Aclimatación antes de una prueba de tolerancia a la insulina intraperitoneal para mitigar la hiperglucemia inducida por el estrés en ratones conscientes

Resumen

Las elevaciones de los niveles de glucosa inducidas por el estrés pueden confundir la interpretación de los datos derivados de una prueba consciente de tolerancia a la insulina intraperitoneal en ratones. En este artículo, describimos un método para aclimatar a los ratones a la manipulación, inyecciones y muestras de sangre antes de realizar la prueba de tolerancia a la insulina con el fin de limitar la hiperglucemia inducida por el estrés.

Resumen

La prueba de tolerancia a la insulina se usa comúnmente en estudios metabólicos para evaluar la sensibilidad a la insulina de todo el cuerpo en roedores. Es una prueba relativamente sencilla que consiste en medir los niveles de glucosa en sangre a lo largo del tiempo después de una única inyección intraperitoneal de insulina. Dado que se realiza en el estado consciente y la sangre a menudo se recolecta a través de un corte de cola, tiene el potencial de provocar una respuesta de estrés en los animales debido a la ansiedad asociada con la manipulación y la recolección de sangre. Como tal, puede ocurrir un aumento de la glucosa en sangre inducido por el estrés, lo que dificulta la detección e interpretación de la medida principal del criterio de valoración, es decir, una reducción de la glucosa en sangre mediada por la insulina. Esto se ha observado en muchas cepas de ratones, y es bastante común en ratones diabéticos db/db, donde los niveles de glucosa pueden aumentar, en lugar de disminuir, después de la administración de insulina. Aquí, describimos un método para aclimatar ratones a la manipulación, inyecciones y muestras de sangre antes de realizar la prueba de tolerancia a la insulina. Descubrimos que esto reduce la hiperglucemia inducida por el estrés y da como resultado datos que reflejan con mayor precisión la sensibilidad a la insulina en todo el cuerpo.

Introducción

Las pruebas metabólicas en roedores se realizan de forma rutinaria para evaluar diversos parámetros que regulan la homeostasis de la glucosa¹. El estándar de oro para evaluar la acción de la insulina en todo el cuerpo in vivo es el pinzamiento hiperinsulinémico-euglucémico². Esta prueba implica la administración de insulina para elevar los niveles de insulina circulante mientras se infunde glucosa para mantener la euglucemia. La velocidad de infusión de glucosa necesaria para mantener la euglucemia es indicativa de la acción de la insulina. Si bien es una herramienta poderosa en la investigación metabólica, la técnica de pinzamiento en ratones es técnicamente desafiante y requiere mucha mano de obra, por lo que no es adecuada como herramienta de detección inicial para caracterizar un fenotipo metabólico. Por estas razones, a menudo se elige la prueba de tolerancia a la insulina intraperitoneal (ITT) más simple.

El ITT se realiza en el estado consciente después de un período de ayuno (generalmente de 4 a 6 horas). Se administra un bolo de insulina por vía intraperitoneal, después de lo cual se controla la glucosa en sangre durante un período de tiempo que suele durar 60 minutos. Se espera que los niveles de glucosa en sangre disminuyan debido a la capacidad de la insulina para facilitar la absorción de glucosa en los tejidos sensibles a la insulina; El grado en que esto ocurre es indicativo de la acción de la insulina en todo el cuerpo. En algunos casos, se ha demostrado que los niveles de glucosa paradójicamente aumentan, en lugar de disminuir, después de la administración de insulina. Es probable que este fenómeno se atribuya a una respuesta al estrés. La manipulación, las inyecciones y la toma de muestras de sangre pueden inducir estrés ^3,4,5, lo que resulta en la activación del eje hipotálamo-hipófisis-suprarrenal (HPA) y del sistema nervioso autónomo (SNA)^6,7,8. Es bien sabido que tanto el HPA como el SNA contribuyen al aumento de los niveles de glucosa circulante ^9,10,11. La presencia de hiperglucemia inducida por el estrés al comienzo de un ITT es problemática, ya que interfiere con la tasa y magnitud de la caída de la glucosa tras la administración de insulina¹². Esto puede llevar a conclusiones erróneas con respecto a la presencia de resistencia a la insulina. Por lo tanto, para mitigar el impacto confuso del estrés en los niveles de glucosa durante un ITT, hemos desarrollado un método para aclimatar a los ratones a la manipulación, las inyecciones y las muestras de sangre antes de realizar el ITT.

