Akklimatisierung vor einem intraperitonealen Insulintoleranztest zur Milderung der stressinduzierten Hyperglykämie bei bewussten Mäusen

Zusammenfassung

Stressinduzierte Erhöhungen des Glukosespiegels können die Interpretation von Daten verwirren, die aus einem bewussten intraperitonealen Insulintoleranztest bei Mäusen abgeleitet wurden. In diesem Artikel beschreiben wir eine Methode, um die Mäuse vor der Durchführung des Insulintoleranztests an den Umgang, die Injektionen und die Blutentnahme zu gewöhnen, um die stressinduzierte Hyperglykämie zu begrenzen.

Zusammenfassung

Der Insulintoleranztest wird häufig in Stoffwechselstudien verwendet, um die Insulinsensitivität des gesamten Körpers bei Nagetieren zu beurteilen. Es handelt sich um einen relativ einfachen Test, bei dem der Blutzuckerspiegel im Laufe der Zeit nach einer einzigen intraperitonealen Injektion von Insulin gemessen wird. Da sie im bewussten Zustand durchgeführt wird und das Blut oft über eine Schwanzschere entnommen wird, hat sie das Potenzial, bei den Tieren eine Stressreaktion hervorzurufen, die auf die Angst vor der Handhabung und Blutentnahme zurückzuführen ist. Daher kann es zu einem stressinduzierten Anstieg des Blutzuckers kommen, was es schwierig macht, den primären Endpunkt, nämlich eine insulinvermittelte Senkung des Blutzuckers, zu erkennen und zu interpretieren. Dies wurde bei vielen Mausstämmen beobachtet und ist bei diabetischen db/db-Mäusen recht häufig, bei denen der Glukosespiegel nach der Insulinverabreichung eher ansteigen als sinken kann. Hier beschreiben wir eine Methode, um Mäuse an den Umgang, die Injektionen und die Blutentnahme vor der Durchführung des Insulintoleranztests zu gewöhnen. Wir stellen fest, dass dies die stressinduzierte Hyperglykämie senkt und zu Daten führt, die die Insulinsensitivität des gesamten Körpers genauer widerspiegeln.

Einleitung

Stoffwechseltests bei Nagetieren werden routinemäßig durchgeführt, um verschiedene Parameter zu beurteilen, die die Glukosehomöostase regulieren¹. Der Goldstandard für die Beurteilung der Ganzkörper-Insulinwirkung in vivo ist die hyperinsulinämisch-euglykämische Clamp². Bei diesem Test wird Insulin verabreicht, um den zirkulierenden Insulinspiegel zu erhöhen, während Glukose infundiert wird, um die Euglykämie aufrechtzuerhalten. Die Glukoseinfusionsrate, die zur Aufrechterhaltung der Euglykämie erforderlich ist, ist ein Hinweis auf die Wirkung von Insulin. Während es sich um ein leistungsfähiges Werkzeug in der Stoffwechselforschung handelt, ist die Clamp-Technik bei Mäusen technisch anspruchsvoll und arbeitsintensiv und eignet sich daher nicht gut als erstes Screening-Werkzeug zur Charakterisierung eines metabolischen Phänotyps. Aus diesen Gründen wird oft der einfachere intraperitoneale Insulintoleranztest (ITT) gewählt.

Die ITT wird im bewussten Zustand nach einer Fastenperiode (typischerweise 4-6 Stunden) durchgeführt. Ein Insulinbolus wird intraperitoneal verabreicht, wonach der Blutzucker über einen Zeitraum von normalerweise 60 Minuten überwacht wird. Es wird erwartet, dass der Blutzuckerspiegel aufgrund der Fähigkeit von Insulin, die Glukoseaufnahme in insulinempfindliches Gewebe zu erleichtern, sinkt. Das Ausmaß, in dem dies geschieht, ist ein Hinweis auf die Wirkung von Ganzkörperinsulin. In einigen Fällen wurde gezeigt, dass der Glukosespiegel nach der Insulinverabreichung paradoxerweise eher ansteigt als abnimmt. Dieses Phänomen wird wahrscheinlich auf eine Stressreaktion zurückgeführt. Handhabung, Injektionen und Blutentnahmen können Stress auslösen ^3,4,5, was zu einer Aktivierung der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse (HPA) und des autonomen Nervensystems (ANS) ^führt6,7,8. Es ist allgemein bekannt, dass sowohl das HPA als auch das ANS zu einem Anstieg des zirkulierenden Glukosespiegels beitragen ^9,10,11. Das Vorhandensein einer stressinduzierten Hyperglykämie zu Beginn einer ITT ist problematisch, da sie die Geschwindigkeit und das Ausmaß des Abfalls der Glukose bei Insulingabe beeinträchtigt¹². Dies kann zu falschen Schlussfolgerungen bezüglich des Vorliegens einer Insulinresistenz führen. Um die verwirrenden Auswirkungen von Stress auf den Glukosespiegel während einer ITT zu mildern, haben wir eine Methode entwickelt, um Mäuse vor der Durchführung der ITT an die Handhabung, Injektionen und Blutentnahme zu gewöhnen.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des VA Puget Sound Health Care System genehmigt.

HINWEIS: Örtliche Anforderungen an die Überwachung und/oder Intervention bei Tieren, bei denen Hypoglykämie auftritt, können von den hier beschriebenen Anforderungen abweichen.

1. Fasten (t= -210 min)

1. Nachdem der Dunkelzyklus beendet ist, setzen Sie die Mäuse in einen neuen Käfig mit unnahrhafter Einstreu wie Zellulose oder Papiereinstreu (keine Maiskolbeneinstreu, die die metabolischen Endpunkte beeinflusst, wenn sie von Mäusen verzehrt wird¹³). Verschaffen Sie Mäusen während der Fastenzeit ad libitum Zugang zu Wasser. Seien Sie konsistent mit der Tageszeit und der Dauer des Fastens in allen Gruppen von Mäusen. Für die gezeigten Daten wurde die Nahrung zwischen 0700 und 0800 Uhr entfernt, was 1-2 Stunden nach Beendigung des Dunkelzyklus war.
2. Bewegen Sie die Käfige an den Ort, an dem die ITT durchgeführt wird. Dies sollte ein ruhiger Raum sein, in dem Stressfaktoren wie Temperatur, Lärm, Licht oder Bewegung minimiert werden.

2. Akklimatisierung (t= -150 bis -60 min)

WICHTIG: Gehen Sie so schonend wie möglich mit Mäusen um. Vermeiden Sie nach Möglichkeit die Verwendung einer Rückhaltevorrichtung.

1. Messen Sie bei -150 min das Körpergewicht. Dies wird für die Berechnung des Insulinvolumens verwendet, das für die ITT verabreicht wird.
2. Nehmen Sie die Maus vorsichtig am Schwanz und legen Sie sie auf eine flache Tischplatte, während Sie den Schwanz immer noch sanft greifen. Verwenden Sie eine 20-G-Nadel (oder eine chirurgische Schere), um einen kleinen Schnitt in der Schwanzspitze zu machen. An der Stelle sollte sich ein Blutstropfen bilden.
3. Stellen Sie die Maus auf eine glatte, harte Oberfläche und halten Sie die Maus vorsichtig am Schwanz fest.
   1. Um den Blutzucker zu diesem Zeitpunkt aufzuzeichnen, geben Sie einen Tropfen Blut aus der Schwanzspitze auf den Teststreifen eines tragbaren Blutzuckermessgeräts. Bei Bedarf den Schwanz sehr sanft massieren, um einen Tropfen Blut zu erhalten.
4. 100 μl sterile Kochsalzlösung in eine Insulinspritze aufziehen. Nehmen Sie die Maus durch sanftes Scrubfing auf und injizieren Sie intraperitoneal. Notieren Sie den Zeitpunkt der Kochsalzinjektion.
   1. Wenn mehrere Mäuse untersucht werden, injizieren Sie den Mäusen Kochsalzlösung in Abständen von 1 Minute, um Zeit für die folgenden Schritte zu haben.
5. Nehmen Sie die Maus 15 Minuten nach der Kochsalzinjektion vorsichtig am Schwanz auf. Verwenden Sie Gaze, um Blutgerinnsel an der Schwanzspitze vorsichtig zu entfernen.
   1. Optional: Erfassen Sie den Blutzucker zu diesem Zeitpunkt erneut, wie in Schritt 2.3 beschrieben.
6. 30 min nach der Kochsalzinjektion nehmen Sie die Maus vorsichtig am Schwanz auf. Falls gewünscht, führen Sie eine weitere Blutzuckermessung durch, wie in Schritt 2.3 beschrieben.
7. Setzen Sie die Maus wieder in den Käfig ein und wiederholen Sie den Vorgang bei Bedarf für andere Mäuse. Lassen Sie die Mäuse bis -90 min ungestört.
8. Wiederholen Sie bei -90 min die Schritte 2.3 bis 2.6, ggf. einschließlich Messung des Blutzuckerspiegels.
9. Setzen Sie die Maus wieder in den Käfig ein und wiederholen Sie den Vorgang bei Bedarf für andere Mäuse. Lassen Sie die Mäuse bis zur ITT ungestört (für die die Blutzuckermessung zu Studienbeginn bei -5 Minuten durchgeführt wird).

3. Insulintoleranztest (t= -5 bis +60 min)

1. Bereiten Sie eine Arbeitslösung aus normalem Insulin (VORSICHT) in steriler Kochsalzlösung vor, so dass die gewünschte Dosis mit 4 μl/g Körpergewicht injiziert werden kann.
   HINWEIS: Beim Umgang mit Insulin ist Vorsicht geboten, da eine versehentliche Injektion zu Hypoglykämie führen kann.
2. Bereiten Sie eine 25%ige (v/v) Dextroselösung in steriler Kochsalzlösung vor, die Sie zur Hand haben sollten, falls Mäuse eine Hypoglykämie entwickeln, die eine Intervention erfordert.
3. Nehmen Sie die Maus bei -5 Minuten vorsichtig am Schwanz auf. Bestimmen Sie zu diesem Zeitpunkt den Ausgangsblutzuckerspiegel, indem Sie einen Tropfen Blut aus der Schwanzspitze auf den Teststreifen eines tragbaren Blutzuckermessgeräts legen. Bei Bedarf den Schwanz sehr sanft massieren, um einen Tropfen Blut zu erhalten.
4. Ziehen Sie die Insulinwirklösung in eine Insulinspritze auf (4 μl/g Körpergewicht, für einen typischen Dosisbereich von 0,5-2,0 U/kg). Nehmen Sie die Maus durch sanftes Scrubfing auf und injizieren Sie intraperitoneal. Rekordzeit der Insulininjektion.
   1. Wenn mehrere Mäuse untersucht werden, injizieren Sie den Mäusen Insulin in Abständen von 1 Minute, um Zeit für die anschließende Blutentnahme und Datenaufzeichnung unten zu haben.
5. Nehmen Sie die Maus 15 Minuten nach der Insulininjektion vorsichtig am Schwanz auf. Verwenden Sie Gaze, um Blutgerinnsel an der Schwanzspitze vorsichtig zu entfernen. Bestimmen Sie zu diesem Zeitpunkt erneut den Blutzucker, wie in Schritt 3.3 beschrieben.
6. Setzen Sie die Maus wieder in den Käfig ein und überwachen Sie sie auf Anzeichen von Hypoglykämie (z. B. übermäßige Lethargie). Wenn Mäuse Symptome einer Hypoglykämie entwickeln, messen Sie den Blutzucker wie in Schritt 5 beschrieben und verabreichen Sie gegebenenfalls Dextrose. Eine Maus, die sich einer Dextrose-Intervention unterzieht, würde zu diesem Zeitpunkt aus dem ITT-Protokoll entfernt.
7. Wiederholen Sie die Schritte 3.5 und 3.6 30 Minuten nach der Insulininjektion.
8. Wiederholen Sie die Schritte 3.5 und 3.6 45 Minuten nach der Insulininjektion.
9. Wiederholen Sie die Schritte 3.5 und 3.6 60 Minuten nach der Insulininjektion.
10. Bringen Sie die Mäuse in ihren Käfig zurück, der einige Futterpellets auf dem Boden des Käfigs enthält, um die Genesung von der ITT zu unterstützen. Fahren Sie mit der Überwachung für 30 Minuten fort und befolgen Sie das in Schritt 3.6 beschriebene Verfahren, wenn die Mäuse ihre normale Aktivität/ihr normales Verhalten nicht wiedererlangt haben.
    HINWEIS: Abbildung 1 fasst das obige Akklimatisierungs- und ITT-Verfahren zusammen.

Ergebnisse

Abbildung 2A und Abbildung 3A sind repräsentative Daten (Einzel- bzw. Mittelwerte), die einen paradoxen Anstieg des Blutzuckerspiegels bei diabetischen db/db-Mäusen in den 15 Minuten nach der Insulinverabreichung zeigen, was mit einer stressinduzierten Hyperglykämie übereinstimmt. Beachten Sie, dass bei den nicht-diabetischen Wurfgeschwistern (db/+ oder +/+), die sich dem gleichen Verfahren unterzogen, kein Anstieg des Blutz...

Diskussion

Die hyperinsulinämisch-euglykämische Klemme gilt als Goldstandard für die Beurteilung der Insulinwirkung in vivo. Modifikationen an der Methodik zur Durchführung der Klemme haben dazu geführt, dass die Technik bei bewusstseinden, nicht fixierten Mäusen² durchgeführt wird, die zuvor unter Verwendung eines Zwei-Katheter-Systems¹⁴ katheterisiert wurden, um eine Blutentnahme über die Halsschlagader und Infusionen über die Halsvene zu e...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextrose-50	Pfizer Injectables	00409-6648-16	For use if mouse experiences hypoglycemia.
Gauze pads	Fisher Scientific	22037907	To dislodge blood clot on the tail tip.
Glucometer	Accu-Chek	M001_us	To measure blood glucose.
Gram scale			To measure body weight.
Insulin (Novolin R)	Novo Nordisk	0169-1833-11	For injection.
Insulin syringes	VWR	BD-329461	For injections.
Minute timer
Sterile 20 G needle	VWR	BD-305175	For tail snip.
Sterile saline	Lifeshield	1261699	For injections.
Surgical scissors	Fine Science Tools	14088-10	For tail snip.
Test strips	Accu-Chek	06908217001_us	To measure blood glucose.