Establecer un modelo de córnea ex vivo porcina para estudiar tratamientos farmacológicos contra la queratitis bacteriana

Resumen

Este artículo describe un protocolo paso a paso para establecer un modelo ex vivo porcino de queratitis bacteriana. Pseudomonas aeruginosa se utiliza como organismo prototípico. Este modelo innovador imita la infección in vivo, ya que la proliferación bacteriana depende de la capacidad de la bacteria para dañar el tejido corneal.

Resumen

Al desarrollar nuevos antimicrobianos, el éxito de los ensayos con animales depende de la extrapolación precisa de la eficacia antimicrobiana de las pruebas in vitro a las infecciones animales in vivo. Las pruebas in vitro existentes suelen sobreestimar la eficacia antimicrobiana, ya que no se tiene en cuenta la presencia de tejido huésped como barrera de difusión. Para superar este cuello de botella, hemos desarrollado un modelo corneal porcino ex vivo de queratitis bacteriana utilizando Pseudomonas aeruginosa como organismo prototípico. Este artículo describe la preparación de la córnea porcina y el protocolo para el establecimiento de la infección. Los moldes de vidrio a medida permiten una configuración sencilla de la córnea para estudios de infección. El modelo imita la infección in vivo, ya que la proliferación bacteriana depende de la capacidad de la bacteria para dañar el tejido corneal. El establecimiento de la infección se verifica como un aumento en el número de unidades formadoras de colonias evaluadas a través de recuentos de placas viables. Los resultados demuestran que la infección se puede establecer de una manera altamente reproducible en las córneas ex vivo utilizando el método descrito aquí. El modelo se puede extender en el futuro para imitar la queratitis causada por microorganismos distintos de P. aeruginosa. El objetivo final del modelo es investigar el efecto de la quimioterapia antimicrobiana en el progreso de la infección bacteriana en un escenario más representativo de las infecciones in vivo. Al hacerlo, el modelo descrito aquí reducirá el uso de animales para las pruebas, mejorará las tasas de éxito en los ensayos clínicos y, en última instancia, permitirá la traducción rápida de nuevos antimicrobianos a la clínica.

Introducción

Las infecciones corneales son causas importantes de ceguera y se producen en proporciones epidémicas en los países de ingresos bajos y medianos. La etiología de la enfermedad varía de una región a otra, pero las bacterias representan la gran mayoría de estos casos. Pseudomonas aeruginosa es un patógeno importante que causa una enfermedad rápidamente progresiva. En muchos casos, los pacientes se quedan con cicatrices estromales, astigmatismo irregular, requieren trasplante o en el peor de los casos, pierden un ojo^1,2.

La queratitis bacteriana causada por P. aeruginosa es una infección ocular difícil de tratar particularmente debido a la creciente aparición de cepas resistentes a los antimicrobianos de P. aeruginosa. En la última década, se ha hecho evidente que las pruebas y el desarrollo de nuevos tratamientos para las infecciones corneales, en general, y los causados por Pseudomonas sp., en particular, son esenciales para combatir la tendencia actual en la resistencia a los antibióticos^3.

Para la prueba de la eficacia de nuevos tratamientos para infecciones corneales, los métodos microbiológicos in vitro convencionales son un sustituto pobre debido a la diferencia en la fisiología bacteriana durante el cultivo de laboratorio y durante las infecciones in vivo, así como debido a la falta de la interfaz huésped^4,5. Los modelos animales in vivo, sin embargo, son caros, que consumen mucho tiempo, sólo pueden ofrecer un pequeño número de réplicas y plantear preocupaciones sobre el bienestar animal.

En este artículo, demostramos un modelo de queratitis orgánica ex vivo organotípica simple y reproducible que se puede utilizar para probar varios tratamientos para infecciones agudas y crónicas. Hemos utilizado P. aeruginosa para este experimento, pero el modelo también funciona bien con otras bacterias, y organismos como hongos y levaduras que causan queratitis.

Protocolo

Los conejos de laboratorio albino fueron sacrificados en el laboratorio para otros trabajos experimentales planificados bajo protocolos aprobados por el ministerio del interior. Los ojos no eran necesarios para su uso experimental en esos estudios, por lo que se utilizaron para este protocolo.

1. Esterilización

1. PASO CRÍTICO: Desinfectar todas las fórceps y tijeras remojando durante 1 h en 5% (v/v) solución de Distel en agua destilada, limpiar con un cepillo, enjuagar con agua del grifo y esterilizar en un horno a 185 °C durante un mínimo de 2 h.
2. Esterilizar todos los demás cristalerías y reactivos mediante autoclaving a 121 °C durante 15 minutos o preparar reactivos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Lleve a cabo los siguientes procedimientos en un gabinete de seguridad microbiológica de clase II.

2. Colección de muestras

1. Colección de ojos porcinos
   1. Grandes cerdas blancas de landrace, se utilizó una cruz con un jabalí de Hampshire. Los animales quedaron aturdidos con una corriente eléctrica y los ojos fueron enucleados 2 h más tarde en el matadero.
   2. PASO CRÍTICO: Una vez enucleado, transfiera los ojos al laboratorio en una solución estéril de solución salina tamponada de fosfato (PBS) para evitar que se sequen y los procese inmediatamente a su llegada.
2. Colección de ojos de conejo
   1. Excitar las córneas y enviar al laboratorio en PBS estéril.

3. Preparación del botón corneoscleral

1. Utilice fórceps estériles para sostener el tejido que rodea el globo ocular y transferirlo a una placa de Petri. Retire la conjuntiva y el tejido muscular alrededor del globo ocular en una placa de Petri usando la hoja del bisturí nº 15 y los fórceps.
2. Levante suavemente el globo ocular mientras sostiene el nervio óptico con fórceps y transfiéralo a un frasco de 0,5 L lleno de PBS estéril.
3. Una vez que todos los ojos estén despejados del tejido circundante, muévalo usando fórceps estériles a otro frasco de 0,5 L lleno de yodo povidone del 3% (v/v) en PBS y déjelo durante 1 minuto.
4. Transfiera globos oculares a otro frasco de 0,5 L con PBS estéril.
5. Utilice fórceps para mantener el ojo quieto en una placa de Petri y hacer un corte cerca de la córnea con una hoja de bisturí no 10A.
6. PASO CRÍTICO: Sostenga el borde del corte y use tijeras para excitar la córnea dejando unos 3 mm de esclerótica que rodea la córnea. Asegúrese de que el extremo afilado de las tijeras no perfore el iris o el tejido coroideo y esté en el espacio supra-coroidal.
7. Sujete el botón corneoscleral con fórceps y use otro par de fórceps extremos puntiagudos para separar suavemente el tejido uveal.
8. Levante el botón corneoscleral del globo restante y enjuáguelo brevemente en solución de yodo povidone del 1,5% (v/v) en PBS en una placa de 12 pozos.
9. Coloque el botón corneoscleral en otras 12 placas de pozo llenas de PBS estériles.
10. Después de procesar todos los ojos(máximo recomendado 40 ojos en un lote),coloque cada botón corneoscleral en una placa petri individual (34 mm de diámetro) lado epitelial hacia arriba y vierta en 3 ml de cultivo medio pre-calentado a 37 °C.
    NOTA: La composición del medio de cultivo es la siguiente: El medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco: Jamón [1:1] complementado con 5 μg∙mL^-1 insulina y 10 ng∙mL^-1 factor de crecimiento epidérmico (EGF), 1 0% (v/v) suero de becerro fetal (FCS), 100 U∙mL^-1 penicilina, 100 U∙mL^-1 estreptomicina y 2,5 μg∙mL^-1 anfotericina B. Como paso opcional, el medio se puede complementar con 50 g∙L^-1 dextrano para evitar la hinchazón de la córnea excada durante los pasos de incubación adicionales.
11. Incubar a 37 °C en una incubadora de cultivo de tejidos humidificados.

