Создание porcine Ex Vivo Cornea Модель для изучения лечения наркомании против бактериального кератита

Резюме

В этой статье описывается пошаговой протокол для настройки ex vivo свиной модели бактериального кератита. Pseudomonas aeruginosa используется в качестве прототипа организма. Эта инновационная модель имитирует инфекцию in vivo, поскольку бактериальная пролиферция зависит от способности бактерии повредить ткани роговицы.

Аннотация

При разработке новых противомикробных препаратов успех испытаний на животных зависит от точной экстраполяции эффективности противомикробных препаратов от тестов in vitro до инфекций животных in vivo. Существующие тесты in vitro обычно переоценивают эффективность противомикробных препаратов, поскольку наличие ткани-хозяина в качестве диффузионные барьеры не учитывается. Чтобы преодолеть это узкое место, мы разработали ex vivo свиной роговицы модель бактериального кератита с использованием Pseudomonas aeruginosa в качестве прототипа организма. В этой статье описывается подготовка свиной роговицы и протокол для установления инфекции. Индивидуальные стеклянные формы позволяют простой установки роговицы для исследования инфекции. Модель имитирует инфекцию in vivo, так как бактериальная пролиферция зависит от способности бактерии повредить ткани роговицы. Установление инфекции проверяется как увеличение числа колоний, образующих единицы, оцениваемые с помощью жизнеспособных подсчетов пластин. Результаты показывают, что инфекция может быть установлена в весьма воспроизводимой моды в ex vivo роговицы с использованием метода, описанного здесь. Модель может быть расширена в будущем, чтобы имитировать кератит, вызванный микроорганизмами, кроме P. aeruginosa. Конечная цель модели заключается в расследовании влияния противомикробной химиотерапии на прогресс бактериальной инфекции в сценарии более представительный инфекций in vivo. При этом описанная здесь модель позволит сократить использование животных для тестирования, повысить показатели успешности клинических испытаний и в конечном итоге обеспечить быстрый перевод новых противомикробных препаратов в клинику.

Введение

Инфекции роговицы являются важными причинами слепоты и происходят в масштабах эпидемии в странах с низким и средним уровнем дохода. Этиология заболевания варьируется от региона к региону, но бактерии составляют подавляющее большинство этих случаев. Pseudomonas aeruginosa является важным патогеном, который вызывает быстро прогрессирующее заболевание. Во многих случаях пациенты остаются с стромальными рубцами, нерегулярным астигматизмом, требуют пересадки или в худшем случае теряют^{глаз 1,2.}

Бактериальный кератит, вызванный P. aeruginosa является трудно глазной инфекции для лечения особенно в связи с увеличением появления противомикробных устойчивых штаммов P. aeruginosa. В течение последнего десятилетия, стало очевидно, что тестирование и разработка новых методов лечения инфекций роговицы, в целом, и те, вызванные Pseudomonas sp., в частности, имеют важное значение для борьбы с нынешней тенденцией в устойчивости к^{антибиотикам 3}.

Для тестирования эффективности новых методов лечения инфекций роговицы, обычные микробиологические методы in vitro являются плохой суррогатной из-за разницы в бактериальной физиологии во время лабораторной культуры и во время инфекций in vivo, а также из-за отсутствия^{интерфейса хозяина 4,5}. В vivo животных моделей, однако, являются дорогостоящими, трудоемкими, может доставить лишь небольшое количество репликаций и поднять озабоченность по поводу благополучия животных.

В этой статье мы демонстрируем простую и воспроизводимую органотипную модель свинины ex vivo, которая может быть использована для тестирования различных методов лечения острых и хронических инфекций. Мы использовали P. aeruginosa для этого эксперимента, но модель также хорошо работает с другими бактериями, и организмы, такие как грибы и дрожжи, которые вызывают кератит.

протокол

Альбино лабораторных кроликов были принесены в жертву в лаборатории для других запланированных экспериментальных работ в соответствии с домашним офисом утвержденных протоколов. Глаза не были необходимы для экспериментального использования в этих исследованиях, поэтому они были использованы для этого протокола.

1. Стерилизация

1. CRITICAL STEP: Дезинфицировать все типсы и ножницы, замачивая в течение 1 ч в 5% (v/v) раствор Distel в дистиллированной воде, очистить щеткой, промыть водопроводной водой и стерилизовать в духовке при температуре 185 градусов по Цельсию в течение как минимум 2 ч.
2. Стерилизовать все остальные стеклянные изделия и реагенты, автоклав при 121 градусе по Цельсию в течение 15 минут или подготовить реагенты в соответствии с инструкциями производителя. Выполнить следующие процедуры в кабинете безопасности микробиологии II класса.

2. Сбор образцов

1. Коллекция свиных глаз
   1. Большие белые сеют землю, был использован крест с кабаном Хэмпшира. Звери были ошеломлены электрическим током и глаза были enucleated 2 ч позже в скотобойне.
   2. CRITICAL STEP: После того, как enucleated, передать глаза в лабораторию в стерильный фосфат буферизированный солевой раствор (PBS), чтобы предотвратить их от высыхания и обрабатывать их сразу по прибытии.
2. Коллекция кролика глаза
   1. Акциз роговицы и отправить в лабораторию в стерильных PBS.