Protocolo

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Sistema de Cuidado de la Salud Puget Sound de VA.

NOTA: Los requisitos locales para el monitoreo y/o intervención de animales que experimentan hipoglucemia pueden diferir de los descritos aquí.

1. Ayuno (t= -210 min)

1. Una vez finalizado el ciclo de oscuridad, transfiera a los ratones a una nueva jaula con lecho no nutritivo, como celulosa o papel (no lecho de mazorca de maíz, que afectará los criterios de valoración metabólicos si los ratones los consumen¹³). Proporcione a los ratones acceso ad libitum al agua durante todo el período de ayuno. Sea coherente con la hora del día y la duración del ayuno en todos los grupos de ratones. Para los datos mostrados, los alimentos se retiraron entre las 0700 y las 0800 horas, que fue 1-2 horas después de que terminara el ciclo de oscuridad.
2. Mueva la(s) jaula(s) al lugar donde se realizará el ITT. Debe ser un espacio tranquilo donde se minimicen los factores estresantes como la temperatura, el ruido, la luz o el movimiento.

2. Aclimatación (t= -150 a -60 min)

IMPORTANTE: Manipule los ratones con la mayor delicadeza posible. Evite el uso de un dispositivo de sujeción si es posible.

1. A -150 min, mida el peso corporal. Esto se utilizará para calcular el volumen de insulina que se administrará para el ITT.
2. Levante el ratón suavemente por la cola y descanse sobre una superficie plana sobre la mesa mientras sigue agarrando suavemente la cola. Use una aguja de 20 g (o tijeras quirúrgicas) para hacer una pequeña incisión en la punta de la cola. Una gota de sangre debe comenzar a formarse en el sitio.
3. Coloque el ratón sobre una superficie lisa y dura y sujete suavemente el ratón por la cola.
   1. Para registrar la glucosa en la sangre en este momento, coloque una gota de sangre de la punta de la cola en la tira reactiva de un glucómetro de mano. Si es necesario, masajee muy suavemente la cola para obtener una gota de sangre.
4. Extraiga 100 μL de solución salina estéril en una jeringa de insulina. Levantar el ratón con un suave desaliño e inyectar por vía intraperitoneal. Registre la hora de la inyección de solución salina.
   1. Si se están estudiando varios ratones, inyecte solución salina a intervalos de 1 minuto para dar tiempo a los pasos siguientes a continuación.
5. A los 15 minutos después de la inyección de solución salina, levante suavemente al ratón por la cola. Use una gasa para desalojar suavemente cualquier coágulo de sangre en la punta de la cola.
   1. Opcional: Registre la glucosa en sangre nuevamente en este momento como se describe en el paso 2.3.
6. A los 30 minutos después de la inyección de solución salina, levante suavemente al ratón por la cola. Si lo desea, obtenga otra medición de glucosa en sangre como se describe en el paso 2.3.
7. Regrese el ratón a la jaula y repita con otros ratones según sea necesario. Deje a los ratones intactos hasta -90 min.
8. A los -90 minutos, repita los pasos 2.3 a 2.6, incluida la medición de los niveles de glucosa en sangre si lo desea.
9. Regrese el ratón a la jaula, repita para otros ratones según sea necesario. Deje a los ratones sin perturbarlos hasta el ITT (para el cual la medición de la glucosa en sangre de referencia se realiza a -5 min).

