Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، أنشأنا طريقة منخفضة التكلفة وسهلة التشغيل التي توجه التمايز السريع والفعال من الخلايا الجذعية الجنينية إلى الخلايا العصبية. هذه الطريقة مناسبة لتعميم بين المختبرات ويمكن أن تكون أداة مفيدة للبحوث العصبية.

Abstract

التمايز العصبي للخلايا الجذعية الجنينية الماوس (mESCs) هو أداة محتملة لتوضيح الآليات الرئيسية المشاركة في تكوين الخلايا العصبية ويحتمل أن تساعد في الطب التجديدي. هنا، أنشأنا طريقة فعالة ومنخفضة التكلفة للتمايز العصبي من mESCs في المختبر، باستخدام استراتيجية الفرز الجمعي. في ظل الظروف المحددة هنا، فإن تكوين الجسم الجنيني لمدة يومين + بروتوكول تحريض حمض الريتينويك لمدة 6 أيام يسمح بالتمايز السريع والفعال من الـ mESCs إلى خلايا السلائف العصبية (NPCs)، كما يتضح من تشكيل A2lox و129 مشتقة من النستين المرصوفة بشكل جيد والنوريت الشبيهة بالنيوتريت و129 مشتقًا إيجابيًا. الحالة الصحية للأجسام الجنينية ونقطة الوقت التي يتم فيها تطبيق حمض الريتينويك (RA) ، وكذلك تركيزات RA ، أمر حاسم في هذه العملية. في التمايز اللاحق من NPCs إلى الخلايا العصبية، N2B27 المتوسطة II (تكملها متوسطة العصبية) يمكن أن تدعم بشكل أفضل الصيانة على المدى الطويل ونضوج الخلايا العصبية. الطريقة المعروضة هي الكفاءة العالية ، وانخفاض التكلفة وسهلة التشغيل ، ويمكن أن تكون أداة قوية لبحوث البيولوجيا العصبية والتنمية البيولوجية.

Introduction

الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs) هي متعددة القدرات ويمكن أن تفرق إلى الخلايا السليفة العصبية (NPCs) وبعد ذلك إلى الخلايا العصبية في ظل ظروف معينة1. يوفر تكوين الخلايا العصبية القائم على ESC أفضل منصة لمحاكاة النشوء العصبي ، وبالتالي بمثابة أداة مفيدة لدراسات البيولوجيا التنموية ويحتمل أن تساعد في الطب التجديدي2،3. في العقود الماضية، وقد تم الإبلاغ عن العديد من الاستراتيجيات لتحفيز تكوين جيني الجنين، مثل طريقة المعدلة وراثيا4، باستخدام جزيئات صغيرة5، وذلك باستخدام مصفوفة 3D microenvironment6، و شارك في ثقافة تقنية7. ومع ذلك، فإن معظم هذه البروتوكولات إما محدودة أو صعبة التشغيل، وبالتالي فهي غير مناسبة للاستخدام في معظم المختبرات.

للعثور على طريقة سهلة التشغيل ومنخفضة التكلفة لتحقيق تمايز عصبي فعال من mESCs ، تم استخدام استراتيجية فحص الجمع بين الدمج هنا. كما هو موضح في الشكل 1، تم تقسيم العملية الكاملة من النشوء العصبي الجنيني إلى مرحلتين. وتشير المرحلة الأولى إلى عملية التمايز بين الـ mESCs إلى NPCs، وتتعلق المرحلة الثانية بالتمايز اللاحق من NPCs إلى الخلايا العصبية. استنادا إلى مبادئ عملية سهلة، وانخفاض تكلفة، والمواد المتاحة بسهولة وكفاءة عالية التمايز، تم اختيار سبعة بروتوكولات في المرحلة الأولى وثلاثة بروتوكولات في المرحلة الثانية على أساس نظام ثقافة أحادية الطبقات التقليدية أو نظام تكوين الجسم الجنينية8،9. وتم تقييم كفاءة التمايز في البروتوكولات في كلتا المرحلتين باستخدام الملاحظة مورفولوجيا الخلية و قياس المناعة. من خلال الجمع بين البروتوكول الأكثر كفاءة في كل مرحلة ، أنشأنا الطريقة المثلى للتمايز العصبي من mESCs.