4. Mantenimiento de los botones corneosclerales

1. Después de 24 horas, utilice la técnica aséptica para eliminar los medios y reemplazar con 3 ml de medios frescos de cultivo pre-calentado que contengan antibióticos. Mantenga los botones corneosclerales en los medios con antibióticos durante 48 h para desinfectar las córneas. Incubar a 37 °C en una incubadora de cultivo de tejidos humidificados.
2. PASO CRÍTICO: Después de 48 horas, retire los medios y enjuague las córneas con 2 ml de PBS. A continuación, mantenga los botones corneosclerales en medios libres de antibióticos durante un mínimo de dos o idealmente tres días antes de la infección experimental, para eliminar los antibióticos residuales del tejido.
3. Incubar a 37 °C en una incubadora de cultivo de tejidos humidificados. Cambie los medios al menos una vez más en estos tres días. Deseche las córneas si se desarrolla alguna turbidez en el medio libre de antibióticos.

5. Preparación de un inoculum

1. Vierta 10 ml de caldo LB en un matraz cónico de 50 ml con un tapón de espuma.
2. Transfiera una colonia de la cepa PAO1 de P. aeruginosa o cola PA14 desde una placa de agar fresca e incuba a 37 °C durante 3-4 h hasta que las bacterias estén en fase de registro medio.
3. Transfiera el cultivo de bacterias a un tubo y centrífuga de 50 ml a 3.000 x g durante 5 minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de celda en PBS.
4. Repita el paso 5.3 dos veces más para lavar las células. Vuelva a suspender el pellet de celda en PBS y ajuste la densidad óptica a 600 nm a aproximadamente 0,6 usando PBS estéril como espacio en blanco.

6. Infectar el botón corneoscleral

1. Retire los medios de la placa De Petri y enjuague las córneas dos veces con 1 ml de PBS estéril.
2. Apriete suavemente los fórceps mientras sostiene la córnea en el medio. Utilice un bisturí de 10A para hacer cuatro cortes - dos verticales, dos horizontales - en la sección central del botón corneoscleral a través de la capa epitelial hasta el estroma subyacente.
3. Coloque un molde de vidrio estéril en una placa de 6 pozos con la parte ancha hacia arriba y coloque la córnea en el medio del molde de vidrio, lado del epitelio hacia abajo. Haga el corte justo en el centro de la parte inferior del molde de vidrio.
4. PASO CRÍTICO: Vierta 1 ml de agar de punto de fusión bajo del 1% (w/v) disuelto en DMEM para llenar el molde de vidrio con córnea por completo.
5. Deje que el agar se ajuste y luego invierta el molde de vidrio para que el epitelio corneal esté mirando hacia arriba.
6. Pipeta 15 μL del cultivo bacteriano con OD_600nm = 0,6 (para P. aeruginosa esto equivale a aproximadamente 1 x 10⁷ unidades formadoras de colonias (CFU) en 15 μL) directamente en un área cortada y luego añadir 85 μL de PBS a la parte superior para mantener el polilla de epitelio corneal. Diluir el cultivo bacteriano restante y la placa en el agar para contar las unidades de formación de colonias para el inoculum.
7. Agregue 1 ml de DMEM sin antibióticos en la parte inferior de cada pozo con el molde de vidrio. Incubar la placa de 6 pozos con los botones corneosclerales infectados en una incubadora humidificada a 37 °C con un 5% de CO₂ para hasta 24 h.
8. Configure córnea de control no infectada junto con cada experimento. Para configurar el control no infectado, reemplace los 15 μL de cultivo bacteriano en el paso 6.6 por PBS estéril.

7. Homogeneización de la córnea para cosechar las bacterias

1. Deseche el medio DMEM de la parte inferior de la placa de 6 pozos y agregue 1 ml de PBS estéril para enjuagar la parte inferior del pozo.
2. Retire PBS suavemente pipeteando sin tocar la parte central del botón corneoscleral. Retire el anillo de vidrio usando fórceps estériles y colóquelo en el 5% Distel.
3. Enjuague suavemente la parte superior del botón corneoscleral con 1 ml de PBS dos veces [opcional].
4. Sujete el borde del botón corneoscleral con fórceps finos de la punta y desconéctelo del agar de abajo.
5. Transfiera la córnea a un tubo de 50 ml lleno de hielo frío de 1-2 ml de PBS.
6. Utilice un homogeneizador de punta fina para pura la parte superior de la córnea infectada. El tejido no tiene que ser completamente liquidado. El homogeneizador ayuda a separar las bacterias del epitelio corneal y el área cortada.
7. Vórtice la córnea en PBS durante unos segundos para mezclar el contenido.
8. Añadir 20 μL del homogeneato a 180 μL de PBS y realizar diluciones en serie en una placa de 96 pozos.
9. Diluir en serie la suspensión a 10^-4 y 10^-5 dilución y pipeta 10 μL del homogeneato diluido con bacterias en una placa de agar sanguíneo. Incubar la placa durante 8 horas y contar el número de CFU. Al probar el efecto de los antimicrobianos, el factor de dilución adecuado debe llegarse experimentalmente.

Resultados

El diseño de los moldes de vidrio es una idea innovadora y original, cuyo uso nos permitió configurar el modelo de una manera consistente con problemas mínimos/nulos con la contaminación. Los moldes fueron preparados por un soplador de vidrio en la Universidad de Sheffield basado en un diseño(Figura 1A). La configuración experimental mantiene la forma convexa de la córnea y mantiene bacterias en la parte superior del epitelio donde se produce la infección (Figura...

Discusión

El principal impulsor del desarrollo de este modelo de queratitis utilizando córnea porcina ex vivo es proporcionar a los investigadores el desarrollo de nuevos antimicrobianos con un modelo in vitro representativo para determinar con mayor precisión la eficacia antimicrobiana en las etapas preclínicas. Esto proporcionará a los investigadores involucrados en el desarrollo de nuevos antimicrobianos un mayor control sobre el diseño y la formulación de fármacos en las etapas preclínicos, aumentar el éxito en los en...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL Falcon tube	SLS	352070
Amphotericin B	Sigma	A2942
Cellstar 12 well plate	Greiner Bio-One	665180
Dextran	Sigma	31425-100mg-F
Distel	Fisher Scientific	12899357
DMEM + glutamax	SLS	D0819
Dual Oven Incubator	SLS	OVe1020	Sterilising oven
Epidermal growth factor	SLS	E5036-200UG
F12 HAM	Sigma	N4888
Foetal calf serum	Labtech International	CA-115/500
Forceps	Fisher Scientific	15307805
Handheld homogeniser 220	Fisher Scientific	15575809	Homogeniser
Heracell VIOS 160i	Thermo Scientific	15373212	Tissue culture incubator
Heraeus Megafuge 16R	VWR	521-2242	Centrifuge
Insulin, recombinant Human	SLS	91077C-1G
LB agar	Sigma	L2897
Multitron	Infors	Not appplicable	Bacterial incubator
PBS	SLS	P4417
Penicillin-Streptomycin	SLS	P0781
Petri dish	Fisher Scientific	12664785
Petri dish 35x10mm CytoOne	Starlab	CC7672-3340
Povidone iodine	Weldricks pharmacy	2122828
Safe 2020	Fisher Scientific	1284804	Class II microbiology safety cabinet
Scalpel blade number 15	Fisher Scientific	O305
Scalpel Swann Morton	Fisher Scientific	11849002