インビトロにおけるマウス胚性幹細胞からの神経細胞分化

要約

ここでは、低コストで使いやすい方法を確立し、胚性幹細胞からニューロンへの迅速かつ効率的な分化を導く方法を確立しました。この方法は、研究室間で普及に適しており、神経学的研究のための有用なツールとなり得る。

要約

マウス胚性幹細胞(mESC)の神経分化は、神経新生に関与する重要なメカニズムを解明し、再生医療に役立つ可能性のあるツールです。ここでは、組み合わせスクリーニングの戦略を用いて、 インビトロでのmESCからのニューロン分化のための効率的かつ低コストの方法を確立しました。ここで定義された条件の下で、2日間の胚体形成+6日間のレチノイン酸誘導プロトコルは、ネスチン陽性であるよく積み重ねられ、神経突起のようなA2loxおよび129誘導体の形成によって見られるように、mESCから神経前駆細胞(NPC)への迅速かつ効率的な分化を可能にする。胚体の健全な状態とレチノイン酸(RA)が適用される時点は、RA濃度と同様に、その過程で重要である。NPCからニューロンへのその後の分化において、N2B27培地II(神経基底培地によって補完される)は、神経細胞の長期的な維持および成熟をよりよく支えることができる。提示された方法は、高効率、低コスト、操作が容易であり、神経生物学や発生生物学の研究のための強力なツールとなり得る。

概要

胚性幹細胞(ESC)は多能性であり、神経前駆細胞(NPC)に分化し、その後、特定の条件下でニューロンに分化することができる^1。ESCベースの神経新生は、神経新生を模倣するための最良のプラットフォームを提供し、したがって、発生生物学研究のための有用なツールとして機能し、潜在的に再生医療^2、3を支援する。過去数十年の間に、トランスジェニック法⁴のような胚性神経新生を誘導するための多くの戦略が報告されている、小分子⁵を用いて、3Dマトリックス微小環境⁶を用いて、および共培養技術⁷を用いた。しかし、これらのプロトコルのほとんどは、条件が制限されているか、操作が困難であるため、ほとんどの研究室での使用には適していません。

mESCからの効率的な神経分化を達成するために、操作が容易で低コストの方法を見つけるために、ここで組み合わせスクリーニング戦略を使用しました。図1に記載されているように、胚性神経新生の全過程を2相に分けた。フェーズIはmESCからNPCへの分化プロセスを指し、第II相はNPCからニューロンへのその後の分化に関連する。容易な操作、低コスト、容易に利用できる材料および高い分化効率の原則に基づいて、フェーズIの7つのプロトコルおよびフェーズIIの3つのプロトコルは、伝統的な付着単層培養システムまたは胚体形成システム^8、9に基づいて選択された。両相におけるプロトコルの分化効率を、細胞形態観察および免疫蛍光アッセイを用いて評価した。各フェーズの最も効率的なプロトコルを組み合わせることで、mESCからの神経分化のための最適化された方法を確立しました。

