التأقلم قبل اختبار تحمل الأنسولين داخل الصفاق للتخفيف من ارتفاع السكر في الدم الناجم عن الإجهاد في الفئران الواعية

Summary

يمكن أن تؤدي الارتفاعات الناجمة عن الإجهاد في مستويات الجلوكوز إلى إرباك تفسير البيانات المستمدة من اختبار تحمل الأنسولين داخل الصفاق الواعي في الفئران. في هذه المقالة ، نصف طريقة لتأقلم الفئران مع المناولة والحقن وأخذ عينات الدم قبل إجراء اختبار تحمل الأنسولين من أجل الحد من ارتفاع السكر في الدم الناجم عن الإجهاد.

Abstract

يستخدم اختبار تحمل الأنسولين بشكل شائع في دراسات التمثيل الغذائي لتقييم حساسية الأنسولين في الجسم بالكامل في القوارض. إنه اختبار بسيط نسبيا يتضمن قياس مستويات الجلوكوز في الدم بمرور الوقت بعد حقن الأنسولين داخل الصفاق واحد. بالنظر إلى أنه يتم إجراؤه في حالة الوعي وغالبا ما يتم جمع الدم عن طريق قصاصة الذيل ، فإن لديه القدرة على إثارة استجابة الإجهاد من بسبب القلق المرتبط بالمناولة وجمع الدم. على هذا النحو ، يمكن أن يحدث ارتفاع ناتج عن الإجهاد في نسبة الجلوكوز في الدم ، مما يجعل من الصعب اكتشاف وتفسير مقياس نقطة النهاية الأولية ، أي انخفاض نسبة الجلوكوز في الدم بوساطة الأنسولين. وقد لوحظ هذا في العديد من سلالات الفئران ، وهو شائع جدا في الفئران المصابة بالسكري db / db ، حيث يمكن أن تزيد مستويات الجلوكوز ، بدلا من أن تنخفض ، بعد إعطاء الأنسولين. هنا ، نصف طريقة تأقلم الفئران مع المناولة والحقن وأخذ عينات الدم قبل إجراء اختبار تحمل الأنسولين. وجدنا أن هذا يقلل من ارتفاع السكر في الدم الناجم عن الإجهاد وينتج عنه بيانات تعكس حساسية الأنسولين في الجسم بالكامل بشكل أكثر دقة.

Introduction

يتم إجراء اختبارات التمثيل الغذائي في القوارض بشكل روتيني لتقييم المعلمات المختلفة التي تنظم توازن الجلوكوز¹. المعيار الذهبي لتقييم عمل الأنسولين لكامل الجسم في الجسم الحي هو المشبك المفرط في الدم والسكر في الدم². يتضمن هذا الاختبار إعطاء الأنسولين لرفع مستويات الأنسولين المنتشرة بينما يتم حقن الجلوكوز للحفاظ على السكر في الدم. يدل معدل ضخ الجلوكوز المطلوب للحفاظ على نسبة السكر في الدم على عمل الأنسولين. في حين أنها أداة قوية في أبحاث التمثيل الغذائي ، إلا أن تقنية المشبك في الفئران تمثل تحديا تقنيا وتتطلب عمالة مكثفة ، وبالتالي فهي ليست مناسبة تماما كأداة فحص أولية في توصيف النمط الظاهري الأيضي. لهذه الأسباب ، غالبا ما يتم اختيار اختبار تحمل الأنسولين داخل الصفاق (ITT) الأبسط.

يتم إجراء ITT في حالة الوعي بعد فترة الصيام (عادة 4-6 ساعات). يتم إعطاء بلعة الأنسولين داخل الصفاق ، وبعد ذلك يتم مراقبة نسبة الجلوكوز في الدم على مدى إطار زمني يستمر عادة 60 دقيقة. من المتوقع أن تنخفض مستويات الجلوكوز في الدم بسبب قدرة الأنسولين على تسهيل امتصاص الجلوكوز في الأنسجة الحساسة للأنسولين. تدل درجة حدوث ذلك على عمل الأنسولين في الجسم بالكامل. في بعض الحالات ، ثبت أن مستويات الجلوكوز تزداد ، بدلا من أن تنخفض ، بعد إعطاء الأنسولين. من المحتمل أن تعزى هذه الظاهرة إلى استجابة الإجهاد. يمكن أن تؤدي المناولة والحقن وأخذ عينات الدم إلى الإجهاد^3،4،5 ، مما يؤدي إلى تنشيط محور ما تحت المهاد والغدة النخامية والغدة الكظرية (HPA) والجهاز العصبي اللاإرادي (ANS) ^6،7،8. من المعروف أن كلا من HPA و ANS يسهمان في زيادة مستويات الجلوكوز^{المنتشرة 9،10،11}. يعد وجود ارتفاع السكر في الدم الناجم عن الإجهاد في بداية ITT مشكلة ، لأنه يتداخل مع معدل وحجم انخفاض الجلوكوز عند إعطاء الأنسولين¹². هذا يمكن أن يؤدي إلى استنتاجات خاطئة فيما يتعلق بوجود مقاومة الأنسولين. وبالتالي ، للتخفيف من التأثير المربك للإجهاد على مستويات الجلوكوز أثناء اختبار TTT ، قمنا بتطوير طريقة لتأقلم الفئران مع المناولة والحقن وأخذ عينات الدم قبل إجراء اختبار ITT.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل لجنة رعاية المؤسسية واستخدامها في نظام VA Puget Sound للرعاية الصحية.

