra di Petri (34 mm di diametro) lato epiteliale verso l'alto e versare 3 mL di mezzo di coltura pre-riscaldato a 37 °C.
    NOTA: La composizione del mezzo di coltura è la seguente: mezzo dell'aquila modificato (DMEM) di Dulbecco: prosciutto [1:1] integrato con insulina 5 μg-mL^-1 e 10 ng-mL^-1 fattore di crescita epidermico (EGF), 10% (v/v) siero fetale del vitello (FCS), 100 U-mL^-1 penicillina, 100 U-mL^-1 streptomicina e 2,5 μg-mL^-1 ampotericina B. Come passaggio opzionale, il mezzo può essere integrato con 50 g-L^-1 dextran per prevenire il gonfiore della cornea accisa durante le ulteriori fasi di incubazione.
11. Incubare a 37 °C in un incubatore di coltura tissutale umidificato.

4. Mantenimento dei bottoni corneosclerali

1. Dopo 24 ore, utilizzare la tecnica aseptica per rimuovere i mezzi e sostituire con 3 mL di mezzi di coltura freschi pre-riscaldati contenenti antibiotici. Tenere i bottoni corneosclerali nei mezzi con antibiotici per 48 ore per disinfettare le cornee. Incubare a 37 °C in un incubatore di coltura tissutale umidificato.
2. FASE CRITICA: Dopo 48 ore, rimuovere il supporto e risciacquare le cornee con 2 mL di PBS. Quindi tenere i pulsanti corneosclerali in mezzi senza antibiotici per un minimo di due o idealmente tre giorni prima dell'infezione sperimentale, per rimuovere gli antibiotici residui dal tessuto.
3. Incubare a 37 °C in un incubatore di coltura tissutale umidificato. Cambia i media almeno un'altra volta entro questi tre giorni. Scartare le cornee se si sviluppa una torbidità nel mezzo privo di antibiotici.

5. Preparazione di un inoculo

1. Versare 10 ml di brodo LB in un pallone conico da 50 ml con un tappo di schiuma.
2. Trasferire una colonia di ceppo P. aeruginosa PAO1 o ceppo PA14 da una piastra di agar fresca e incubare a 37 °C per 3-4 ore fino a quando i batteri sono in fase di registro intermedio.
3. Trasferire la coltura di batteri in un tubo da 50 ml e centrifugare a 3.000 x g per 5 min. Rimuovere il supernatante e sospendere di nuovo il pellet di cella in PBS.
4. Ripetere il passaggio 5.3 altre due volte per lavare le cellule. Sospendere di nuovo il pellet di cellule in PBS e regolare la densità ottica a 600 nm a circa 0,6 utilizzando PBS sterile come vuoto.

6. Infettare il pulsante corneosclerale

1. Rimuovere i supporti dalla piastra di Petri e risciacquare le cornee due volte con 1 mL di PBS sterile.
2. Spremere delicatamente le forcep tenendo la cornea in mezzo. Utilizzare un bisturi 10A per effettuare quattro tagli - due verticali, due orizzontali - nella sezione centrale del pulsante corneosclerale attraverso lo strato epiteliale fino allo stroma sottostante.
3. Posizionare uno stampo di vetro sterile in una piastra di 6 po 'con la parte larga verso l'alto e posizionare la cornea al centro dello stampo di vetro, lato epitelio rivolto verso il basso. Fare il taglio proprio al centro della parte inferiore dello stampo di vetro.
4. FASE CRITICA: Versare 1 mL di 1% (con v) agar a basso punto di fusione sciolto in DMEM per riempire completamente lo stampo di vetro con cornea.
5. Lasciare impostare l'agar e quindi invertire lo stampo di vetro in modo che l'epitelio corneale sia rivolto verso l'alto.
6. Pipetta 15 μL della coltura batterica con OD_600nm = 0,6 (per P. aeruginosa questo equivale a circa 1 x 10^{7 unità} di formazione di colonie (CFU) in 15 μL) direttamente in una zona tagliata e quindi aggiungere 85 μL di PBS alla parte superiore per mantenere umido l'epitelio corneale. Diluire la rimanente coltura batterica e la piastra sull'agar per contare le unità di formazione della colonia per l'inoculo.
7. Aggiungere 1 mL di DMEM senza antibiotici sul fondo di ogni pozzo con lo stampo in vetro. Incubare la piastra a 6 po 'con i bottoni corneosclerali infetti in un incubatore umidificato a 37 °C con 5% di CO₂ per un massimo di 24 ore.
8. Imposta cornea di controllo non infetta insieme ad ogni esperimento. Per impostare il controllo non infetto, sostituire i 15 μL di coltura batterica nella fase 6.6 con PBS sterile.