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プロトコル

1. マウス胚性幹細胞培養

1. 0.1%ゼラチンコーティングされた細胞培養皿またはプレートを準備します。
   1. 滅菌した0.1%のゼラチン(水中0.1%w/v)を60mm細胞培養皿に2mL加えます。細胞培養皿のコーティングを確実にするために、穏やかにロックします。
   2. 37°Cで5%CO2インキュベーターに皿を入れ、1時間コーティングを行います。
   3. 細胞を播種する前に0.1%ゼラチン溶液を取り除きます。
      注:ゼラチンを取り除いた後、コーティングされた皿を乾燥または洗浄する必要はありません。
2. マウス胚性幹細胞(A2loxおよび129)培養
   1. 0.1%のゼラチン中のインキュベートメベック(A2loxおよび129)細胞は、それぞれ5%CO2インキュベーターで37°CのmESC成長培地で60mmの細胞培養皿をコーティングした。MESC成長培地は、85%ノックアウトDMEM/F12、15%ノックアウト血清置換(KSR)、0.1 mM βメルカプトエタノール(2ME)、2 mMグルタマックス、2 mMグルタマックスで構成されています。 1%非必須アミノ酸(NEAA)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)、1000 U/mL白血病阻害因子(LIF)、10 nM CHIR-99021(GSK-3阻害剤)および0.33 nM PD0325901(MEK阻害剤)。
      注意:β-メルカプトエタノールは可燃性であり、吸入毒性を有する。火災源から離れ、使用時の吸入を避けるためにマスクを着用してください。
   2. A2loxおよび129のより良い成長のために毎日mESC成長培地を変更してください。
   3. 細胞が80%合流に達したら、培地を取り除き、0.1%のトリプシンを1 mL加えます。すべての細胞にトリプシンのカバーを確実にするために30 sのために穏やかに揺れる。
   4. トリプシンを化し、1 mLピペットを使用してトリプシンを除去するために約1分間細胞を残します。
   5. 2 mLのmESC成長培地を皿に加え、ピペットを数回上下に加えて、単一の細胞懸濁液を作ります。
   6. ヘモサイトメーターを使用して、懸濁液中の細胞の密度をできるだけ正確にカウントします。
   7. セルを7つのグループに分け、 表1に示す異なるプロトコルを使用して分化を誘導する。

2. mESC から NPC への分化 (フェーズ I)

