Acclimatazione prima di un test intraperitoneale di tolleranza all'insulina per mitigare l'iperglicemia indotta da stress nei topi coscienti

Riepilogo

Gli aumenti dei livelli di glucosio indotti dallo stress possono confondere l'interpretazione dei dati derivati da un test di tolleranza all'insulina intraperitoneale cosciente nei topi. In questo articolo, descriviamo un metodo per acclimatare i topi alla manipolazione, alle iniezioni e al prelievo di sangue prima di eseguire il test di tolleranza all'insulina al fine di limitare l'iperglicemia indotta dallo stress.

Abstract

Il test di tolleranza all'insulina è comunemente usato negli studi metabolici per valutare la sensibilità all'insulina di tutto il corpo nei roditori. È un test relativamente semplice che prevede la misurazione dei livelli di glucosio nel sangue nel tempo dopo una singola iniezione intraperitoneale di insulina. Dato che viene eseguito nello stato cosciente e il sangue viene spesso raccolto tramite un taglio della coda, ha il potenziale per suscitare una risposta allo stress negli animali a causa dell'ansia associata alla manipolazione e alla raccolta del sangue. Pertanto, può verificarsi un aumento della glicemia indotto dallo stress, rendendo difficile rilevare e interpretare la misura dell'endpoint primario, vale a dire una riduzione della glicemia mediata dall'insulina. Questo è stato osservato in molti ceppi di topi ed è abbastanza comune nei topi diabetici db/db, dove i livelli di glucosio possono aumentare, piuttosto che diminuire, dopo la somministrazione di insulina. Qui, descriviamo un metodo per acclimatare i topi alla manipolazione, alle iniezioni e al prelievo di sangue prima di eseguire il test di tolleranza all'insulina. Scopriamo che questo riduce l'iperglicemia indotta dallo stress e si traduce in dati che riflettono in modo più accurato la sensibilità all'insulina di tutto il corpo.

Introduzione

I test metabolici nei roditori vengono eseguiti di routine per valutare vari parametri che regolano l'omeostasi del glucosio¹. Il gold standard per valutare l'azione dell'insulina in tutto il corpo in vivo è il clamp iperinsulinemico-euglicemico². Questo test prevede la somministrazione di insulina per aumentare i livelli di insulina circolante mentre il glucosio viene infuso per mantenere l'euglicemia. La velocità di infusione del glucosio necessaria per mantenere l'euglicemia è indicativa dell'azione dell'insulina. Sebbene sia uno strumento potente nella ricerca metabolica, la tecnica del clamp nei topi è tecnicamente impegnativa e laboriosa, e quindi non è adatta come strumento di screening iniziale nella caratterizzazione di un fenotipo metabolico. Per questi motivi, viene spesso scelto il più semplice test di tolleranza all'insulina intraperitoneale (ITT).

L'ITT viene eseguita in stato di coscienza dopo un periodo di digiuno (in genere 4-6 ore). Un bolo di insulina viene somministrato per via intraperitoneale, dopodiché la glicemia viene monitorata per un periodo di tempo che di solito dura 60 minuti. Si prevede che i livelli di glucosio nel sangue diminuiscano a causa della capacità dell'insulina di facilitare l'assorbimento del glucosio nei tessuti sensibili all'insulina; Il grado in cui ciò si verifica è indicativo dell'azione dell'insulina in tutto il corpo. In alcuni casi, è stato dimostrato che i livelli di glucosio paradossalmente aumentano, piuttosto che diminuire, dopo la somministrazione di insulina. Questo fenomeno è probabilmente attribuito a una risposta allo stress. La manipolazione, le iniezioni e il prelievo di sangue possono indurre stress ^3,4,5, con conseguente attivazione dell'asse ipotalamo-ipofisi-surrene (HPA) e del sistema nervoso autonomo (ANS)^6,7,8. È noto che sia l'HPA che l'ANS contribuiscono all'aumento dei livelli di glucosio circolante ^9,10,11. La presenza di iperglicemia indotta da stress all'inizio di un ITT è problematica, in quanto interferisce con la velocità e l'entità della caduta del glucosio dopo la somministrazione di insulina¹². Questo può portare a conclusioni errate riguardo alla presenza di insulino-resistenza. Pertanto, per mitigare l'impatto confondente dello stress sui livelli di glucosio durante un ITT, abbiamo sviluppato un metodo per acclimatare i topi alla manipolazione, alle iniezioni e al prelievo di sangue prima di eseguire l'ITT.