7. Omogeneizzazione della cornea per raccogliere i batteri

1. Scartare il mezzo DMEM dal fondo della piastra del pozzo 6 e aggiungere 1 mL di PBS sterile per risciacquare il fondo del pozzo.
2. Rimuovere delicatamente pbs pipettando senza toccare la parte centrale del pulsante corneosclerale. Rimuovere l'anello di vetro utilizzando forcep sterili e posizionarlo nel 5% Distel.
3. Risciacquare delicatamente la parte superiore del pulsante corneosclerale con 1 mL di PBS due volte [facoltativo].
4. Tenere il bordo del pulsante corneosclerale con forceps punta fine e staccarlo dall'agar sottostante.
5. Trasferire la cornea in un tubo da 50 ml riempito con ghiaccio freddo 1-2 mL di PBS.
6. Utilizzare un omogeneizzatore a punta fine per aerare la parte superiore della cornea infetta. Il tessuto non deve essere completamente liquidato. L'omogeneizzatore aiuta a staccare i batteri dall'epitelio corneale e dall'area tagliata.
7. Vortice la cornea in PBS per alcuni secondi per mescolare il contenuto.
8. Aggiungere 20 μL dell'omogeneato a 180 μL di PBS ed eseguire diluizioni seriali in una piastra di pozzo 96.
9. Diluire serialmente la sospensione a^{10-4 e} 10-5 diluizione e pipetta 10 μL dell'omogeneato diluito con batteri su una piastra di agar del sangue. Incubare la piastra per 8 ore e contare il numero di CFU. Durante la prova dell'effetto degli antimicrobici, il fattore di diluizione appropriato deve essere raggiunto sperimentalmente.

Risultati

Il design degli stampi in vetro è un'idea innovativa e originale, il cui utilizzo ci ha permesso di allevare il modello in modo coerente con problemi minimi/nessun problema di contaminazione. Gli stampi sono stati preparati da un soffiatore di vetro dell'Università di Sheffield sulla base di un progetto(Figura 1A). La configurazione sperimentale mantiene la forma convessa della cornea e trattiene i batteri sulla parte superiore dell'epitelio in cui avviene l'infezione (

Discussione

Il principale motore alla base dello sviluppo di questo modello di cheratite utilizzando cornea suina ex vivo è quello di fornire ai ricercatori che sviluppano nuovi antimicrobici un modello rappresentativo in vitro per determinare più accuratamente l'efficacia antimicrobica nelle fasi precliniche. Ciò fornirà ai ricercatori coinvolti nello sviluppo di nuovi antimicrobici un maggiore controllo sulla progettazione e la formulazione dei farmaci nelle fasi preclinali, aumenterà il successo negli studi clinici, ridurrà...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL Falcon tube	SLS	352070
Amphotericin B	Sigma	A2942
Cellstar 12 well plate	Greiner Bio-One	665180
Dextran	Sigma	31425-100mg-F
Distel	Fisher Scientific	12899357
DMEM + glutamax	SLS	D0819
Dual Oven Incubator	SLS	OVe1020	Sterilising oven
Epidermal growth factor	SLS	E5036-200UG
F12 HAM	Sigma	N4888
Foetal calf serum	Labtech International	CA-115/500
Forceps	Fisher Scientific	15307805
Handheld homogeniser 220	Fisher Scientific	15575809	Homogeniser
Heracell VIOS 160i	Thermo Scientific	15373212	Tissue culture incubator
Heraeus Megafuge 16R	VWR	521-2242	Centrifuge
Insulin, recombinant Human	SLS	91077C-1G
LB agar	Sigma	L2897
Multitron	Infors	Not appplicable	Bacterial incubator
PBS	SLS	P4417
Penicillin-Streptomycin	SLS	P0781
Petri dish	Fisher Scientific	12664785
Petri dish 35x10mm CytoOne	Starlab	CC7672-3340
Povidone iodine	Weldricks pharmacy	2122828
Safe 2020	Fisher Scientific	1284804	Class II microbiology safety cabinet
Scalpel blade number 15	Fisher Scientific	O305
Scalpel Swann Morton	Fisher Scientific	11849002