Protocol

1. ماوس الجنينية خلية جذعية ثقافة

  1. إعداد 0.1٪ الأطباق الجيلاتين ثقافة الخلية المغلفة أو لوحات.
    1. إضافة 2 مل من معقمة 0.1٪ الجيلاتين (0.1٪ ث / الخامس في الماء) إلى 60 ملم أطباق ثقافة الخلية. صخرة بلطف لضمان حتى طلاء أطباق ثقافة الخلية.
    2. وضع الأطباق في 5٪ CO2 حاضنة في 37 درجة مئوية والسماح للطلاء لمدة 1 ساعة.
    3. إزالة 0.1٪ حل الجيلاتين قبل البذر الخلايا.
      ملاحظة: بعد إزالة الجيلاتين، ليست هناك حاجة لتجفيف أو غسل الأطباق المغلفة.
  2. الخلايا الجذعية الجنينية الفأر (A2lox و 129) ثقافة
    1. مبسة mESCs (A2lox و 129) الخلايا في 0.1٪ الجيلاتين المغلفة 60 ملم أطباق ثقافة الخلية في المتوسط نمو mESC في 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 حاضنة، على التوالي. يتكون متوسط النمو mESC من 85٪ خروج المغلوب DMEM/F12، 15٪ استبدال مصل خروج المغلوب (KSR)، 0.1 mM β-mercaptoethanol (2ME)، 2 mM GlutaMAX، 1٪ من الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA)، 1٪ البنسلين / ستريبتوميسين (P/ S)، 1000 U/mL عامل مثبط للوكيميا (LIF)، 10 nM CHIR-99021 (GSK-3 المانع) و 0.33 nM PD0325901 (مثبطات MEK).
      تنبيه: β-ميركابتول هو قابل للاشتعال وسمية استنشاق. الابتعاد عن مصادر الحريق وارتداء قناع لتجنب استنشاق عند الاستخدام.
    2. تغيير متوسط نمو mESC يوميا لنمو أفضل من A2lox و 129.
    3. عندما تصل الخلايا التقاء 80٪ ، وإزالة المتوسطة وإضافة 1 مل من 0.1 ٪ التربسين إلى الطبق. صخرة بلطف لمدة 30 ثانية لضمان تغطية حتى من التربسين على جميع الخلايا.
    4. ترك الخلايا لمدة 1 دقيقة ل تريبسينizeثم إزالة التربسين باستخدام ماصة 1 مل.
    5. إضافة 2 مل من متوسطة نمو mESC للطبق، والماصات صعودا وهبوطا عدة مرات لجعل تعليق خلية واحدة.
    6. عد كثافة الخلايا في التعليق بأكبر قدر ممكن من الدقة باستخدام مقياس الهيموسيت.
    7. تقسيم الخلايا إلى 7 مجموعات والحث على التمايز باستخدام بروتوكولات مختلفة هو مبين في الجدول 1.

2- التمايز بين المراكز الفنية المتكاملة واللجان الوطنية (المرحلة الأولى)