3. Подготовка роговицы кнопки

1. Используйте стерильные типсы, чтобы удерживать ткани, окружающие глазное яблоко, и передавать его в чашку Петри. Удалите конъюнктиву и мышечную ткань вокруг глазного яблока на чашке Петри с помощью скальпельного лезвия No 15 и типсов.
2. Аккуратно поднимите глазное яблоко, удерживая зрительный нерв с типсами и перенесите в банку 0,5 л, наполненную стерильным PBS.
3. После того, как все глаза очищены от окружающих тканей, переместить их с помощью стерильных типсов в другой 0,5 л банку заполнены 3% (V / V) povidone йода в PBS и оставить на 1 мин.
4. Перенесите глазные яблоки в другую банку 0,5 л со стерильным PBS.
5. Используйте типсы, чтобы держать глаз еще на чашке Петри и сделать разрез возле роговицы скальпелем лезвие No 10A.
6. CRITICAL STEP: Держите край разреза и используйте ножницы, чтобы подрезать роговицу, оставляя около 3 мм склеры, окружающей роговицу. Убедитесь, что острый конец ножниц не пронзает радужную оболочку или хороидную ткань и находится в надхоровидном пространстве.
7. Держите роговицы кнопку с типсами и использовать другую пару остроконечных конечных типсов, чтобы мягко отделить увеальной ткани.
8. Поднимите роговицу от оставшегося глобуса и кратко промойте ее в 1,5% (v/v) раствора йода в PBS в 12 хорошо пластины.
9. Поместите роговицу кнопку в другой 12 хорошо пластины заполнены стерильными PBS.
10. После обработки всех глаз(рекомендуется максимум 40 глаз в одной партии),поместите каждую роговицу кнопку на индивидуальную чашку Петри (диаметр 34 мм) эпителиальной стороной вверх и влейте в 3 мл среды культуры предварительно разогретую до 37 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Состав среды культуры таков: модифицированная среда орла Дульбекко (DMEM): Хам в «1:1» дополнен 5^{мкгл -1} инсулином и 10^{ng'mL -1} эпидермальным фактором роста (EGF), 10% (v/v) сывороткой теленка плода (FCS), 100^{U'mL -1} penicillin, 100 УМЛ^-1 стрептомицин и 2,5^{мкг-мл -1} амфотерицин Б. В качестве дополнительного шага, среда может быть дополнена 50^{г-л -1} декстран, чтобы предотвратить отек вырезанной роговицы во время дальнейших шагов инкубации.
11. Инкубация при 37 градусов по Цельсию в инкубаторе культуры увлажненной ткани.

4. Обслуживание кукурузных кнопок

1. Через 24 часа используйте асептический метод для удаления мультимедиа и замены 3 мл свежих предварительно разогретых средств культуры, содержащих антибиотики. Держите роговицы кнопки в средствах массовой информации с антибиотиками в течение 48 ч для дезинфекции роговицы. Инкубация при 37 градусов по Цельсию в инкубаторе культуры увлажненной ткани.
2. CRITICAL STEP: После 48 часов, удалить средства массовой информации и промыть роговицы с 2 мл PBS. Затем держите кукурузные кнопок в без антибиотиков средств массовой информации в течение как минимум двух или в идеале за три дня до экспериментальной инфекции, чтобы удалить остаточные антибиотики из ткани.
3. Инкубация при 37 градусов по Цельсию в инкубаторе культуры увлажненной ткани. Изменение средств массовой информации по крайней мере еще раз в течение этих трех дней. Откажитесь от роговицы, если какая-либо мутность развивается в среде, свободной от антибиотиков.

5. Подготовка инокулума

1. Налейте 10 мл бульона LB в коническую колбу 50 мл с пенопластовой пробкой.
2. Передача колонии P. aeruginosa штамм PAO1 или штамм PA14 из свежей пластины агара и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 3-4 ч, пока бактерии находятся в середине этапа журнала.
3. Перенесите культуру бактерий в трубку и центрифугу 50 мл при 3000 х г в течение 5 мин. Удалите супернатант и повторно приостановить гранулы клетки в PBS.
4. Повторите шаг 5.3 еще два раза, чтобы вымыть клетки. Повторно приостанавливайте гранулы клеток в PBS и отрегулируйте оптическую плотность на 600 нм примерно до 0,6, используя стерильный PBS в качестве пробела.

