Bilinçli farelerde strese bağlı hiperglisemiyi azaltmak için intraperitoneal insülin tolerans testinden önce iklimlendirme

Özet

Glikoz seviyelerinde strese bağlı yükselmeler, farelerde bilinçli bir intraperitoneal insülin tolerans testinden elde edilen verilerin yorumlanmasını zorlaştırabilir. Bu yazıda, strese bağlı hiperglisemiyi sınırlamak için insülin tolerans testini gerçekleştirmeden önce fareleri kullanıma, enjeksiyonlara ve kan örneklemesine alıştırmak için bir yöntem açıklıyoruz.

Özet

İnsülin tolerans testi, kemirgenlerde tüm vücut insülin duyarlılığını değerlendirmek için metabolik çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Tek bir intraperitoneal insülin enjeksiyonunu takiben zaman içinde kan şekeri seviyelerinin ölçülmesini içeren nispeten basit bir testtir. Bilinçli durumda gerçekleştirildiği ve kanın genellikle bir kuyruk parçası yoluyla toplandığı göz önüne alındığında, taşıma ve kan alma ile ilgili kaygı nedeniyle hayvanlardan bir stres tepkisi ortaya çıkarma potansiyeline sahiptir. Bu nedenle, kan şekerinde strese bağlı bir artış meydana gelebilir ve bu da birincil son nokta ölçüsünün, yani kan şekerinde insülin aracılı bir azalmanın tespit edilmesini ve yorumlanmasını zorlaştırır. Bu, birçok fare suşunda görülmüştür ve insülin uygulamasından sonra glikoz seviyelerinin düşmek yerine artabileceği diyabetik db / db farelerde oldukça yaygındır. Burada, insülin tolerans testini gerçekleştirmeden önce fareleri kullanıma, enjeksiyonlara ve kan örneklemesine alıştırmak için bir yöntem açıklıyoruz. Bunun strese bağlı hiperglisemiyi azalttığını ve tüm vücut insülin duyarlılığını daha doğru bir şekilde yansıtan verilerle sonuçlandığını bulduk.

Giriş

Kemirgenlerde metabolik testler, glikoz homeostazını düzenleyen çeşitli parametreleri değerlendirmek için rutin olarak yapılır¹. Tüm vücut insülin etkisini in vivo değerlendirmek için altın standart hiperinsülinemik-öglisemik klemp^2'dir. Bu test, öglisemiyi korumak için glikoz infüze edilirken dolaşımdaki insülin seviyelerini yükseltmek için insülinin uygulanmasını içerir. Öglisemiyi korumak için gereken glikoz infüzyon hızı, insülin etkisinin göstergesidir. Metabolik araştırmalarda güçlü bir araç olmasına rağmen, farelerde kelepçe tekniği teknik olarak zorlu ve emek yoğundur ve bu nedenle metabolik bir fenotipi karakterize etmede ilk tarama aracı olarak pek uygun değildir. Bu nedenlerden dolayı, genellikle daha basit olan intraperitoneal insülin tolerans testi (ITT) seçilir.

ITT, açlık süresinin ardından (tipik olarak 4-6 saat) bilinçli durumda gerçekleştirilir. İntraperitoneal olarak bir insülin bolusu uygulanır, ardından kan şekeri genellikle 60 dakika süren bir zaman dilimi boyunca izlenir. İnsülinin insüline duyarlı dokulara glikoz alımını kolaylaştırma kabiliyeti nedeniyle kan şekeri seviyelerinin düşmesi beklenir; Bunun meydana gelme derecesi, tüm vücut insülin etkisinin göstergesidir. Bazı durumlarda, insülin uygulamasından sonra glikoz seviyelerinin düşmek yerine paradoksal olarak arttığı gösterilmiştir. Bu fenomen muhtemelen bir stres tepkisine atfedilir. Kullanım, enjeksiyonlar ve kan örneklemesinin tümü strese^{neden olabilir 3,4,5}, bu da hipotalamik-hipofiz-adrenal eksenin (HPA) ve otonom sinir sisteminin (ANS) aktivasyonuna neden olabilir6,7,8. Hem HPA hem de ANS'nin dolaşımdaki glikoz seviyelerindeki artışa katkıda bulunduğu iyi bilinmektedir ^9,10,11. Bir ITT'nin başlangıcında strese bağlı hipergliseminin varlığı, insülin uygulaması üzerine glikozdaki düşüşün hızı ve büyüklüğü ile etkileşime girdiği için sorunludur¹². Bu, insülin direncinin varlığı ile ilgili yanlış sonuçlara yol açabilir. Bu nedenle, bir ITT sırasında stresin glikoz seviyeleri üzerindeki kafa karıştırıcı etkisini azaltmak için, ITT'yi gerçekleştirmeden önce fareleri kullanım, enjeksiyonlar ve kan örneklemesine alıştırmak için bir yöntem geliştirdik.