  1. إعداد 0.1٪ الجيلاتين المغلفة لوحات الخلية أو الأغطية.
    1. قبل الاستخدام، قم بإعداد 0.1٪ من الجيلاتين المغلفة 6-آبار لوحات أو الأغطية كما هو الحال في الخطوة 1.1.
  2. المرحلة الأولى التمايز باستخدام البروتوكول 1 (الجدول 1)
    1. البذور حوالي 2 × 104 mESCs في 2 مل من التمايز القاعدي المتوسطة أنا في بئر في 0.1٪ الجيلاتين المغلفة 6-آبار لوحات. تحقق من كثافة الخلايا تحت المجهر.
    2. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 ح للسماح.
    3. بعد التعلق ، أخرج من الخلايا من الحاضنة ، واغسل الخلايا مرتين بـ 2 مل من PBS.
    4. إضافة 2 مل من التمايز القاعدي المتوسطة I(الجدول 1)إلى كل بئر ووضع الخلايا مرة أخرى في الحاضنة.
    5. ترك الخلايا للتمايز لمدة 8 أيام. استبدال متوسط التمايز القاعدي I كل 2 أيام.
  3. المرحلة الأولى التمايز باستخدام البروتوكول 2 (الجدول 1)
    1. إضافة 1.5 × 106 mESCs في طبق بكتيري غير التصّاد في 10 مل من التمايز القاعدي المتوسطة I للسماح لتكوين الجسم الجنيني عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 5٪ .
    2. بعد يومين، يتم تجميع الخلايا في أنابيب أجهزة الطرد المركزي 15 مل والسماح لهم تسوية من قبل الجاذبية.
    3. إزالة supernatant وإضافة 10 مل من التمايز القاعدي الطازج المتوسطة I لإعادة تعليق الهيئات الجنينية. إعادة زرعها في طبق بكتيري غير التصّاد جديد والسماح بالتمايز لمدة يومين آخرين.
    4. تحقق من تكوين الأجسام الجنينية تحت المجهر (الشكل 2A).
    5. جمع الأجسام الجنينية كما هو موضح في الخطوات 2.3.2-2.3.3. بذور حوالي 50 أجسام جنينية في 2 مل من التمايز القاعدي المتوسطة أنا في بئر على 0.1٪ الجيلاتين المغلفة 6-آبار لوحات.
    6. إعداد 1 mM جميع الأسهم ترانس RA (في DMSO) وتخزينها بعيدا عن الضوء في -80 درجة مئوية الفريزر بعد التعبئة والتغليف الفرعي.
      ملاحظة: RA غير مستقرة، وينبغي إيلاء الاهتمام للحفاظ عليه بعيدا عن الضوء والحد من الاتصال الجوي أثناء إعداد المخزون RA.
    7. بالنسبة لـ RA التعريفي، أضف 2 ميكرولتر من مخزون RA في كل بئر لجعل التركيز النهائي 1 ميكرومتر.
    8. ضع اللوحة في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية واتمايز لمدة 4 أيام أخرى.
    9. تغيير كامل 2 مل من التمايز القاعدي المتوسطة I (مع 1 μM RA) كل 2 أيام.
  4. المرحلة الأولى التمايز باستخدام البروتوكول 3 (الجدول 1)
    1. النبات 1.5 × 106 mESCs في طبق بكتيري غير التصّاد في 10 مل من التمايز القاعدي المتوسط I. اترك لمدة 2 أيام لتكوين الجسم الجنيني عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 5٪ .
    2. تحقق من تكوين الأجسام الجنينية تحت المجهر (الشكل 2B).
    3. نقل مجاميع الخلية في أنابيب أجهزة الطرد المركزي 15 مل والسماح لهم تسوية من قبل الجاذبية.
    4. إزالة supernatant بعناية وإضافة 10 مل من تمايز القاعدية الطازجة المتوسطة I لإعادة الاعتماد عليها.
    5. بذور حوالي 50 هيئة جنينية في 2 مل من التمايز القاعدي المتوسطة أنا في بئر على 0.1٪ الجيلاتين المغلفة 6-آبار لوحات.
    6. بالنسبة لـ RA التعريفي، أضف 2 ميكرولتر من مخزون RA في كل بئر لجعل التركيز النهائي 1 ميكرومتر.