1. 0.1%ゼラチンコーティングされた細胞培養プレートまたはカバーリップを調製します。
   1. 使用前に、ステップ1.1のように0.1%ゼラチンコーティング6ウェルプレートまたはカバーリップを調製します。
2. プロトコル 1 を使用したフェーズ I の分化 (表 1)
   1. 0.1%ゼラチンコーティング6ウェルプレートの1ウェルあたり2 mLの基底分化培地Iで約2 x 10⁴ mESCsをシード。顕微鏡で細胞密度を確認します。
   2. 5%CO2インキュベーターで37°Cの細胞を6時間インキュベーターでインキュベートし、取り付けができるようにします。
   3. 付着後、培養器から細胞を取り出し、2mLのPBSで細胞を2回洗浄する。
   4. 各ウェルに2mLの基底分化培地I(表1)を加え、細胞をインキュベーターに戻します。
   5. 8日間分化のために細胞を残します。2日ごとに基礎分化培地Iを交換してください。
3. プロトコル 2 を使用したフェーズ I の分化 (表 1)
   1. 1.5 x 10⁶ mESCsを10 mLの基底分化培地Iの非粘着性細菌皿に加え、5%CO2インキュベーターで37°Cで胚体形成を可能にする。
   2. 2日後、細胞凝集体を15 mL遠心管に移し、重力で落ち着かせる。
   3. 上清を取り除き、10mLの新鮮な基底分化培地Iを加え、胚体を再懸濁させる。新しい非粘着性細菌皿にそれらを植え替え、さらに2日間分化を可能にする。
   4. 顕微鏡下での胚体の形成を確認する(図2A)。
   5. ステップ 2.3.2-2.3.3 で説明されているように、胚体を収集します。2 mLの基底分化培地で約50個の胚体を0.1%ゼラチンコーティング6ウェルプレートに播種する。
   6. 1 mMオールトランスRAストック(DMSO)を準備し、サブパッケージング後に-80°Cの冷凍庫で光から離れて保管します。
      注意:RAは不安定であり、RAストックの準備中に光から遠ざけ、空気接触を減らすことに注意する必要があります。
   7. RA誘導の場合は、各ウェルに2μLのRAストックを加えて、1μMの最終濃度を作ります。
   8. プレートを37°Cの_5%CO2 インキュベーターに入れ、さらに4日間分化します。
   9. 2日ごとに、基底分化培地I(1μM RA)全体を2 mL変更します。
4. プロトコル 3 を使用したフェーズ I の分化 (表 1)
   1. 10 mLの基底分化培地I.の非粘着性細菌皿に1.5 x 10⁶ mESCsを植え付け、5%CO2インキュベーターで37°Cで胚体形成のために2日間放置します。
   2. 顕微鏡下での胚体の形成を確認する(図2B)。
   3. 細胞凝集体を15 mL遠心管に移し、重力で落ち着かせる。
   4. 上清を慎重に取り出し、10mLの新鮮な基底分化培地を加え、再中断します。
   5. 約50個の胚体を2mLの基底分化培地に播種し、0.1%ゼラチンコーティングされた6ウェルプレート上に十分に塗布した。
   6. RA誘導の場合は、各ウェルに2μLのRAストックを加えて、1μMの最終濃度を作ります。
   7. プレートを37°Cの_5%CO2 インキュベーターに入れ、さらに6日間分化します。2日ごとに基礎分化培地I(1μM RA)全体を変更します。
5. プロトコル 4 を使用したフェーズ I の分化 (表 1)
   1. シード約 2 x 10⁴ mESCs 基礎分化培地の 2 mL 内で 0.1% ゼラチンコーティング 6 ウェルプレートにウェルあたり.プレートを37°Cの_5%CO2 インキュベーターに入れ、6時間取り付けます。
   2. 取り付け後、2 mLのPBSで細胞を2回洗浄します。各ウェルに2mLの基底分化培地Iを加え、37°Cの5%CO2インキュベーターで4日間分化を可能にする。
   3. RA誘導の場合、2μLの全トランスRAストックを各ウェル(作業濃度は1μM)に加えて、さらに4日間分化を誘導します。
   4. 全体のプロセスでは、2日ごとに媒体全体を交換してください。
6. プロトコル 5 を使用したフェーズ I の分化 (表 1)
   1. シード約 2 x 10⁴ mESCs 基礎分化培地の 2 mL 内で 0.1% ゼラチンコーティング 6 ウェルプレートにウェルあたり.プレートを37°Cの_5%CO2 インキュベーターに入れ、6時間取り付けます。
   2. 2 mLのPBSで細胞を2回洗います。各ウェルに2mLの基底分化培地Iを加え、37°Cの5%CO2インキュベーターで2日間分化を可能にする。
   3. その後のRA誘導では、各ウェルに2μLのRAストックを加えて1μMの最終濃度を作り、プレートを37°Cの_5%CO2 インキュベーターに入れ、さらに6日間分化を誘発します。
   4. 全体のプロセスでは、2日ごとに媒体全体を交換してください。
7. プロトコル 6 を使用したフェーズ I の分化 (表 1)
   1. N2B27培地IIの10mLに非粘着性細菌皿に1.5 x 10 6 mESCsを植物1.5 x 10⁶ mESC(表1)胚体形成を可能にする。
   2. 2^日目 に、ステップ2.3.2-2.3.3に記載されているように細胞凝集体を収集し、新鮮なN2B27培地IIの10 mLを使用して胚体を再中断する。
   3. それらを新しい非粘着性の細菌皿に再植え、37°Cの5%CO2インキュベーターでさらに2日間分化を可能にする。 顕微鏡下で胚体の形成を確認してください。
   4. 4^日目 に、胚の体を収集します。種子は、N2B27培地IIの2 mLで0.1%ゼラチンコーティング6ウェルプレート上にウェルあたり約50胚体。
   5. 各ウェルに2μLの全トランスRAストックを加え、さらに4日間分化を誘導します。2日ごとに媒体全体(N2B27培地IIを1μM RA)に交換してください。
8. プロトコル 7 を使用したフェーズ I の分化 (表 1)
   1. シード約 2 x 10⁴ mESCs 基礎分化培地の 2 mL 内で 0.1% ゼラチンコーティング 6 ウェルプレートにウェルあたり.プレートを37°Cの_5%CO2 インキュベーターに入れ、6時間取り付けます。
   2. PBSで細胞を2回洗います。次いで、各ウェルに2mLのN2B27培地IIを加え、5%CO2インキュベーターで37°Cで8日間分化を可能にする。
   3. N2B27培地II全体を2日ごとに変更します。