ملاحظة: قد تختلف المتطلبات المحلية لمراقبة و / أو تدخل التي تعاني من نقص السكر في الدم عن تلك الموضحة هنا.

1. الصيام (ر = -210 دقيقة)

1. بعد انتهاء الدورة المظلمة ، انقل الفئران إلى قفص جديد به فراش غير مغذي مثل السليلوز أو الفراش الورقي (وليس فراش الذرة ، مما سيؤثر على نقاط النهاية الأيضية إذا تناولتها الفئران¹³). تزويد الفئران بإمكانية الوصول إلى الماء طوال فترة الصيام. كن متسقا مع وقت الصيام من اليوم ومدته عبر مجموعات الفئران. بالنسبة للبيانات الموضحة ، تمت إزالة الطعام بين الساعة 0700 و 0800 ، أي بعد 1-2 ساعة من انتهاء الدورة المظلمة.
2. نقل الأقفاص (القفص) إلى الموقع الذي سيتم فيه إجراء ITT. يجب أن تكون هذه مساحة هادئة حيث يتم تقليل الضغوطات مثل درجة الحرارة أو الضوضاء أو الضوء أو الحركة.

2. التأقلم (ر = -150 إلى -60 دقيقة)

هام: تعامل مع الفئران بلطف قدر الإمكان. تجنب استخدام جهاز تقييد إن أمكن.

1. في -150 دقيقة ، قم بقياس وزن الجسم. سيتم استخدام هذا لحساب حجم الأنسولين الذي سيتم إعطاؤه ل ITT.
2. التقط الماوس برفق من الذيل واستقر على سطح سطح طاولة مستو مع الاستمرار في الإمساك بالذيل برفق. استخدم إبرة 20 جم (أو مقص جراحي) لعمل شق صغير في طرف الذيل. يجب أن تبدأ قطرة دم في التكون في الموقع.
3. ضع الماوس على سطح صلب أملس وقم بتقييد الماوس برفق من الذيل.
   1. لتسجيل نسبة الجلوكوز في الدم في هذا الوقت، ضع قطرة دم من طرف الذيل على شريط اختبار جهاز قياس السكر المحمول باليد. إذا لزم الأمر ، قم بتدليك الذيل برفق للحصول على قطرة دم.
4. اسحب 100 ميكرولتر من محلول ملحي معقم في حقنة الأنسولين. التقط الماوس باستخدام تقشير لطيف وحقنها داخل الصفاق. سجل وقت حقن المحلول الملحي.
   1. إذا كانت هناك عدة فئران قيد الدراسة ، فقم بحقن الفئران بالمحلول الملحي على فترات 1 دقيقة لإتاحة الوقت للخطوات اللاحقة أدناه.
5. بعد 15 دقيقة من حقن المحلول الملحي ، التقط الفأر برفق من الذيل. استخدم الشاش لإخراج أي جلطة دموية على طرف الذيل برفق.
   1. اختياري: سجل نسبة الجلوكوز في الدم مرة أخرى في هذا الوقت كما هو موضح في الخطوة 2.3.
6. بعد 30 دقيقة من حقن المحلول الملحي ، التقط الفأر برفق من الذيل. إذا رغبت في ذلك، احصل على قياس آخر لنسبة الجلوكوز في الدم كما هو موضح في الخطوة 2.3.
7. أعد الماوس إلى القفص ، وكرر ذلك للفئران الأخرى حسب الضرورة. اترك الفئران دون إزعاج حتى -90 دقيقة.
8. في -90 دقيقة ، كرر الخطوات من 2.3 إلى 2.6 ، بما في ذلك قياس مستويات الجلوكوز في الدم إذا رغبت في ذلك.
9. أعد الماوس إلى القفص ، كرر ذلك للفئران الأخرى حسب الضرورة. اترك الفئران دون إزعاج حتى ITT (حيث يتم قياس مستوى الجلوكوز في الدم الأساسي في -5 دقائق).