    7. ضع اللوحة في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية وافرقها لمدة 6 أيام أخرى. تغيير كامل التمايز القاعدي المتوسطة I (مع 1 μM RA) كل 2 أيام.
  5. المرحلة الأولى التمايز باستخدام البروتوكول 4 (الجدول 1)
    1. البذور حول 2 × 104 mESCs داخل 2 مل من التمايز القاعدي المتوسطة أنا في بئر على 0.1٪ الجيلاتين المغلفة 6-آبار لوحات. ضع اللوحة في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية للسماح بالتعلق لمدة 6 ساعات.
    2. بعد التعلق، وغسل الخلايا مرتين مع 2 مل من برنامج تلفزيوني. إضافة 2 مل من التمايز القاعدي المتوسطة I إلى كل بئر والسماح للتمايز لمدة 4 أيام في 5٪ CO2 حاضنة في 37 درجة مئوية.
    3. بالنسبة لـ RA التعريفي، أضف 2 ميكرولتر من مخزون جميع الأسهم العابرة لل RA في كل بئر (تركيز العمل هو 1 ميكرومتر) للحث على التمايز لمدة 4 أيام أخرى.
    4. في العملية برمتها، استبدال المتوسط بأكمله كل 2 أيام.
  6. المرحلة الأولى التمايز باستخدام البروتوكول 5 (الجدول 1)
    1. البذور حول 2 × 104 mESCs داخل 2 مل من التمايز القاعدي المتوسطة أنا في بئر على 0.1٪ الجيلاتين المغلفة 6-آبار لوحات. ضع اللوحة في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية للسماح بالتعلق لمدة 6 ساعات.
    2. غسل الخلايا مرتين مع 2 مل من برنامج تلفزيوني. إضافة 2 مل من التمايز القاعدي المتوسطة I إلى كل بئر والسماح للتمايز لمدة 2 أيام في 5٪ CO2 حاضنة في 37 درجة مئوية.
    3. بالنسبة إلى تحريض RA اللاحق، أضف 2 ميكرولتر من مخزون RA في كل بئر لجعل التركيز النهائي 1 ميكرومتر. ضع اللوحة في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية للحث على التمايز لمدة 6 أيام أخرى.
    4. في العملية برمتها، استبدال المتوسط بأكمله كل 2 أيام.
  7. المرحلة الأولى التمايز باستخدام البروتوكول 6 (الجدول 1)
    1. النبات 1.5 × 106 mESCs في طبق بكتيري غير التصّاد في 10 مل من N2B27 متوسطة II(الجدول 1)للسماح لتكوين الأجسام الجنينية.
    2. في اليومالثاني، جمع مجاميع الخلية كما هو موضح في الخطوات 2.3.2-2.3.3 وإعادة تثبيت الأجسام الجنينية باستخدام 10 مل من N2B27 الطازجة المتوسطة الثانية.
    3. إعادة زرعها في طبق بكتيري جديد غير التصّاد والسماح بالتمايز لمدة يومين آخرين في حاضنة CO2 5٪ عند 37 درجة مئوية. تحقق من تكوين الأجسام الجنينية تحت المجهر.
    4. فياليوم الرابع، اجمع الجثث الجنينية. بذور حوالي 50 أجسام جنينية في كل بئر على 0.1٪ الجيلاتين المغلفة 6-جيدا لوحات مع 2 مل من N2B27 المتوسطة II.
    5. إضافة 2 ميكرولتر من جميع الأسهم عبر RA في كل بئر والحث على التمايز لمدة 4 أيام أخرى. استبدال المتوسط بأكمله (N2B27 متوسطة II مع 1 μM RA) كل يومين.
  8. المرحلة الأولى التمايز باستخدام البروتوكول 7 (الجدول 1)
    1. البذور حول 2 × 104 mESCs داخل 2 مل من التمايز القاعدي المتوسطة أنا في بئر على 0.1٪ الجيلاتين المغلفة 6-آبار لوحات. ضع اللوحة في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية للسماح بالتعلق لمدة 6 ساعات.
    2. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني. ثم، إضافة 2 مل من N2B27 متوسطة II إلى كل بئر والسماح للتمايز لمدة 8 أيام في 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 حاضنة.
    3. تغيير كامل N2B27 متوسطة II كل 2 أيام.