3. 細胞形態観察

1. 反転位相コントラスト光顕微鏡下で、上記7群の分化状況を毎日確認する。
2. ランダムに少なくとも12のフィールドを選択し、D8上の各グループの形態変化を記録するために写真を撮ります。

4. 免疫蛍光染色

1. サンプル調製:0.1%ゼラチンコーティングカバーリップにmESCsをシードし、ステップ2で述べたプロトコルを使用して8日間分化を可能にします。
2. すいす:8^日目 に、培養器からサンプルを取り出し、吸引によって分化培地を取り除きます。1 mLのPBSで細胞を5分間穏やかにすすいだ。
3. 固定:各サンプルに4%パラホルムアルデヒドの1 mLを加え、室温(RT)で20分間細胞を固定します。
4. すすい: 固定後、1 mLのPBSで細胞を3回、それぞれ5分間静かにすすいだ。
5. 透過:各サンプルにPBSに0.2%TritonX-100の1 mLを加え、RTで8分間放置します。
6. すすい: 透過後、1 mLのPBSで細胞を3回、それぞれ5分間静かにすすいだ。
7. ブロッキング:各サンプルにPBSに10%のヤギ血清1mLを加え、RTで1時間インキュベートして非特異的な相互作用を遮断します。
8. 一次抗体によるインキュベーション
   1. PBSで5%のヤギ血清を使用して、抗ネスチン抗体を1:100の比率で希釈します。
   2. 希釈した抗体を500μL異なるサンプルに塗布し、4°Cで一晩インキュベートします。
9. すいす: 抗体を取り除き、1 mLのPBSを3回ずつ8分間静かにすすいます。
10. 二次抗体によるインキュベーション
    1. PBSで5%のヤギ血清を使用して1:500の比率でアレクサフルオール488標識ヤギ抗マウスIgGを希釈します。
    2. 希釈した抗体を500 μL異なるサンプルに塗布し、RTで2時間暗くインキュベートします。
       注:蛍光二次抗体を適用した後、暗闇の中ですべての後続のステップを実行して、蛍光消光を防ぎます。
11. すいす: 二次抗体を取り出し、1 mLのPBSをそれぞれ8分間3回静かにすすいます。
12. 核染色および実装
    1. DAPI取り付け媒体を1滴ずつクリーンなマイクロスライドに置きます。
    2. プレートからサンプルを慎重に取り出し、セルを下にしてDAPI取り付け媒体の上にサンプルを置きます。RTで5分間暗闇の中に置いておきます。
    3. 吸収性紙で余分なDAPI取り付け媒体を取り除きます。
13. 蛍光顕微鏡観察
    1. 蛍光顕微鏡下に標本を置き、適切なフィルターを使用してDAPIおよびAlexa Fluor 488の信号を検出します。
    2. 各サンプルに対して 10 ~ 15 種類の異なるビジュアル フィールドを均等に選択し、CCD カメラで画像を記録します。

5. NPCからニューロンへの分化(第II相)

1. 最も高い分化効率を持つステップ2.4で詳述されているように、プロトコル3(8日間、 表1)を使用してフェーズIの分化の下でmESC誘導体を準備する( 図3を参照)。
   注:フェーズIの分化後、健康で高収率のNPCを確保するために、上記の細胞形態観察および免疫蛍光アッセイを使用して品質管理を行う必要があります。
2. 種子約5 x 10⁵ mESC誘導体を、0.1%ゼラチンコーティング6ウェルプレート上に十分に当たり基礎分化培地Iの2 mL以内に含む。mESC誘導体を、それぞれフェーズIIプロトコル1、プロトコル2、プロトコル3として3つのグループにランダムに分割する。
3. プレートを37°Cの_5%CO2 インキュベーターに入れ、6時間取り付けます。2 mLのPBSで2回洗います。
4. 2 mLの基底分化培地I,N2B27培地I及びN2B27培地II(表2)をそれぞれ、上記群の各ウェルに加える。
5. プレートをインキュベーターに入れ、さらに10日間分化します。対応する媒体を2日ごとに変更します。
6. 分化の状態を確認し、手順 3 で述べたように形態学的変化を記録します。
7. 18日目に、ニューロンの生成(β-tubulin III陽性)を評価し、ステップ4で使用する3つのプロトコルの分化効率を決定する。