3. اختبار تحمل الأنسولين (ر = -5 إلى +60 دقيقة)

1. تحضير محلول عامل من الأنسولين العادي (CAUTION) في محلول ملحي معقم ، بحيث يمكن حقن الجرعة المطلوبة عند 4 ميكرولتر / غرام من وزن الجسم.
   ملاحظة: يجب توخي الحذر عند التعامل مع الأنسولين لأن الحقن العرضي يمكن أن يؤدي إلى نقص السكر في الدم.
2. قم بإعداد محلول سكر العنب بنسبة 25٪ (v / v) في محلول ملحي معقم ليكون في متناول اليد في حالة إصابة الفئران بنقص السكر في الدم الذي يتطلب التدخل.
3. في -5 دقائق ، التقط الماوس برفق من الذيل. حدد مستوى الجلوكوز في الدم الأساسي في هذا الوقت ، عن طريق وضع قطرة دم من طرف الذيل على شريط اختبار جهاز قياس السكر المحمول باليد. إذا لزم الأمر ، قم بتدليك الذيل برفق للحصول على قطرة دم.
4. ارسم محلول عمل الأنسولين في حقنة الأنسولين (4 ميكرولتر / غرام من وزن الجسم ، لنطاق جرعة نموذجي يتراوح بين 0.5-2.0 وحدة / كجم). التقط الماوس باستخدام تقشير لطيف وحقنها داخل الصفاق. وقت قياسي لحقن الأنسولين.
   1. إذا كانت هناك عدة فئران قيد الدراسة ، فقم بحقن الأنسولين للفئران كل 1 دقيقة لإتاحة الوقت لأخذ عينات الدم اللاحقة وتسجيل البيانات أدناه.
5. بعد 15 دقيقة من حقن الأنسولين ، التقط الفأر برفق من الذيل. استخدم الشاش لإخراج أي جلطة دموية على طرف الذيل برفق. حدد نسبة الجلوكوز في الدم مرة أخرى في هذا الوقت كما هو موضح في الخطوة 3.3.
6. أعد الفأر إلى القفص وراقب علامات نقص السكر في الدم (على سبيل المثال، الخمول المفرط). إذا ظهرت على الفئران أعراض نقص السكر في الدم، فقم بقياس نسبة الجلوكوز في الدم كما هو موضح في الخطوة 5 وقم بإعطاء سكر العنب إذا لزم الأمر. ستتم إزالة الفأر الذي يخضع لتدخل سكر العنب من بروتوكول آي تي تي في هذا الوقت.
7. كرر الخطوتين 3.5 و 3.6 بعد 30 دقيقة من حقن الأنسولين.
8. كرر الخطوتين 3.5 و 3.6 بعد 45 دقيقة من حقن الأنسولين.
9. كرر الخطوتين 3.5 و 3.6 بعد 60 دقيقة من حقن الأنسولين.
10. أعد الفئران إلى قفص منزلها ، الذي يحتوي على عدد قليل من كريات الطعام على أرضية القفص للمساعدة في التعافي من ITT. استمر في المراقبة لمدة 30 دقيقة وإذا لم تستعيد الفئران نشاطها / سلوكها الطبيعي ، فاتبع الإجراء الموضح في الخطوة 3.6.
    ملاحظة: يلخص الشكل 1 إجراء التأقلم وتكنولوجيا المعلومات أعلاه.

النتائج

الشكل 2 أ والشكل 3 أ عبارة عن بيانات تمثيلية (بيانات فردية ومتوسطة ، على التوالي) تظهر ارتفاعا متناقضا في مستويات الجلوكوز في الدم في الفئران المصابة بداء السكري ديسيبل / ديسيبل في 15 دقيقة بعد إعطاء الأنسولين ، بما يتفق مع ارتفاع السكر في ال...

Discussion

يعتبر المشبك المفرط في السلمون والسكر في الدم هو المعيار الذهبي لتقييم عمل الأنسولين في الجسم الحي. أدت التعديلات التي تم إجراؤها على منهجية أداء المشبك إلى إجراء هذه التقنية في الفئران الواعية وغير المقيدة² التي تم قسطرتها مسبقا باستخدام نظام قسطرتين

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextrose-50	Pfizer Injectables	00409-6648-16	For use if mouse experiences hypoglycemia.
Gauze pads	Fisher Scientific	22037907	To dislodge blood clot on the tail tip.
Glucometer	Accu-Chek	M001_us	To measure blood glucose.
Gram scale			To measure body weight.
Insulin (Novolin R)	Novo Nordisk	0169-1833-11	For injection.
Insulin syringes	VWR	BD-329461	For injections.
Minute timer
Sterile 20 G needle	VWR	BD-305175	For tail snip.
Sterile saline	Lifeshield	1261699	For injections.
Surgical scissors	Fine Science Tools	14088-10	For tail snip.
Test strips	Accu-Chek	06908217001_us	To measure blood glucose.