Акклиматизация перед внутрибрюшинным тестом на толерантность к инсулину для смягчения гипергликемии, вызванной стрессом, у мышей в сознании

Резюме

Стресс-индуцированное повышение уровня глюкозы может затруднить интерпретацию данных, полученных в результате сознательного теста на толерантность к инсулину у мышей. В этой статье мы описываем метод адаптации мышей к обработке, инъекциям и забору крови перед проведением теста на толерантность к инсулину с целью ограничения гипергликемии, вызванной стрессом.

Аннотация

Тест на толерантность к инсулину обычно используется в метаболических исследованиях для оценки чувствительности всего организма к инсулину у грызунов. Это относительно простой тест, который включает в себя измерение уровня глюкозы в крови с течением времени после однократной внутрибрюшинной инъекции инсулина. Учитывая, что она проводится в сознательном состоянии и кровь часто собирается с помощью ножницы хвоста, она может вызвать стрессовую реакцию у животных из-за беспокойства, связанного с обращением и сбором крови. Таким образом, может произойти стресс-индуцированное повышение уровня глюкозы в крови, что затрудняет обнаружение и интерпретацию первичного конечного показателя, а именно инсулин-опосредованного снижения уровня глюкозы в крови. Это наблюдалось у многих линий мышей и довольно часто встречается у мышей с диабетом, у которых уровень глюкозы может увеличиваться, а не уменьшаться после введения инсулина. В этой статье мы опишем метод адаптации мышей к обработке, инъекциям и забору крови перед проведением теста на толерантность к инсулину. Мы обнаружили, что это снижает гипергликемию, вызванную стрессом, и приводит к данным, которые более точно отражают чувствительность всего организма к инсулину.

Введение

Метаболические тесты у грызунов регулярно проводятся для оценки различных параметров, регулирующих гомеостаз глюкозы¹. Золотым стандартом для оценки действия инсулина во всем организме in vivo является гиперинсулинемо-эугликемический зажим². Этот тест включает в себя введение инсулина для повышения уровня циркулирующего инсулина, в то время как глюкоза вводится для поддержания эугликемии. Скорость инфузии глюкозы, необходимая для поддержания эугликемии, свидетельствует о действии инсулина. Несмотря на то, что метод зажима на мышах является мощным инструментом в метаболических исследованиях, он технически сложен и трудоемок, и поэтому не очень хорошо подходит в качестве начального инструмента скрининга для характеристики метаболического фенотипа. По этим причинам часто выбирают более простой внутрибрюшинный тест на толерантность к инсулину (ITT).

ITT проводится в сознательном состоянии после периода голодания (обычно 4-6 часов). Болюс инсулина вводится внутрибрюшинно, после чего уровень глюкозы в крови контролируется в течение периода времени, который обычно длится 60 минут. Ожидается, что уровень глюкозы в крови снизится из-за способности инсулина способствовать усвоению глюкозы в чувствительных к инсулину тканях; Степень, в которой это происходит, свидетельствует о действии инсулина на весь организм. В некоторых случаях было показано, что уровень глюкозы парадоксальным образом повышается, а не уменьшается после введения инсулина. Это явление, вероятно, связано с реакцией на стресс. Лечение, инъекции и забор крови могут вызвать стресс ^3,4,5, что приводит к активации гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси (HPA) и вегетативной нервной системы (ВНС)^6,7,8. Хорошо известно, что как HPA, так и ANS способствуют повышению уровня циркулирующей глюкозы ^9,10,11. Наличие стресс-индуцированной гипергликемии в начале ИТТ является проблемой, так как она влияет на скорость и величину падения уровня глюкозы^{при введении} инсулина. Это может привести к ошибочным выводам относительно наличия инсулинорезистентности. Таким образом, чтобы смягчить смешанное влияние стресса на уровень глюкозы во время ITT, мы разработали метод адаптации мышей к обработке, инъекциям и забору крови перед выполнением ITT.

протокол

Все описанные здесь методы были одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию системы здравоохранения VA Puget Sound.

ПРИМЕЧАНИЕ: Местные требования к мониторингу и/или вмешательству в отношении животных, испытывающих гипогликемию, могут отличаться от описанных здесь.

1. Натощак (t= -210 мин)

1. После того, как темный цикл закончится, пересадите мышей в новую клетку с непитательной подстилкой, такой как целлюлозная или бумажная подстилка (не подстилка из кукурузных початков, которая повлияет на метаболические конечные точки при употреблении мышами¹³). Обеспечьте мышам свободный доступ к воде в течение всего периода голодания. Соблюдайте время дня и продолжительность голодания в группах мышей. Согласно приведенным данным, пища была удалена между 07:00 и 08:00 часами, то есть через 1-2 часа после окончания темнового цикла.
2. Переместите клетку (клетки) к месту, где будет выполняться ITT. Это должно быть тихое место, где факторы стресса, такие как температура, шум, свет или движение, сведены к минимуму.

2. Акклиматизация (t= от -150 до -60 мин)

ВАЖНО: Обращайтесь с мышами как можно аккуратнее. По возможности избегайте использования удерживающего устройства.

1. Через -150 мин измерьте массу тела. Это будет использоваться для расчета объема инсулина, который будет вводиться для ITT.
2. Осторожно возьмите мышь за хвост и лягте на плоскую поверхность стола, все еще нежно сжимая хвост. С помощью иглы 20 G (или хирургических ножниц) сделайте небольшой разрез на кончике хвоста. На месте должна начать образовываться капля крови.
3. Установите мышь на гладкую твердую поверхность и аккуратно задержите мышь за хвост.
   1. Чтобы записать уровень глюкозы в крови в это время, поместите каплю крови с кончика хвоста на тест-полоску ручного глюкометра. При необходимости очень мягко помассируйте хвост до получения капли крови.
4. Наберите 100 μл стерильного физиологического раствора в инсулиновый шприц. Возьмите мышь в руки с помощью мягкого загривка и введите внутрибрюшинно. Запишите время введения физиологического раствора.
   1. Если изучается несколько мышей, вводите мышам физиологический раствор с интервалом в 1 минуту, чтобы дать время для последующих шагов, описанных ниже.
5. Через 15 минут после введения физиологического раствора осторожно возьмите мышь за хвост. Используйте марлю, чтобы аккуратно выбить сгусток крови на кончике хвоста.
   1. Дополнительно: В это время снова зарегистрируйте уровень глюкозы в крови, как описано в шаге 2.3.
6. Через 30 минут после инъекции физраствора осторожно возьмите мышь за хвост. При желании проведите еще одно измерение уровня глюкозы в крови, как описано в шаге 2.3.
7. Верните мышь в клетку и повторите для других мышей по мере необходимости. Оставьте мышей в покое до -90 минут.
8. Через -90 мин повторите шаги с 2.3 по 2.6, включая измерение уровня глюкозы в крови, если это необходимо.
9. Верните мышь в клетку, повторите для других мышей по мере необходимости. Оставьте мышей в покое до начала ITT (для которого исходное измерение уровня глюкозы в крови проводится через -5 минут).

3. Тест на толерантность к инсулину (t= от -5 до +60 мин)

1. Приготовьте рабочий раствор обычного инсулина (ОСТОРОЖНО) в стерильном физрастворе, таким образом, чтобы можно было вводить нужную дозу при массе тела 4 мкл/г.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следует соблюдать осторожность при работе с инсулином, так как случайная инъекция может привести к гипогликемии.
2. Приготовьте 25% раствор декстрозы в стерильном физиологическом растворе, чтобы иметь его под рукой на случай, если у мышей разовьется гипогликемия, требующая вмешательства.
3. На -5 мин аккуратно возьмите мышь в руки за хвост. Определите исходный уровень глюкозы в крови в это время, поместив каплю крови с кончика хвоста на тест-полоску ручного глюкометра. При необходимости очень мягко помассируйте хвост до получения капли крови.
4. Наберите рабочий раствор инсулина в инсулиновый шприц (4 мкл/г массы тела, при типичном диапазоне доз 0,5-2,0 ЕД/кг). Возьмите мышь в руки с помощью мягкого загривка и введите внутрибрюшинно. Рекордное время введения инсулина.
   1. Если изучается несколько мышей, вводите им инсулин с интервалом в 1 минуту, чтобы дать время для последующего забора крови и записи данных ниже.
5. Через 15 минут после инъекции инсулина осторожно возьмите мышь на руки. Используйте марлю, чтобы аккуратно выбить сгусток крови на кончике хвоста. В это время снова определите уровень глюкозы в крови, как описано в шаге 3.3.
6. Верните мышь в клетку и следите за признаками гипогликемии (например, чрезмерной вялостью). Если у мышей развиваются симптомы гипогликемии, измерьте уровень глюкозы в крови, как описано в шаге 5, и при необходимости введите декстрозу. Мышь, подвергшаяся вмешательству декстрозой, в это время будет удалена из протокола ITT.
7. Повторите шаги 3.5 и 3.6 через 30 минут после инъекции инсулина.
8. Повторите шаги 3.5 и 3.6 через 45 минут после введения инсулина.
9. Повторите шаги 3.5 и 3.6 через 60 минут после введения инсулина.
10. Верните мышей в их домашнюю клетку, содержащую несколько гранул пищи на полу клетки, чтобы помочь в восстановлении после ITT. Продолжайте наблюдение в течение 30 минут, и если мышь не восстановила нормальную активность/поведение, следуйте процедуре, описанной в шаге 3.6.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 кратко изложена вышеуказанная процедура акклиматизации и ITT.

Результаты

Рисунок 2А и рисунок 3А являются репрезентативными данными (индивидуальные и средние данные соответственно), показывающие парадоксальное повышение уровня глюкозы в крови у мышей с диабетом db/db в течение 15 минут после введения инсулина,...

Обсуждение

Гиперинсулинемо-эугликемический зажим считается золотым стандартом для оценки действия инсулина in vivo. Изменения в методике выполнения зажима привели к тому, что эту технику применяли на находящихся в сознании мышах², которым ранее была катетеризирована...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextrose-50	Pfizer Injectables	00409-6648-16	For use if mouse experiences hypoglycemia.
Gauze pads	Fisher Scientific	22037907	To dislodge blood clot on the tail tip.
Glucometer	Accu-Chek	M001_us	To measure blood glucose.
Gram scale			To measure body weight.
Insulin (Novolin R)	Novo Nordisk	0169-1833-11	For injection.
Insulin syringes	VWR	BD-329461	For injections.
Minute timer
Sterile 20 G needle	VWR	BD-305175	For tail snip.
Sterile saline	Lifeshield	1261699	For injections.
Surgical scissors	Fine Science Tools	14088-10	For tail snip.
Test strips	Accu-Chek	06908217001_us	To measure blood glucose.