6. Заражение роговицы кнопку

1. Удалить средства массовой информации из чашки Петри и промыть роговицы дважды с 1 мл стерильных PBS.
2. Аккуратно сожмите типсы, удерживая роговицу между ними. Используйте скальпель 10A, чтобы сделать четыре разреза - два вертикальных, два горизонтальных - в центральной части роговицы кнопки через эпителиальный слой к основной строме.
3. Поместите стерильную стеклянную форму в 6-хорошо пластины с широкой частью вверх и место роговицы в середине стеклянной формы, эпителия стороны лицом вниз. Сделайте разрез прямо в центре нижней части стеклянной формы.
4. CRITICAL STEP: Налейте 1 мл 1% (w/v) низкой точки плавления агара, растворенного в DMEM, чтобы полностью заполнить стеклянную форму роговицей.
5. Разрешить агар установить, а затем инвертировать стеклянную форму так, что эпителий роговицы сталкивается вверх.
6. Pipette 15 йл бактериальной культуры с OD_600nm 0,6 (для P. aeruginosa это приравнивается к примерно 1 х^{10 7 единиц} колонии формирования (CFU) в 15 йл) непосредственно в разрезе области, а затем добавить 85 йЛ PBS к вершине, чтобы сохранить эпителий роговицы влажной. Разбавить оставшуюся бактериальную культуру и пластину на агаре, чтобы посчитать колонию, образуя единицы для инокулума.
7. Добавить 1 мл DMEM без антибиотиков на дно каждого хорошо со стеклянной плесенью. Инкубировать 6-хорошо пластины с инфицированными роговицы кнопки в увлажненной инкубатор при 37 градусов по Цельсию с 5% CO₂ на срок до 24 ч.
8. Настройка неинфицированных контроля роговицы наряду с каждым экспериментом. Чтобы настроить неинфицированный контроль, замените 15 МКЛ бактериальной культуры в шаге 6.6 стерильным PBS.

7. Гомогенизация роговицы для сбора бактерий

1. Отбросьте среду DMEM из нижней части пластины 6 хорошо и добавить 1 мл стерильных PBS для полоскания нижней части хорошо.
2. Снимите PBS осторожно, трубя, не касаясь центральной части роговицы кнопки. Снимите стеклянное кольцо с помощью стерильных типсов и поместите его в 5% Distel.
3. Аккуратно промойте верхнюю часть роговицы с помощью 1 мл PBS дважды .optional.
4. Держите край роговицы кнопку с тонкой типсы кончика и отделить его от агара под ним.
5. Перенесите роговицу в трубку 50 мл, наполненную ледяным холодом 1-2 мл PBS.
6. Используйте тонкий кончик гомогенизатора, чтобы чисто верхней части инфицированной роговицы. Ткань не должна быть полностью ликвидирована. Гомогенизатор помогает отделить бактерии от эпителия роговицы и области разреза.
7. Vortex роговицы в PBS в течение нескольких секунд, чтобы смешать содержимое.
8. Добавьте 20 МКЛ гомогената в 180 МКЛ PBS и выполните серийные разбавления в пластине 96 хорошо.
9. Серийно разбавляют суспензию до 10^-4 и 10^-5 разбавления и пипетки 10 МКЛ разбавленного гомогената бактериями на агарную пластину крови. Инкубировать тарелку в течение 8 часов и подсчитать количество CFU. При тестировании эффекта противомикробных препаратов, соответствующий фактор разбавления должны быть прибыли в экспериментальном порядке.

Результаты

Дизайн стеклянных форм являются инновационной и оригинальной идеей, использование которой позволило нам настроить модель в последовательной моды с минимальными / нет проблем с загрязнением. Формы были подготовлены стеклодувом в Университете Шеффилда на основе дизайна(рис...

Обсуждение

Основной причиной разработки этой модели кератита с использованием ex vivo свиной роговицы является предоставление исследователям, разрабатывая новые противомикробные препараты с репрезентативной моделью in vitro для более точного определения эффективности противомикробных препаратов ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL Falcon tube	SLS	352070
Amphotericin B	Sigma	A2942
Cellstar 12 well plate	Greiner Bio-One	665180
Dextran	Sigma	31425-100mg-F
Distel	Fisher Scientific	12899357
DMEM + glutamax	SLS	D0819
Dual Oven Incubator	SLS	OVe1020	Sterilising oven
Epidermal growth factor	SLS	E5036-200UG
F12 HAM	Sigma	N4888
Foetal calf serum	Labtech International	CA-115/500
Forceps	Fisher Scientific	15307805
Handheld homogeniser 220	Fisher Scientific	15575809	Homogeniser
Heracell VIOS 160i	Thermo Scientific	15373212	Tissue culture incubator
Heraeus Megafuge 16R	VWR	521-2242	Centrifuge
Insulin, recombinant Human	SLS	91077C-1G
LB agar	Sigma	L2897
Multitron	Infors	Not appplicable	Bacterial incubator
PBS	SLS	P4417
Penicillin-Streptomycin	SLS	P0781
Petri dish	Fisher Scientific	12664785
Petri dish 35x10mm CytoOne	Starlab	CC7672-3340
Povidone iodine	Weldricks pharmacy	2122828
Safe 2020	Fisher Scientific	1284804	Class II microbiology safety cabinet
Scalpel blade number 15	Fisher Scientific	O305
Scalpel Swann Morton	Fisher Scientific	11849002