הקמת דגם חזיר אקס ויוו קרנית לחקר טיפולים תרופתיים נגד קרטיטיס בקטריאלי

Summary

מאמר זה מתאר פרוטוקול שלב אחר שלב כדי להגדיר מודל אקס ויוו חזירי של קרטיטיס חיידקי. פסאודומונס ארוגינוזה משמש כאורגניזם אב-טיפוס. מודל חדשני זה מחקה זיהום vivo כמו התפשטות חיידקים תלויה ביכולתו של החיידק לפגוע ברקמת הקרנית.

Abstract

בעת פיתוח מיקרוביאלית חדשנית, ההצלחה של ניסויים בבעלי חיים תלויה אקסטרפולציה מדויקת של יעילות מיקרוביאלית מבדיקות במבחנה לזיהומים בבעלי חיים vivo. בדיקות במבחנה הקיימות בדרך כלל מעריכות יתר על המידה את היעילות האנטי-מיקרוביאלית מכיוון שנוכחות רקמה מארחת כמחסום דיפוזיה אינה נחשבת. כדי להתגבר על צוואר בקבוק זה, פיתחנו מודל הקרנית אקס ויוו חזירי של קרטיטיס חיידקי באמצעות Pseudomonas aeruginosa כאורגניזם אב טיפוס. מאמר זה מתאר את הכנת הקרנית חזירית ופרוטוקול להקמת הזיהום. תבניות זכוכית העידו לאפשר התקנה פשוטה של הקרנית למחקרי זיהום. המודל מחקה זיהום vivo כמו התפשטות חיידקים תלויה ביכולתו של החיידק לפגוע ברקמת הקרנית. הקמת זיהום מאומתת כגידול במספר יחידות יוצרות המושבה המוערכות באמצעות ספירת לוחיות רישוי בנות קיימא. התוצאות מראות כי זיהום ניתן להקים בצורה לשחזור מאוד בקרניות ex vivo באמצעות השיטה המתוארת כאן. המודל יכול להיות מורחב בעתיד לחקות קרטיטיס הנגרמת על ידי מיקרואורגניזמים שאינם P. aeruginosa. המטרה הסופית של המודל היא לחקור את ההשפעה של כימותרפיה מיקרוביאלית על ההתקדמות של זיהום חיידקי בתרחיש מייצג יותר של זיהומים in vivo. בכך, המודל המתואר כאן יפחית את השימוש בבעלי חיים לבדיקות, ישפר את שיעורי ההצלחה בניסויים קליניים ובסופו של דבר יאפשר תרגום מהיר של מיקרוביאליות חדשניות למרפאה.

Introduction

זיהומים בקרנית הם גורמים חשובים לעיוורון ומתרחשים בממדי מגיפה במדינות בעלות הכנסה נמוכה ובינונית. האטיולוגיה של המחלה משתנה מאזור לאזור אבל חיידקים מהווים רוב גדול של מקרים אלה. Pseudomonas aeruginosa הוא פתוגן חשוב שגורם למחלה מתקדמת במהירות. במקרים רבים, חולים נשארים עם צלקות סטרומה, אסטיגמציה לא סדירה, דורשים השתלה או בתרחיש הגרוע ביותר, לאבד^{עין 1,2}.

קרטיטיס בקטריאלי הנגרם על ידי P. aeruginosa הוא זיהום עיניים קשה לטיפול במיוחד בשל הופעתה הגוברת של זנים עמידים מיקרוביאלית של P. aeruginosa. בעשור האחרון, התברר כי בדיקות ופיתוח טיפולים חדשים עבור זיהומים הקרנית, בכלל, ואלה הנגרמים על ידי Pseudomonas sp., בפרט, חיוניים כדי להילחם במגמה הנוכחית עמידות לאנטיביוטיקה³.

לבדיקת היעילות של טיפולים חדשים לזיהומים בקרנית, שיטות מיקרוביולוגיות במבחנה קונבנציונליות הן פונדקאית גרועה בשל ההבדל בפיזיולוגיה החיידקית במהלך תרבות המעבדה ובמהלך זיהומים ב vivo, כמו גם בשל היעדר ממשק המארח^4,5. מודלים של בעלי חיים Vivo, לעומת זאת, הם יקרים, זמן רב, יכול רק לספק מספר קטן של משכפלים ולהעלות חששות לגבי רווחת בעלי החיים.