Protocollo

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del VA Puget Sound Health Care System.

NOTA: I requisiti locali per il monitoraggio e/o l'intervento degli animali che soffrono di ipoglicemia possono differire da quelli qui descritti.

1. Digiuno (t= -210 min)

1. Al termine del ciclo di buio, trasferisci i topi in una nuova gabbia con lettiera non nutriente come lettiera di cellulosa o di carta (non lettiera di pannocchie, che influenzerà gli endpoint metabolici se consumata dai topi¹³). Fornire ai topi l'accesso ad libitum all'acqua durante il periodo di digiuno. Sii coerente con l'ora del giorno e la durata del digiuno tra i gruppi di topi. Per i dati mostrati, il cibo è stato rimosso tra le 07:00 e le 08:00, ovvero 1-2 ore dopo la fine del ciclo di buio.
2. Spostare le gabbie nel luogo in cui verrà eseguito l'ITT. Questo dovrebbe essere uno spazio tranquillo in cui i fattori di stress come la temperatura, il rumore, la luce o il movimento sono ridotti al minimo.

2. Acclimatazione (t= da -150 a -60 min)

IMPORTANTE: Maneggiare i mouse il più delicatamente possibile. Se possibile, evitare l'uso di un dispositivo di ritenuta.

1. A -150 min, misurare il peso corporeo. Questo verrà utilizzato per il calcolo del volume di insulina che verrà somministrato per l'ITT.
2. Prendi delicatamente il mouse per la coda e appoggialo su una superficie piana del tavolo, pur afferrando delicatamente la coda. Usa un ago da 20 G (o forbici chirurgiche) per praticare una piccola incisione sulla punta della coda. Una goccia di sangue dovrebbe iniziare a formarsi nel sito.
3. Posizionare il mouse su una superficie liscia e dura e trattenere delicatamente il mouse per la coda.
   1. Per registrare la glicemia in questo momento, posizionare una goccia di sangue dalla punta della coda sulla striscia reattiva di un glucometro portatile. Se necessario, massaggiare molto delicatamente la coda per ottenere una goccia di sangue.
4. Aspirare 100 μl di soluzione fisiologica sterile in una siringa da insulina. Prendere il mouse con una leggera collottola e iniettare per via intraperitoneale. Registrare il tempo di iniezione di soluzione salina.
   1. Se sono in fase di studio più topi, iniettare nei topi soluzione fisiologica a intervalli di 1 minuto per consentire il tempo per i passaggi successivi di seguito.
5. A 15 minuti dall'iniezione di soluzione fisiologica, sollevare delicatamente il topo per la coda. Usa una garza per rimuovere delicatamente eventuali coaguli di sangue sulla punta della coda.
   1. Facoltativo: registrare nuovamente la glicemia in questo momento come descritto al punto 2.3.
6. A 30 minuti dall'iniezione di soluzione salina, sollevare delicatamente il topo per la coda. Se lo si desidera, ottenere un'altra misurazione della glicemia come descritto al punto 2.3.
7. Rimetti il mouse nella gabbia e ripeti l'operazione per gli altri topi, se necessario. Lasciare i topi indisturbati fino a -90 min.
8. A -90 minuti, ripetere i passaggi da 2,3 a 2,6, inclusa la misurazione dei livelli di glucosio nel sangue, se lo si desidera.
9. Rimetti il mouse nella gabbia, ripeti per altri topi se necessario. Lasciare i topi indisturbati fino all'ITT (per il quale la misurazione della glicemia di base viene eseguita a -5 minuti).