3- رصد مورفولوجيا الخلية

  1. تحقق من حالة التمايز للمجموعات السبع المذكورة أعلاه يوميًا تحت مجهر ضوء مقلوب على الطور.
  2. حدد عشوائيًا 12 حقلًا على الأقل، ثم قم بأخذ صور لتسجيل التغييرات المورفولوجية لكل مجموعة على D8.

4. وصمة المناعة

  1. إعداد العينة: بذور mESCs على 0.1٪ من الأغطية المغلفة بالجيلاتين وتسمح بالتمايز لمدة 8 أيام باستخدام البروتوكولات المذكورة في الخطوة 2.
  2. شطف: في اليومالثامن، خذ العينات من الحاضنة وأزل وسيط التمايز بالطموح. شطف بلطف الخلايا مرة واحدة مع 1 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
  3. التثبيت: إضافة 1 مل من 4٪ شبهformaldehyde لكل عينة وإصلاح الخلايا لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
  4. شطف: بعد التثبيت، شطف بلطف الخلايا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 3 مرات، لمدة 5 دقائق لكل من.
  5. Permeabilization: إضافة 1 مل من 0.2٪ TritonX-100 في برنامج تلفزيوني لكل عينة وترك لمدة 8 دقائق في RT.
  6. شطف: بعد Permeabilization، بلطف شطف الخلايا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 3 مرات، لمدة 5 دقائق لكل من.
  7. حظر: إضافة 1 مل من مصل الماعز 10٪ في برنامج تلفزيوني لكل عينة واحتضان في RT لمدة 1 ساعة لمنع أي تفاعلات غير محددة.
  8. حضانة مع الأجسام المضادة الأولية
    1. تمييع الأجسام المضادة نستين في نسبة 1:100 باستخدام مصل الماعز 5٪ في برنامج تلفزيوني.
    2. تطبيق 500 ميكرولتر من الأجسام المضادة المخففة على عينات مختلفة واحتضان بين عشية وضحاها في 4 °C.
  9. شطف: إزالة الأجسام المضادة وشطف العينات بلطف مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 3 مرات لمدة 8 دقائق لكل من.
  10. حضانة مع الأجسام المضادة الثانوية
    1. تمييع اليكسا فلور 488 المسمى الماعز المضادة للماوس IgG بنسبة 1:500 باستخدام مصل الماعز 5٪ في برنامج تلفزيوني.
    2. تطبيق 500 ميكرولتر من الأجسام المضادة المخففة على عينات مختلفة واحتضان في الظلام لمدة 2 ساعة في RT.
      ملاحظة: بعد تطبيق الأجسام المضادة الثانوية الفلورية، قم بتنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في الظلام لمنع إخماد الفلورسين.
  11. شطف: إزالة الأجسام المضادة الثانوية وشطف العينات بلطف مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 3 مرات لمدة 8 دقائق لكل من.
  12. تلطيخ نووي وتصاعد
    1. ضع قطرة واحدة من DAPI المتوسطة على الميكروسلي نظيفة.
    2. خذ بعناية من العينات من اللوحات ووضع العينة على رأس متوسطة DAPI المتصاعدة مع وجه الخلية إلى الأسفل. اتركيه في الظلام لمدة 5 دقائق في RT.
    3. إزالة الزائدة DAPI تركيب المتوسطة مع ورقة ماصة.
  13. مجهر الفلورس الملاحظة
    1. ضع العينات تحت المجهر الفلوري وكشف الإشارة لDAPI وفلور اليكسا 488 باستخدام المرشحات المناسبة.
    2. بشكلٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍّّيّ وعشوائيّ، اختر 10-15 حقلًا بصريًّا مختلفًا لكلّ عينة، وسجلّ الصور باستخدام كاميرا CCD.

5- التمايز من المراكز الوطنية إلى الخلايا العصبية (المرحلة الثانية)

  1. إعداد مشتقات mESC في إطار المرحلة الأولى من التمايز باستخدام البروتوكول 3 (8 أيام، الجدول 1)كما هو مفصل في الخطوة 2-4، التي لديها أعلى كفاءة للتمايز (انظر الشكل 3).
    ملاحظة: بعد المرحلة الأولى من التمايز، ينبغي أن يتم مراقبة الجودة باستخدام الملاحظة مورفولوجيا الخلية ومجايسة المناعة المذكورة أعلاه، لضمان وجود NPCs صحية وعالية الإنتاجية.
  2. بذور حوالي 5 × 105 مشتقات mESC داخل 2 مل من التمايز القاعدي المتوسطة أنا في بئر على 0.1٪ الجيلاتين المغلفة 6-آبار لوحات. تقسيم مشتقات mESC عشوائياً إلى 3 مجموعات، كما المرحلة الثانية البروتوكول 1، البروتوكول 2، والبروتوكول 3، على التوالي.
  3. ضع اللوحة في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية للسماح بالتعلق لمدة 6 ساعات. غسلها مرتين مع 2 مل من برنامج تلفزيوني.
  4. إضافة 2 مل من التمايز القاعدي المتوسطة I، N2B27 المتوسطة I و N2B27 المتوسطة II(الجدول 2)،على التوالي، إلى كل بئر من الفئات المذكورة أعلاه.
  5. ضع اللوحات في الحاضنة واسمح بالتفريق لمدة 10 أيام أخرى. تغيير الوسط المطابق كل 2 أيام.
  6. تحقق من حالة التمايز وسجل التغييرات المورفولوجية كما هو مذكور في الخطوة 3.
  7. في يوم 18، تقييم جيل الخلايا العصبية (β-توبولين الثالث إيجابية) وتحديد كفاءة التمايز من البروتوكولات 3 باستخدام في الخطوة 4.