Protokol

Burada açıklanan tüm yöntemler, VA Puget Sound Health Care System'in Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.

NOT: Hipoglisemi yaşayan hayvanların izlenmesi ve/veya müdahalesi için yerel gereksinimler burada açıklananlardan farklı olabilir.

1. Oruç (t= -210 dk)

1. Karanlık döngü sona erdikten sonra, fareleri selüloz veya kağıt yatak takımı gibi besleyici olmayan yatak takımlarına sahip yeni bir kafese aktarın (fareler tarafından tüketilirse metabolik uç noktaları etkileyecek olan mısır koçanı yatağı değil)¹³). Oruç süresi boyunca farelere suya ad libitum erişim sağlayın. Fare grupları arasında günün oruç saati ve süresi ile tutarlı olun. Gösterilen veriler için, yiyecekler 0700 ile 0800 saatleri arasında, yani karanlık döngünün sona ermesinden 1-2 saat sonra çıkarıldı.
2. Kafes(ler)i ITT'nin gerçekleştirileceği yere taşıyın. Bu, sıcaklık, gürültü, ışık veya hareket gibi stres faktörlerinin en aza indirildiği sessiz bir alan olmalıdır.

2. Alışma (t = -150 ila -60 dakika)

ÖNEMLİ: Fareleri mümkün olduğunca nazikçe tutun. Mümkünse bir emniyet cihazı kullanmaktan kaçının.

1. -150 dakikada vücut ağırlığını ölçün. Bu, ITT için uygulanacak insülin hacminin hesaplanması için kullanılacaktır.
2. Fareyi nazikçe kuyruğundan alın ve kuyruğu nazikçe tutarken düz bir masa üstü yüzeyine koyun. Kuyruğun ucunda küçük bir kesi yapmak için 20 G'lik bir iğne (veya cerrahi makas) kullanın. Bölgede bir damla kan oluşmaya başlamalıdır.
3. Fareyi pürüzsüz ve sert bir yüzeye yerleştirin ve fareyi kuyruğundan nazikçe tutun.
   1. Bu sırada kan şekerini kaydetmek için, elde taşınan bir glukometrenin test şeridine kuyruk ucundan bir damla kan yerleştirin. Gerekirse, bir damla kan elde etmek için kuyruğa çok nazikçe masaj yapın.
4. Bir insülin şırıngasına 100 μL steril salin çekin. Fareyi hafifçe tırmalama kullanarak alın ve intraperitoneal olarak enjekte edin. Salin enjeksiyonunun zamanını kaydedin.
   1. Birden fazla fare üzerinde çalışılıyorsa, aşağıdaki sonraki adımlar için zaman tanımak için farelere 1 dakikalık aralıklarla salin enjekte edin.
5. Salin enjeksiyonundan 15 dakika sonra, fareyi kuyruğundan nazikçe alın. Kuyruk ucundaki kan pıhtısını nazikçe çıkarmak için gazlı bez kullanın.
   1. İsteğe bağlı: Adım 2.3'te açıklandığı gibi bu sırada kan şekerini tekrar kaydedin.
6. Salin enjeksiyonundan 30 dakika sonra, fareyi yavaşça kuyruğundan alın. İstenirse, adım 2.3'te açıklandığı gibi başka bir kan şekeri ölçümü alın.
7. Fareyi kafese geri koyun ve diğer fareler için gerektiği kadar tekrarlayın. Fareleri -90 dakikaya kadar rahatsız etmeyin.
8. -90 dakikada, istenirse kan şekeri seviyelerinin ölçümü de dahil olmak üzere 2.3 ila 2.6 arasındaki adımları tekrarlayın.
9. Fareyi kafese geri koyun, gerektiği kadar diğer fareler için tekrarlayın. ITT'ye kadar fareleri rahatsız etmeyin (bunun için temel kan şekeri ölçümü -5 dakikada yapılır).