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結果

2日間の胚体形成+ 6日間のRA誘導は、MESCのNPCへの分化(フェーズI)を導くのに最適です。MESCsのNPCへの分化を最も促進する最適なプロトコル(フェーズI)を決定するために、A2loxと129 mESCsの両方で7つのプロトコルをテストし、各群の分化状況を光顕微鏡で監視した。 図3Aに示すように、ほとんどのA2loxおよび129誘導体は「2日間の胚体形成+6日間のRA誘導」処置(フェ...

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ディスカッション

本研究では、低コストで容易に得られる物質を用いて、mESCからの神経細胞分化の簡便かつ効果的な方法を確立した。この方法では、2日間の胚体形成後に6日間のRA誘導が行われ、MESCsのNPCへの分化を効果的に促進することができる(フェーズI-プロトコル3)。第II相分化のために、N2B27培地II(フェーズII-プロトコル3)は、NPCからニューロンへの分化を最も効果的に誘導する。成功を確実にするため?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Nestin antibody [Rat-401]	Abcam	Ab11306	stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit	Sigma Aldrich	T2200	stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG	Beyotime	A0428	stored at -20 °C and protect from light
B-27 Supplement (50X), serum free	Gibco	17504044	stored at -20 °C, and protect from light
CHIR-99021 (CT99021)	Selleck	S1263	stored at -20 °C
Coverslips	NEST	801007
Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG	Beyotime	A0516	stored at -20 °C and protect from light
DME/F-12 1:1 (1x)	HyClone	SH30023.01B	stored at 4 °C
Fetal bovine serum	HyClone	SH30084.03	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Fluorescence microscopy	Olympus	CKX53
Gelatin	Gibco	CM0635B	stored at room temperature
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	stored at 4 °C
Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer	Beyotime	P0103	stored at 4 °C
KnockOut DMEM/F-12	Gibco	12660012	stored at 4 °C
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828028	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Leukemia Inhibitory Factor human	Sigma	L5283	stored at -20 °C
Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield	Abcam	ab104139	stored at 4 °C and protect from light
MEM Non-essential amino acids solution	Gibco	11140076	stored at 4 °C
N-2 Supplement (100X)	Gibco	17502048	stored at -20 °C and protect from light
Normal goat serum	Jackson	005-000-121	stored at -20 °C
Neurobasal Medium	Gibco	21103049	stored at 4 °C
Nonadhesive bacterial dish	Corning	3262
Phosphate Buffered Saline (1X)	HyClone	SH30256.01B	stored at 4 °C
Penicillin/ Streptomycin Solution	HyClone	SV30010	stored at 4 °C
PD0325901(Mirdametinib)	Selleck	S1036	stored at -20 °C
Retinoic acid	Sigma	R2625	stored at -80 °C and protect from light
Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells	Cyagen	MUAES-01001	Maintained in feeder-free culture system
Stem-Cellbanker (DMSO free)	ZENOAQ	stem cellbanker DMSO free	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Trypsin 0.25% (1X) Solution	HyClone	SH30042.01	stored at 4 °C
Triton X-100	Sigma	T8787
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023	stored at 4 °C and protect from light
4% paraformaldehyde	Beyotime	P0098	stored at -20 °C
6 - well plate	Corning	3516
60 mm cell culture dish	Corning	430166
15 ml centrifuge tube	NUNC	339650