النتائج

2-يوم تكوين الجسم الجنينية + 6 أيام RA التعريفي يعمل بشكل أفضل على توجيه التمايز من mESCs إلى NPCs (المرحلة الأولى). ولتحديد البروتوكول الأمثل الذي يعزز على أفضل أحسن ال أحسن الهون بين الـ mESCs إلى NPCs (المرحلة الأولى)، تم اختبار 7 بروتوكولات على كل من A2lox و129 mESCs(الجدول 1)وتم رصد حالة التمايز لك...

Discussion

في هذه الدراسة، أنشأنا طريقة بسيطة وفعالة للتمايز العصبي من mESCs، مع انخفاض تكلفة والمواد التي تم الحصول عليها بسهولة. في هذه الطريقة، 2 أيام من تكوين الجسم الجنينية تليها 6 أيام من تحريض RA يمكن أن تعزز بشكل فعال التفريق بين mESCs إلى NPCs (المرحلة الأولى البروتوكول 3). بالنسبة للمرحلة الثانية من ا...

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية الصينية للعلوم الطبيعية (رقم 31501099) و"متوسط العمر" و"يونغ" من إدارة التعليم في مقاطعة هوبى، الصين (رقم 110099) Q20191104). ونشكر البروفيسور ونشينغ دينغ في جامعة ووهان للعلوم والتكنولوجيا على توفير خطوط الخلايا الجذعية الجنينية الماوس A2lox.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-Nestin antibody [Rat-401]AbcamAb11306stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbitSigma AldrichT2200stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgGBeyotimeA0428stored at -20 °C and protect from light
B-27 Supplement (50X), serum freeGibco17504044stored at -20 °C, and protect from light
CHIR-99021 (CT99021)SelleckS1263stored at -20 °C
CoverslipsNEST801007
Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgGBeyotimeA0516stored at -20 °C and protect from light
DME/F-12 1:1 (1x)HyCloneSH30023.01Bstored at 4 °C
Fetal bovine serumHyCloneSH30084.03stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Fluorescence microscopyOlympusCKX53
GelatinGibcoCM0635Bstored at room temperature
GlutaMAX SupplementGibco35050061stored at 4 °C
Immunol Staining Primary Antibody dilution BufferBeyotimeP0103stored at 4 °C
KnockOut DMEM/F-12Gibco12660012stored at 4 °C
KnockOut Serum ReplacementGibco10828028stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Leukemia Inhibitory Factor humanSigmaL5283stored at -20 °C
Mounting Medium With DAPI - Aqueous, FluoroshieldAbcamab104139stored at 4 °C and protect from light
MEM Non-essential amino acids solutionGibco11140076stored at 4 °C
N-2 Supplement (100X)Gibco17502048stored at -20 °C and protect from light
Normal goat serumJackson005-000-121stored at -20 °C
Neurobasal MediumGibco21103049stored at 4 °C
Nonadhesive bacterial dishCorning3262
Phosphate Buffered Saline (1X)HyCloneSH30256.01Bstored at 4 °C
Penicillin/ Streptomycin SolutionHyCloneSV30010stored at 4 °C
PD0325901(Mirdametinib)SelleckS1036stored at -20 °C
Retinoic acidSigmaR2625stored at -80 °C and protect from light
Strain 129 Mouse Embryonic Stem CellsCyagenMUAES-01001Maintained in feeder-free culture system
Stem-Cellbanker (DMSO free)ZENOAQstem cellbanker DMSO freestored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Trypsin 0.25% (1X) SolutionHyCloneSH30042.01stored at 4 °C
Triton X-100SigmaT8787
2-MercaptoethanolGibco21985023stored at 4 °C and protect from light
4% paraformaldehydeBeyotimeP0098stored at -20 °C
6 - well plateCorning3516
60 mm cell culture dishCorning430166
15 ml centrifuge tubeNUNC339650