3. İnsülin Tolerans Testi (t= -5 ila +60 dk)

1. İstenilen doz 4 μL / g vücut ağırlığında enjekte edilebilecek şekilde steril salin içinde çalışan bir düzenli insülin çözeltisi (DİKKAT) hazırlayın.
   NOT: Yanlışlıkla enjeksiyon hipoglisemiye neden olabileceğinden, insülin ile çalışırken dikkatli olunmalıdır.
2. Farelerde müdahale gerektiren hipoglisemi gelişmesi durumunda elinizin altında bulundurmak için steril salin içinde% 25 (h / h) dekstroz çözeltisi hazırlayın.
3. -5 dakikada, fareyi kuyruğundan nazikçe alın. El tipi bir glukometrenin test şeridine kuyruk ucundan bir damla kan koyarak şu anda temel kan şekeri seviyesini belirleyin. Gerekirse, bir damla kan elde etmek için kuyruğa çok nazikçe masaj yapın.
4. İnsülin çalışma solüsyonunu bir insülin şırıngasına (tipik bir doz aralığı 0.5-2.0 U / kg için 4 μL / g vücut ağırlığı) hazırlayın. Fareyi hafifçe tırmalama kullanarak alın ve intraperitoneal olarak enjekte edin. İnsülin enjeksiyonunun rekor süresi.
   1. Birden fazla fare üzerinde çalışılıyorsa, sonraki kan örneklemesi ve aşağıdaki veri kaydı için zaman tanımak için farelere 1 dakikalık aralıklarla insülin enjekte edin.
5. İnsülin enjeksiyonundan 15 dakika sonra, fareyi kuyruğundan nazikçe alın. Kuyruk ucundaki kan pıhtısını nazikçe çıkarmak için gazlı bez kullanın. Bu sırada kan şekerini adım 3.3'te açıklandığı gibi tekrar belirleyin.
6. Fareyi kafese geri koyun ve hipoglisemi belirtileri (örn. aşırı uyuşukluk) olup olmadığını izleyin. Farelerde hipoglisemi semptomları gelişirse, 5. adımda anlatıldığı gibi kan şekerini ölçün ve gerekirse dekstroz uygulayın. Dekstroz müdahalesi geçiren bir fare bu sırada ITT protokolünden çıkarılacaktır.
7. İnsülin enjeksiyonundan 30 dakika sonra 3.5 ve 3.6 adımlarını tekrarlayın.
8. İnsülin enjeksiyonundan 45 dakika sonra 3.5 ve 3.6 adımlarını tekrarlayın.
9. İnsülin enjeksiyonundan 60 dakika sonra 3.5 ve 3.6 adımlarını tekrarlayın.
10. Fareleri, ITT'den kurtarmaya yardımcı olmak için kafesin tabanında birkaç yiyecek peleti içeren ev kafeslerine geri koyun. 30 dakika boyunca izlemeye devam edin ve fareler normal aktivite / davranışı geri kazanmadıysa, adım 3.6'da açıklanan prosedürü izleyin.
    NOT: Şekil 1 , yukarıdaki iklimlendirme ve ITT prosedürünü özetlemektedir.

Sonuçlar

Şekil 2A ve Şekil 3A , strese bağlı hiperglisemi ile tutarlı olarak, insülin uygulamasını takip eden 15 dakika içinde diyabetik db / db farelerde kan şekeri seviyelerinde paradoksal bir artış gösteren temsili verilerdir (sırasıyla bireysel ve ortalama veriler). Aynı prosedüre tabi tutulan kontrol diyabetik olmayan littermatlarda (db / + veya +/+) kan şekerinde herhangi bir artış görülmediğini unutmayın. I...

Tartışmalar

Hiperinsülinemik-öglisemik klemp, in vivo insülin etkisini değerlendirmek için altın standart olarak kabul edilir. Klempi gerçekleştirme metodolojisinde yapılan değişiklikler, tekniğin, karotis arter yoluyla kan örneklemesini ve juguler ven yoluyla infüzyonları mümkün kılmak için daha önce iki kateterli bir sistem¹⁴ kullanılarak kateterize edilmiş bilinçli, dizginlenmemiş^farelerde 2 yapılmasına neden olmuştur. Bu,...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextrose-50	Pfizer Injectables	00409-6648-16	For use if mouse experiences hypoglycemia.
Gauze pads	Fisher Scientific	22037907	To dislodge blood clot on the tail tip.
Glucometer	Accu-Chek	M001_us	To measure blood glucose.
Gram scale			To measure body weight.
Insulin (Novolin R)	Novo Nordisk	0169-1833-11	For injection.
Insulin syringes	VWR	BD-329461	For injections.
Minute timer
Sterile 20 G needle	VWR	BD-305175	For tail snip.
Sterile saline	Lifeshield	1261699	For injections.
Surgical scissors	Fine Science Tools	14088-10	For tail snip.
Test strips	Accu-Chek	06908217001_us	To measure blood glucose.