3. Prueba de tolerancia a la insulina (t= -5 a +60 min)

1. Prepare una solución funcional de insulina regular (PRECAUCIÓN) en solución salina estéril, de modo que se pueda inyectar la dosis deseada a 4 μL/g de peso corporal.
   NOTA: Se debe tener precaución al manipular insulina, ya que una inyección accidental puede provocar hipoglucemia.
2. Prepare una solución de dextrosa al 25% (v/v) en solución salina estéril para tenerla a mano en caso de que los ratones desarrollen hipoglucemia y requieran intervención.
3. A -5 min, levante el ratón suavemente por la cola. Determine el nivel basal de glucosa en sangre en este momento, colocando una gota de sangre de la punta de la cola en la tira reactiva de un glucómetro de mano. Si es necesario, masajee muy suavemente la cola para obtener una gota de sangre.
4. Extraer la solución de trabajo de insulina en una jeringa de insulina (4 μL/g de peso corporal, para un rango de dosis típico de 0,5-2,0 U/kg). Levantar el ratón con un suave desaliño e inyectar por vía intraperitoneal. Tiempo récord de inyección de insulina.
   1. Si se están estudiando varios ratones, inyecte insulina a los ratones a intervalos de 1 minuto para dar tiempo a la toma de muestras de sangre posteriores y al registro de datos a continuación.
5. A los 15 minutos después de la inyección de insulina, levante suavemente al ratón por la cola. Use una gasa para desalojar suavemente cualquier coágulo de sangre en la punta de la cola. Determine la glucosa en sangre nuevamente en este momento como se describe en el paso 3.3.
6. Regrese el ratón a la jaula y vigile si hay signos de hipoglucemia (por ejemplo, letargo excesivo). Si los ratones desarrollan síntomas de hipoglucemia, mida la glucosa en sangre como se describe en el paso 5 y administre dextrosa si es necesario. Un ratón sometido a una intervención con dextrosa sería eliminado del protocolo ITT en este momento.
7. Repita los pasos 3.5 y 3.6 a los 30 minutos después de la inyección de insulina.
8. Repita los pasos 3.5 y 3.6 a los 45 minutos después de la inyección de insulina.
9. Repita los pasos 3.5 y 3.6 a los 60 minutos después de la inyección de insulina.
10. Regrese los ratones a su jaula de origen, que contiene algunas bolitas de comida en el piso de la jaula para ayudar en la recuperación de la ITT. Continúe monitoreando durante 30 minutos y si los ratones no han recuperado la actividad/comportamiento normal, siga el procedimiento descrito en el paso 3.6.
    NOTA: La Figura 1 resume el procedimiento de aclimatación e ITT anterior.

Resultados

La Figura 2A y la Figura 3A son datos representativos (datos individuales y medios, respectivamente) que muestran un aumento paradójico de los niveles de glucosa en sangre en ratones diabéticos db/db en los 15 minutos siguientes a la administración de insulina, compatible con hiperglucemia inducida por estrés. Nótese que no se evidenció un aumento de la glucosa en sangre en los compañeros de camada no diabéticos de contr...

Discusión

El clamp hiperinsulinémico-euglucémico se considera el estándar de oro para evaluar la acción de la insulina in vivo. Las modificaciones en la metodología para la realización del pinzamiento han dado lugar a que la técnica se realice en ratones conscientes y sin sujeción² que han sido previamente cateterizados utilizando un sistema de dos catéteres¹⁴ para permitir la toma de muestras de sangre a través de la arteria carótida y la...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextrose-50	Pfizer Injectables	00409-6648-16	For use if mouse experiences hypoglycemia.
Gauze pads	Fisher Scientific	22037907	To dislodge blood clot on the tail tip.
Glucometer	Accu-Chek	M001_us	To measure blood glucose.
Gram scale			To measure body weight.
Insulin (Novolin R)	Novo Nordisk	0169-1833-11	For injection.
Insulin syringes	VWR	BD-329461	For injections.
Minute timer
Sterile 20 G needle	VWR	BD-305175	For tail snip.
Sterile saline	Lifeshield	1261699	For injections.
Surgical scissors	Fine Science Tools	14088-10	For tail snip.
Test strips	Accu-Chek	06908217001_us	To measure blood glucose.