References

  1. Vieira, M. S., et al. Neural stem cell differentiation into mature neurons: mechanisms of regulation and biotechnological applications. Biotechnology Advances. 36 (7), 1946-1970 (2018).
  2. Yang, J. R., Lin, Y. T., Liao, C. H. Application of embryonic stem cells on Parkinson's disease therapy. Genomic Medicine, Biomarkers, and Health Sciences. 3 (1), 17-26 (2011).
  3. Liu, C., Zhong, Y. W., Apostolou, A., Fang, S. Y. Neural differentiation of human embryonic stem cells as an in vitro tool for the study of the expression patterns of the neuronal cytoskeleton during neurogenesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 439 (1), 154-159 (2013).
  4. Khramtsova, E. A., Mezhevikina, L. M., Fesenko, E. E. Proliferation and differentiation of mouse embryonic stem cells modified by the Neural Growth Factor (NGF) gene. Biology Bulletin. 45 (3), 219-225 (2018).
  5. Yoshimatsu, S., et al. Evaluating the efficacy of small molecules for neural differentiation of common marmoset ESCs and iPSCs. Neuroscience research. , (2019).
  6. Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. 3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages. Biomaterials. 34, 5995-6007 (2013).
  7. Gazina, E. V., et al. Method of derivation and differentiation of mouse embryonic stem cells generating synchronous neuronal networks. Journal of Neuroscience Methods. 293, 53-58 (2018).
  8. Ohnuki, Y., Kurosawa, H. Effects of hanging drop culture conditions on embryoid body formation and neuronal cell differentiation using mouse embryonic stem cells: Optimization of culture conditions for the formation of well-controlled embryoid bodies. Journal of Bioscience and Bioengineering. 115 (5), 571-574 (2013).
  9. Wongpaiboonwattana, W., Stavridis, M. P. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells in serum-free monolayer culture. Journal of Visualized experiments. (99), e52823 (2015).
  10. Li, Y., et al. An optimized method for neuronal differentiation of embryonic stem cells in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 330 (15), 108486 (2020).
  11. Zhou, P., et al. Investigation of the optimal suspension culture time for the osteoblastic differentiation of human induced pluripotent stem cells using the embryoid body method. Biochemical and Biophysical Research Communications. 515 (4), 586-592 (2019).
  12. Lu, J. F., et al. All-trans retinoic acid promotes neural lineage entry by pluripotent embryonic stem cells via multiple pathways. BMC Cell Biology. 10, 57 (2009).
  13. Kanungo, J. Retinoic acid signaling in P19 stem cell differentiation. Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 17 (9), 1184-1198 (2017).
  14. Rochette-Egly, C. Retinoic acid signaling and mouse embryonic stem cell differentiation: Cross talk between genomic and non-genomic effects of RA. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1851 (1), 66-75 (2015).
  15. Wang, R., et al. Retinoic acid maintains self-renewal of murine embryonic stem cells via a feedback mechanism. Differentiation. 76 (9), 931-945 (2008).
  16. Wu, H. B., et al. Retinoic acid-induced upregulation of miR-219 promotes the differentiation of embryonic stem cells into neural cells. Cell Death Disease. 8, 2953 (2017).
  17. Chen, W., et al. Retinoic acid regulates germ cell differentiation in mouse embryonic stem cells through a Smad-dependent pathway. Biochemical and Biophysical Research Communications. 418 (3), 571-577 (2012).
  18. Nakayama, Y., et al. A rapid and efficient method for neuronal induction of the P19 embryonic carcinoma cell line. Journal of Neuroscience Methods. 227, 100-106 (2014).
  19. Bibel, M., et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nature neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).
  20. Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons. PLoS ONE. 6 (1), 16174 (2011).
  21. Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Developmental Biology. 275, 124-142 (2004).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

160 N2B27

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved