腹膜内胰岛素耐量试验前的驯化以减轻清醒小鼠应激诱导的高血糖

摘要

应激诱导的葡萄糖水平升高会混淆对小鼠有意识腹膜内胰岛素耐量试验得出的数据的解释。在本文中，我们描述了一种在进行胰岛素耐量测试之前使小鼠适应处理、注射和采血的方法，以限制压力诱导的高血糖症。

摘要

胰岛素耐量试验通常用于代谢研究，以评估啮齿动物的全身胰岛素敏感性。这是一项相对简单的测试，涉及在单次腹膜内注射胰岛素后测量血糖水平随时间的变化。鉴于它是在清醒状态下进行的，并且血液通常是通过剪尾收集的，由于与处理和血液采集相关的焦虑，它有可能引起动物的应激反应。因此，可能会发生压力诱导的血糖升高，从而难以检测和解释主要终点指标，即胰岛素介导的血糖降低。这在许多小鼠品系中都已见到，并且在糖尿病 db/db 小鼠中很常见，其中葡萄糖水平在胰岛素给药后会增加而不是降低。在这里，我们描述了一种在进行胰岛素耐量测试之前使小鼠适应处理、注射和采血的方法。我们发现这降低了压力引起的高血糖症，并导致数据更准确地反映全身胰岛素敏感性。

引言

啮齿动物的代谢测试常规进行，以评估调节葡萄糖稳态¹ 的各种参数。评估体内全身胰岛素作用的金标准是高胰岛素-正常血糖钳夹²。该测试包括给予胰岛素以提高循环胰岛素水平，同时注入葡萄糖以维持血糖正常。维持血糖正常所需的葡萄糖输注速率表明胰岛素的作用。虽然它是代谢研究中的强大工具，但小鼠的夹技术在技术上具有挑战性且劳动强度大，因此不太适合作为表征代谢表型的初始筛选工具。由于这些原因，通常选择更简单的腹膜内胰岛素耐量试验 （ITT）。

ITT 是在禁食期（通常为 4-6 小时）后的清醒状态下进行的。通过腹膜内推注胰岛素，然后在通常持续 60 分钟的时间范围内监测血糖。由于胰岛素能够促进葡萄糖摄取到胰岛素敏感组织中，预计血糖水平会下降;这种情况发生的程度表明全身胰岛素的作用。在某些情况下，已经表明胰岛素给药后葡萄糖水平反常地增加，而不是降低。这种现象可能归因于压力反应。处理、注射和采血都会诱发压力 ^3,4,5，^导致下丘脑-垂体-肾上腺轴 （HPA） 和自主神经系统 （ANS） 激活 ^6,7,8。众所周知，HPA 和 ANS 都有助于循环葡萄糖水平的增加 ^9,10,11。在 ITT 开始时存在应激诱导的高血糖是有问题的，因为它会干扰胰岛素给药时葡萄糖下降的速度和幅度¹²。这可能会导致关于胰岛素抵抗存在的错误结论。因此，为了减轻 ITT 期间压力对葡萄糖水平的混杂影响，我们开发了一种在进行 ITT 之前让小鼠适应处理、注射和采血的方法。

研究方案

此处描述的所有方法均已获得 VA 普吉特海湾医疗保健系统的机构动物护理和使用委员会的批准。

注意：当地对低血糖动物的监测和/或干预要求可能与此处描述的不同。

1. 禁食 （t= -210 分钟）

1. 黑暗循环结束后，将小鼠转移到具有非营养垫料的新笼子中，例如纤维素或纸垫料（不是玉米棒垫料，如果被小鼠食用，会影响代谢终点¹³）。在整个禁食期间为小鼠提供随意饮水的机会。与小鼠组的一天禁食时间和持续时间保持一致。对于显示的数据，食物在 0700 到 0800 小时之间被去除，即黑暗循环结束后的 1-2 小时。
2. 将笼子移动到将执行 ITT 的位置。这应该是一个安静的空间，最大限度地减少温度、噪音、光线或运动等压力源。

2. 驯化 （t= -150 至 -60 分钟）

重要提示：尽可能轻柔地处理鼠标。如果可能，避免使用约束装置。

1. 在 -150 分钟时，测量体重。这将用于计算将为 ITT 施用的胰岛素量。
2. 轻轻地捡起鼠标的尾巴，放在平坦的桌面上，同时仍然轻轻地抓住鼠标的尾巴。使用 20 G 针（或手术剪刀）在尾巴尖端做一个小切口。该部位应开始形成一滴血。
3. 将鼠标放在光滑坚硬的表面上，并轻轻地用尾巴约束鼠标。
   1. 要记录此时的血糖，请将尾尖的一滴血滴在手持式血糖仪的试纸上。如有必要， 非常轻柔 地按摩尾巴以获得一滴血。
4. 将 100 μL 无菌生理盐水吸入胰岛素注射器中。轻轻地捡起鼠标并腹膜内注射。记录生理盐水注射的时间。
   1. 如果正在研究多只小鼠，则每隔 1 分钟向小鼠注射生理盐水，以便为后续步骤留出时间。
5. 注射盐水后 15 分钟，轻轻地捡起小鼠的尾巴。用纱布轻轻去除尾尖上的任何血凝块。
   1. 可选：此时再次记录血糖，如步骤 2.3 中所述。
6. 注射盐水后 30 分钟，轻轻地抓住鼠标的尾巴。如果需要，按照步骤 2.3 中的说明进行另一次血糖测量。
7. 将鼠标放回笼子中，并根据需要对其他鼠标重复此作。让小鼠不受干扰直到 -90 分钟。
8. 在 -90 分钟时，重复步骤 2.3 至 2.6，包括测量血糖水平（如果需要）。
9. 将鼠标放回笼子中，根据需要对其他鼠标重复此作。让小鼠不受干扰，直到 ITT（基线血糖测量在 -5 分钟进行）。

3. 胰岛素耐量测试 （t= -5 至 +60 分钟）

1. 在无菌盐水中制备普通胰岛素 （CAUTION） 的工作溶液，以便可以以 4 μL/g 体重注射所需剂量。
   注意：处理胰岛素时应小心，因为意外注射会导致低血糖。
2. 在无菌盐水中制备 25% （v/v） 葡萄糖溶液，以备小鼠出现需要干预的低血糖症时使用。
3. 在 -5 分钟时，轻轻地捡起鼠标的尾巴。通过将尾尖的一滴血滴在手持式血糖仪的试纸上，确定此时的基线血糖水平。如有必要， 非常轻柔 地按摩尾巴以获得一滴血。
4. 将胰岛素工作溶液吸入胰岛素注射器中（4 μL/g 体重，典型剂量范围为 0.5-2.0 U/kg）。轻轻地捡起鼠标并腹膜内注射。记录胰岛素注射时间。
   1. 如果正在研究多只小鼠，则每隔 1 分钟向小鼠注射胰岛素，以便有时间进行后续的血液采样和下面的数据记录。
5. 注射胰岛素后 15 分钟，轻轻地捡起鼠标的尾巴。用纱布轻轻去除尾尖上的任何血凝块。此时按照步骤 3.3 中的说明再次测定血糖。
6. 将鼠标放回笼子并监测低血糖的迹象（例如，过度嗜睡）。如果小鼠出现低血糖症状，请按照步骤 5 中的说明测量血糖，并在必要时给予葡萄糖。此时，接受葡萄糖干预的小鼠将从 ITT 方案中删除。
7. 注射胰岛素后 30 分钟重复步骤 3.5 和 3.6。
8. 注射胰岛素后 45 分钟重复步骤 3.5 和 3.6。
9. 注射胰岛素后 60 分钟重复步骤 3.5 和 3.6。
10. 将小鼠放回它们的家笼中，笼子的地板上有一些食物颗粒，以帮助从 ITT 中恢复。继续监测 30 分钟，如果小鼠没有恢复正常的活动/行为，请按照步骤 3.6 中描述的程序进行作。
    注意： 图 1 总结了上述驯化和 ITT 程序。

结果

图 2A 和 图 3A 是代表性数据（分别为个体和平均数据），显示糖尿病 db/db 小鼠在胰岛素给药后 15 分钟内血糖水平反常升高，与应激诱导的高血糖一致。请注意，在接受相同程序的对照非糖尿病同窝同窝 （db/+ 或 +/+） 中，血糖没有明显升高。为了确定适应 ITT 程序是否能有效缓解这种血糖升高，同一只小鼠接受了上述驯化方案...

讨论

高胰岛素-正常血糖钳夹被认为是评估体内胰岛素作用的金标准。对执行钳夹方法的修改导致该技术在有意识的、不受约束的小鼠² 中完成，这些小鼠之前已使用双导管系统¹⁴ 进行导管插入，以便通过颈动脉进行血液采样和通过颈静脉输注。这限制了在手术过程中处理或约束小鼠的需要，从而减少压力反应²。众所周知?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextrose-50	Pfizer Injectables	00409-6648-16	For use if mouse experiences hypoglycemia.
Gauze pads	Fisher Scientific	22037907	To dislodge blood clot on the tail tip.
Glucometer	Accu-Chek	M001_us	To measure blood glucose.
Gram scale			To measure body weight.
Insulin (Novolin R)	Novo Nordisk	0169-1833-11	For injection.
Insulin syringes	VWR	BD-329461	For injections.
Minute timer
Sterile 20 G needle	VWR	BD-305175	For tail snip.
Sterile saline	Lifeshield	1261699	For injections.
Surgical scissors	Fine Science Tools	14088-10	For tail snip.
Test strips	Accu-Chek	06908217001_us	To measure blood glucose.