במאמר זה, אנו מדגימים פשוט לשחזור organotypic ex vivo דגם חזירי של קרטיטיס שניתן להשתמש בהם כדי לבדוק טיפולים שונים עבור זיהומים חריפים וכרוניים. השתמשנו P. aeruginosa עבור ניסוי זה, אבל המודל עובד גם היטב עם חיידקים אחרים, ואורגניזמים כגון פטריות ושמרים הגורמים קרטיטיס.

Protocol

ארנבי מעבדה לבקנים הוקרבו במעבדה לעבודות ניסיוניות מתוכננות אחרות תחת פרוטוקולים שאושרו על ידי משרד הפנים. העיניים לא נדרשו לשימוש ניסיוני במחקרים אלה ולכן הם שימשו לפרוטוקול זה.

1. עיקור

1. שלב קריטי: לחטא את כל המלקחיים והמספריים על ידי השרייה של 1 שעות בתמיסת 5% (v/v) של דיסטל במים מזוקקים, לנקות עם מברשת, לשטוף במי ברז לעקר בתנור ב 185 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות לפחות.
2. לעקר את כל כלי זכוכית אחרים ריאגנטים על ידי autoclaving ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות או להכין ריאגנטים על פי הוראות היצרן. בצע את ההליכים הבאים בארון בטיחות מיקרוביולוגיה מדרגה 2.

2. אוסף לדוגמה

1. אוסף עיניים חזיריות
   1. חזירי יבשה לבנים גדולים, צלב עם חזיר בר המפשייר שימש. בעלי החיים היו המומים עם זרם חשמלי והעיניים היו חנוקות 2 שעות מאוחר יותר בבית המטבחיים.
   2. שלב קריטי: לאחר ההסתבכות, העבירו את העיניים למעבדה בתמיסת מלח סטרילית עם אגירת פוספט (PBS) כדי למנוע מהן להתייבש ולעבד אותן מיד עם ההגעה.
2. אוסף עיני ארנב
   1. בלו את הקרניות ולשלוח למעבדה ב PBS סטרילי.

3. הכנת כפתור הקרנית

1. השתמש מלקחיים סטריליים להחזיק את הרקמה המקיפה את גלגל העין ולהעביר אותו לצלחת פטרי. הסר את הלחמית ורקמת השריר סביב גלגל העין על צלחת פטרי באמצעות להב אזמל מס '15 ומלקחיים.
2. בעדינות להרים את גלגל העין תוך החזקת עצב הראייה עם מלקחיים ולהעביר לצנצנת 0.5 L מלא PBS סטרילי.
3. לאחר שכל העיניים מנוקות מהרקמה שמסביב, להעביר אותם באמצעות מלקחיים סטריליים עוד 0.5 L צנצנת מלא 3% (v / v) יוד povidone ב PBS ולהשאיר במשך 1 דקות.
4. העבר גלגלי עיניים לצנצנת 0.5 L נוספת עם PBS סטרילי.
5. השתמש מלקחיים להחזיק את העין עדיין על צלחת פטרי ולעשות חתך ליד הקרנית עם להב אזמל לא 10A.
6. צעד קריטי: החזיקו את קצה החתך והשתמשו במספריים כדי לבלום את הקרנית ולהשאיר כ -3 מ"מ של סקלרה המקיפה את הקרנית. ודא את הקצה החד של מספריים לא לנקב את הקשתית או רקמת choroidal והוא בחלל סופרה-choroidal.
7. החזק את כפתור corneoscleral עם מלקחיים ולהשתמש זוג אחר של מלקחיים קצה מחודד להפריד בעדינות את רקמת uveal.
8. הרם את כפתור corneoscleral מן הגלובוס הנותרים ולשטוף אותו בקצרה 1.5% (v / v) פתרון יוד povidone ב PBS בצלחת 12 גם.
9. מניחים את כפתור corneoscleral לתוך צלחת נוספת 12 היטב מלא PBS סטרילי.
10. לאחר עיבוד כל העיניים(מומלץ מקסימום 40 עיניים באצווה אחת),מניחים כל כפתור corneoscleral לצלחת פטרי בודדים (קוטר 34 מ"מ) צד אפיתל למעלה ויוצקים 3 מ"ל של תרבות בינונית מראש מחומם ל 37 °C (69 °F).
    הערה: ההרכב של מדיום התרבות הוא כדלקמן: המדיום של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM): של בשר חזיר [1:1] בתוספת 5 מיקרוגרם ∙ mL^{-1 אינסולין} ו 10 ng∙mL^{-1 גורם גדילה} אפידרמיס (EGF), 10% (v/v) סרום עגל עוברי (FCS), 100 U∙mL^-1 פניצילין, 100 U∙mL^-1 סטרפטומיצין ו-2.5 מיקרוגרם∙mL^-1 אמפוטריצין B. כצעד אופציונלי, ניתן להשלים את המדיום עם 50^g∙L-1 dextran כדי למנוע נפיחות של הקרנית שנכרתה במהלך שלבי הדגירה הנוספים.
11. דגירה ב 37 °C (69 °F) באינקובטור תרבית רקמות לחה.