3. Test di tolleranza all'insulina (t= da -5 a +60 min)

1. Preparare una soluzione di lavoro di insulina normale (ATTENZIONE) in soluzione fisiologica sterile, in modo tale che la dose desiderata possa essere iniettata a 4 μL/g di peso corporeo.
   NOTA: Si deve usare cautela quando si maneggia l'insulina poiché l'iniezione accidentale può provocare ipoglicemia.
2. Preparare una soluzione di destrosio al 25% (v/v) in soluzione fisiologica sterile da avere a portata di mano nel caso in cui i topi sviluppino ipoglicemia che richieda un intervento.
3. A -5 minuti, prendi delicatamente il mouse per la coda. Determinare il livello di glucosio nel sangue basale in questo momento, posizionando una goccia di sangue dalla punta della coda sulla striscia reattiva di un glucometro portatile. Se necessario, massaggiare molto delicatamente la coda per ottenere una goccia di sangue.
4. Aspirare la soluzione di lavoro dell'insulina in una siringa da insulina (4 μL/g di peso corporeo, per un intervallo di dose tipico di 0,5-2,0 U/kg). Prendere il mouse con una leggera collottola e iniettare per via intraperitoneale. Tempo record di iniezione di insulina.
   1. Se sono in corso studi su più topi, iniettare nei topi insulina a intervalli di 1 minuto per consentire il tempo per il successivo prelievo di sangue e la registrazione dei dati di seguito.
5. A 15 minuti dall'iniezione di insulina, prendi delicatamente il topo per la coda. Usa una garza per rimuovere delicatamente eventuali coaguli di sangue sulla punta della coda. Determinare nuovamente la glicemia in questo momento come descritto al punto 3.3.
6. Rimetti il topo nella gabbia e monitora la presenza di segni di ipoglicemia (ad esempio, letargia eccessiva). Se i topi sviluppano sintomi di ipoglicemia, misurare la glicemia come descritto al punto 5 e somministrare destrosio se necessario. Un topo sottoposto a intervento di destrosio verrebbe rimosso dal protocollo ITT in questo momento.
7. Ripetere i passaggi 3.5 e 3.6 a 30 minuti dopo l'iniezione di insulina.
8. Ripetere i passaggi 3.5 e 3.6 a 45 minuti dopo l'iniezione di insulina.
9. Ripetere i passaggi 3.5 e 3.6 a 60 minuti dopo l'iniezione di insulina.
10. Rimetti i topi nella loro gabbia di casa, contenente alcuni pellet di cibo sul pavimento della gabbia per aiutare il recupero dall'ITT. Continuare a monitorare per 30 minuti e se i topi non hanno riacquistato la normale attività/comportamento, seguire la procedura descritta al punto 3.6.
    NOTA: La Figura 1 riassume la procedura di acclimatazione e ITT di cui sopra.

Risultati

La Figura 2A e la Figura 3A sono dati rappresentativi (dati individuali e medi, rispettivamente) che mostrano un aumento paradossale dei livelli di glucosio nel sangue nei topi diabetici db/db nei 15 minuti successivi alla somministrazione di insulina, coerente con l'iperglicemia indotta da stress. Si noti che nessun aumento della glicemia era evidente nei compagni di cucciolata non diabetici di controllo (db/+ o +/+) sottoposti...

Discussione

Il clamp iperinsulinemico-euglicemico è considerato il gold standard per valutare l'azione dell'insulina in vivo. Le modifiche alla metodologia per l'esecuzione del clamp hanno portato all'esecuzione della tecnica in topi coscienti e non trattenuti² che sono stati precedentemente cateterizzati utilizzando un sistema a due cateteri¹⁴ per consentire il campionamento del sangue attraverso l'arteria carotide e le infusioni attraverso la vena g...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextrose-50	Pfizer Injectables	00409-6648-16	For use if mouse experiences hypoglycemia.
Gauze pads	Fisher Scientific	22037907	To dislodge blood clot on the tail tip.
Glucometer	Accu-Chek	M001_us	To measure blood glucose.
Gram scale			To measure body weight.
Insulin (Novolin R)	Novo Nordisk	0169-1833-11	For injection.
Insulin syringes	VWR	BD-329461	For injections.
Minute timer
Sterile 20 G needle	VWR	BD-305175	For tail snip.
Sterile saline	Lifeshield	1261699	For injections.
Surgical scissors	Fine Science Tools	14088-10	For tail snip.
Test strips	Accu-Chek	06908217001_us	To measure blood glucose.