4. תחזוקה של כפתורי corneoscleral

1. לאחר 24 שעות, השתמש בטכניקה אספטית כדי להסיר מדיה ולהחליף עם 3 מ"ל של מדיה תרבות רעננה מראש מחומם המכיל אנטיביוטיקה. שמור את הכפתורים corneoscleral במדיה עם אנטיביוטיקה במשך 48 שעות כדי לחטא את הקרניות. דגירה ב 37 °C (69 °F) באינקובטור תרבית רקמות לחה.
2. שלב קריטי: לאחר 48 שעות, להסיר את התקשורת ולשטוף קרניות עם 2 מ"ל של PBS. לאחר מכן לשמור את הכפתורים corneoscleral במדיה ללא אנטיביוטיקה במשך מינימום של יומיים או אידיאלי שלושה ימים לפני זיהום ניסיוני, כדי להסיר אנטיביוטיקה שיורית מן הרקמה.
3. דגירה ב 37 °C (69 °F) באינקובטור תרבית רקמות לחה. שנה מדיה לפחות פעם אחת נוספת בשלושת הימים הבאים. השלך קרניות אם כל עכירות מתפתחת במדיום ללא אנטיביוטיקה.

5. הכנת אינקולום

1. יוצקים 10 מ"ל של מרק LB לתוך בקבוק חרוט 50 מ"ל עם פקק קצף.
2. להעביר מושבה של P. aeruginosa זן PAO1 או זן PA14 מצלחת אגר טרי דגירה ב 37 °C (69 °F) עבור 3-4 שעות עד החיידקים נמצאים בשלב באמצע יומן.
3. להעביר את התרבות של חיידקים צינור 50 מ"ל וצנטריפוגה ב 3,000 x g במשך 5 דקות. הסר את supernatant ולהשעות מחדש את גלולת התא ב- PBS.
4. חזור על שלב 5.3 פעמיים נוספות כדי לשטוף את התאים. להשעות מחדש את גלולת התא ב PBS ולהתאים את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר לכ 0.6 באמצעות PBS סטרילי כמו ריק.

6. הדבקת כפתור corneoscleral

1. הסר את המדיה מצלחת פטרי ולשטוף קרניות פעמיים עם 1 מ"ל של PBS סטרילי.
2. בעדינות לסחוט מלקחיים תוך החזקת הקרנית באמצע. השתמש אזמל 10A לעשות ארבעה חתכים - שני אנכי, שני אופקי - בחלק המרכזי של כפתור corneoscleral דרך שכבת האפיתל אל סטרומה הבסיסית.
3. מניחים תבנית זכוכית סטרילית בצלחת של 6 בארות עם החלק הרחב למעלה ומניחים את הקרנית באמצע תבנית הזכוכית, צד אפיתל הפונה כלפי מטה. הפוך את החתך ממש במרכז החלק התחתון של תבנית הזכוכית.
4. שלב קריטי: יוצקים 1 מ"ל של 1% (w / v) נקודת התכה נמוכה אגר מומס DMEM כדי למלא את תבנית הזכוכית עם קרנית לחלוטין.
5. אפשר אגר להגדיר ולאחר מכן להפוך את עובש הזכוכית, כך אפיתל הקרנית פונה כלפי מעלה.
6. פיפטה 15 μL של תרבות החיידקים עם OD_600nm = 0.6 (עבור P. aeruginosa זה משווה כ 1 x 10⁷ יחידות יוצרות מושבה (CFU) ב 15 μL) ישירות לתוך אזור לחתוך ולאחר מכן להוסיף 85 μL של PBS לפסגה כדי לשמור על קרנית אפיתל לחות. לדלל את התרבות החיידקית הנותרת ואת הצלחת על אגר לספור יחידות להרכיב מושבה עבור inoculum.
7. מוסיפים 1 מ"ל של DMEM ללא אנטיביוטיקה לתחתית כל באר עם תבנית הזכוכית. דגירה צלחת 6-well עם כפתורי corneoscleral נגועים באינקובטור לח ב 37 °C (67 °F) עם 5% CO₂ עבור עד 24 שעות.
8. הקם קרנית בקרה לא מודבקת לצד כל ניסוי. כדי להגדיר שליטה לא מודבקת, החלף את 15 μL של תרבות החיידקים בשלב 6.6 עם PBS סטרילי.

7. הומוגניזציה של הקרנית כדי לקצור את החיידקים

1. השלך את מדיום DMEM מתחתית צלחת 6 באר ולהוסיף 1 מ"ל של PBS סטרילי לשטוף את החלק התחתון של הבאר.
2. הסר PBS בעדינות על ידי pipetting מבלי לגעת בחלק המרכזי של כפתור corneoscleral. הסר את טבעת הזכוכית באמצעות מלקחיים סטריליים ומניחים אותה ב- 5% Distel.
3. שטפו בעדינות את החלק העליון של כפתור הקרנית עם 1 מ"ל של PBS פעמיים [אופציונלי].
4. החזיקו את קצה כפתור הקרניאוסקלרל עם מלקחיים עדינים וניתק אותו מהאגר שמתחת.
5. מעבירים את הקרנית לצינור 50 מ"ל מלא בקרח קר 1-2 מ"ל של PBS.
6. השתמש homogenizer קצה עדין כדי להטות את החלק העליון של הקרנית נגוע. הרקמה לא צריכה להיות מחוסלת לחלוטין. homogenizer מסייע לנתק חיידקים מן האפיתל הקרנית ואת האזור לחתוך.
7. וורטקס הקרנית ב PBS במשך כמה שניות כדי לערבב את התוכן.
8. הוסף 20 μL של הומוגנט ל 180 μL של PBS ולבצע דילול סדרתי בצלחת 96 היטב.
9. לדלל באופן סדרתי את ההשעיה ל 10^-4 ו 10^-5 דילול פיפטה 10 μL של הומוגנט מדולל עם חיידקים על צלחת אגר דם. דגירה את הצלחת במשך 8 שעות ולספור את מספר CFU. כאשר בודקים את ההשפעה של מיקרוביאלים, גורם הדילול המתאים חייב להגיע באופן ניסיוני.

תוצאות

העיצוב של תבניות הזכוכית הוא רעיון חדשני ומקורי, שהשימוש בו איפשר לנו להקים את המודל בצורה עקבית עם בעיות מינימליות / ללא זיהום. התבניות הוכנו על ידי מפוח זכוכית באוניברסיטת שפילד על בסיס עיצוב (איור 1A). המערך הניסיוני שומר על צורת הקמור של הקרנית ומחזיק חיידקים בחלק העליון ...

Discussion

המניע העיקרי מאחורי הפיתוח של מודל זה קרטיטיס באמצעות הקרנית אקס ויוו חזירי היא לספק לחוקרים פיתוח antimicrobials הרומן עם מודל במבחנה נציג כדי לקבוע בצורה מדויקת יותר יעילות מיקרוביאלית בשלבים הפרה-קוליניים. זה יספק לחוקרים המעורבים בפיתוח מיקרוביאלים חדשים שליטה רבה יותר על תכנון וניסוח תרו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL Falcon tube	SLS	352070
Amphotericin B	Sigma	A2942
Cellstar 12 well plate	Greiner Bio-One	665180
Dextran	Sigma	31425-100mg-F
Distel	Fisher Scientific	12899357
DMEM + glutamax	SLS	D0819
Dual Oven Incubator	SLS	OVe1020	Sterilising oven
Epidermal growth factor	SLS	E5036-200UG
F12 HAM	Sigma	N4888
Foetal calf serum	Labtech International	CA-115/500
Forceps	Fisher Scientific	15307805
Handheld homogeniser 220	Fisher Scientific	15575809	Homogeniser
Heracell VIOS 160i	Thermo Scientific	15373212	Tissue culture incubator
Heraeus Megafuge 16R	VWR	521-2242	Centrifuge
Insulin, recombinant Human	SLS	91077C-1G
LB agar	Sigma	L2897
Multitron	Infors	Not appplicable	Bacterial incubator
PBS	SLS	P4417
Penicillin-Streptomycin	SLS	P0781
Petri dish	Fisher Scientific	12664785
Petri dish 35x10mm CytoOne	Starlab	CC7672-3340
Povidone iodine	Weldricks pharmacy	2122828
Safe 2020	Fisher Scientific	1284804	Class II microbiology safety cabinet
Scalpel blade number 15	Fisher Scientific	O305
Scalpel Swann Morton	Fisher Scientific	11849002