Diferenciación neuronal de las células madre embrionarias del ratón in vitro

Resumen

Aquí, establecimos un método de bajo costo y fácil de operar que dirige la diferenciación rápida y eficiente de las células madre embrionarias a las neuronas. Este método es adecuado para la popularización entre laboratorios y puede ser una herramienta útil para la investigación neurológica.

Resumen

La diferenciación neuronal de las células madre embrionarias del ratón (MESC) es una herramienta potencial para dilucidar los mecanismos clave implicados en la neurogénesis y potencialmente ayudar en la medicina regenerativa. Aquí, establecimos un método eficiente y de bajo costo para la diferenciación neuronal de los MESC invitro, utilizando la estrategia de cribado combinatorio. En las condiciones definidas aquí, la formación de cuerpos embrionados de 2 días + protocolo de inducción de ácido retinoico de 6 días permite una diferenciación rápida y eficiente de los mESC en células precursoras neuronales (NPC), como lo ve la formación de A2lox bien apilado y similar a un neurite y 129 derivados que son nestin positivos. El estado saludable de los cuerpos embrionarios y el punto de tiempo en el que se aplica el ácido retinoico (AR), así como las concentraciones de AR, son críticos en el proceso. En la diferenciación posterior de los PNJ en las neuronas, N2B27 medio II (complementado por medio neurobasal) podría apoyar mejor el mantenimiento a largo plazo y la maduración de las células neuronales. El método presentado es altamente eficiente, de bajo costo y fácil de operar, y puede ser una poderosa herramienta para la neurobiología y la investigación en biología del desarrollo.

Introducción

Las células madre embrionarias (ESC) son pluripotentes y pueden diferenciarse en células precursoras neuronales (NPC) y posteriormente en neuronas bajo ciertas condiciones^1. La neurogénesis basada en ESC proporciona la mejor plataforma para imitar la neurogénesis, sirviendo así como una herramienta útil para estudios de biología del desarrollo y potencialmente ayuda en medicina regenerativa^2,3. En las últimas décadas, muchas estrategias se han divulgado para inducir neurogénesis embrionaria, como el método transgénico^4,utilizando moléculas pequeñas^5,utilizando una matriz 3D microambiente^6,y la técnica de co-cultivo^7. Sin embargo, la mayoría de estos protocolos son condicionantes o difíciles de operar, por lo que no son adecuados para su uso en la mayoría de los laboratorios.

Para encontrar un método fácil de operar y de bajo costo para lograr una diferenciación neuronal eficiente de los mESC, aquí se utilizó una estrategia de cribado combinatoria. Como se describe en la Figura 1,todo el proceso de neurogénesis embrionaria se dividió en 2 fases. La Fase I se refiere al proceso de diferenciación de los MESC a los PNJ, y la fase II se relaciona con la diferenciación posterior de los PNJ en las neuronas. Sobre la base de los principios de fácil operación, bajo costo, materiales fácilmente disponibles y alta eficiencia de diferenciación, se eligieron siete protocolos en la Fase I y tres protocolos en la Fase II basados en el sistema tradicional de cultivo monocapa adherente o sistema de formación de cuerpos embrionados^8,9. La eficiencia de diferenciación de los protocolos en ambas fases se evaluó utilizando la observación de morfología celular y el ensayo de inmunofluorescencia. Mediante la combinación del protocolo más eficiente de cada fase, establecimos el método optimizado para la diferenciación neuronal de los mESC.

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Protocolo

1. Cultivo de células madre embrionarias del ratón

1. Prepare platos o platos de cultivo celular recubiertos de gelatina al 0,1%.
   1. Añadir 2 ml de gelatina esterilizada del 0,1% (0,1% w/v en agua) a platos de cultivo celular de 60 mm. Rockear suavemente para asegurar incluso el recubrimiento de los platos de cultivo celular.
   2. Coloque los platos en una incubadora de CO₂ al 5% a 37 °C y deje el recubrimiento durante 1 h.
   3. Retire la solución de gelatina del 0,1% antes de sembrar las células.
      NOTA: Después de retirar la gelatina, no es necesario secar o lavar los platos recubiertos.
2. Cultivo de células madre embrionarias del ratón (A2lox y 129)
   1. Incubar células mESC (A2lox y 129) en el 0,1% de gelatina recubierta de 60 mm de platos de cultivo celular en medio de crecimiento mESC a 37 °C en una incubadora de CO₂ del 5%, respectivamente. El medio de crecimiento del mESC consiste en un 85% de eliminación dmem/F12, 15% reemplazo sérico knock-out (KSR), 0,1 mM β-mercaptoetanol (2ME), 2 mM GlutaMAX, 1% aminoácido no esencial (NEAA), 1% penicilina/estreptomicina (P/S), 1000 factor inhibitorio de leucemia U/mL (LIF), 10 nM CHIR-99021 (inhibidor de GSK-3) y 0,33 nM PD0325901 (inhibidor de MEK).
      PRECAUCIÓN: β-mercaptoetanol es inflamable y tiene toxicidad por inhalación. Manténgase alejado de las fuentes de fuego y use una máscara para evitar la inhalación cuando se utilice.
   2. Cambie el medio de crecimiento del MESC diariamente para un mejor crecimiento de A2lox y 129.
   3. Cuando las células alcancen el 80% de confluencia, retire el medio y agregue 1 ml de 0,1% de trippsina al plato. Mezcle suavemente durante 30 s para asegurar una cobertura uniforme de trypsina en todas las células.
   4. Deje las celdas durante aproximadamente 1 minuto para probar eltamaño de la triptina y luego retire la trippsina usando pipeta de 1 ml.
   5. Añadir 2 ml de medio de crecimiento mESC al plato, pipeta arriba y abajo varias veces para hacer una sola suspensión celular.
   6. Contar la densidad de las células en la suspensión con la mayor precisión posible utilizando hemociclo.
   7. Divida las células en 7 grupos e induzca la diferenciación utilizando diferentes protocolos que se muestran en la Tabla 1.

2. Diferenciación de mESC a PNJ (Fase I)

1. Prepare placas de cultivo celular recubiertas de gelatina al 0,1% o cubre manchas.
   1. Antes de su uso, prepare 0.1% de placas de gelatina recubiertas de 6 pozos o cubrecubres como en el paso 1.1.
2. Diferenciación de fase I mediante el protocolo 1 (Tabla 1)
   1. Semillas de aproximadamente 2 x 10⁴ mESC en 2 ml de medio de diferenciación basal I por pozo en las placas de 6 pozos recubiertas de gelatina al 0,1%. Compruebe la densidad celular bajo un microscopio.
   2. Incubar las células a 37 °C en una incubadora de CO₂ al 5% durante 6 h para permitir el apego.
   3. Después del apego, saque de las células de la incubadora y lave las células dos veces con 2 ml de PBS.
   4. Agregue 2 ml de medio de diferenciación basal I(Tabla 1)a cada pozo y vuelva a colocar las células en la incubadora.
   5. Deje las células para la diferenciación durante 8 días. Reemplace el medio de diferenciación basal I cada 2 días.
3. Diferenciación de fase I mediante el protocolo 2 (Tabla 1)
   1. Añadir 1,5 x 10⁶ mESC en un plato bacteriano nodhesivo en 10 ml de medio de diferenciación basal I para permitir la formación de cuerpos embrionados a 37 °C en una incubadora de CO₂ del 5%.
   2. Después de 2 días, transfiera los agregados celulares a 15 tubos centrífugas de ml y déjelos establecer por gravedad.
   3. Retire el sobrenadante y agregue 10 ml de medio de diferenciación basal fresco I para resuspend los cuerpos embrionados. Replantarlos en un nuevo plato bacteriano nodhesivo y permitir la diferenciación durante otros 2 días.
   4. Compruebe la formación de cuerpos embrionarios bajo el microscopio (Figura 2A).
   5. Recoger cuerpos embrionarios como se describe en los pasos 2.3.2-2.3.3. Semillas alrededor de 50 cuerpos embrionarios en 2 ml de medio de diferenciación basal I por pozo en placas de 6 pozos recubiertas de gelatina del 0,1%.
   6. Prepare 1 mM de caldo ra totalmente trans (en DMSO) y guárdelo lejos de la luz en un congelador de -80 °C después del subenvasado.
      NOTA: La AR es inestable, y se debe prestar atención a mantenerla alejada de la luz y reducir el contacto con el aire durante la preparación del caldo de RA.
   7. Para la inducción de AR, agregue 2 μL de caldo de AR en cada pozo para hacer una concentración final de 1 μM.
   8. Coloque la placa en la incubadora de CO₂ al 5% a 37 °C y diferencie durante otros 4 días.
   9. Cambie los 2 ml enteros del medio de diferenciación basal I (con 1 μM RA) cada 2 días.
4. Diferenciación de fase I mediante el protocolo 3 (Tabla 1)
   1. Plantar 1,5 x 10⁶ mESC en un plato bacteriano nodhesivo en 10 ml de medio de diferenciación basal I. Dejar durante 2 días para la formación de cuerpos embrionados a 37 °C en una incubadora de CO_{2 del} 5%.
   2. Compruebe la formación de cuerpos embrionarios bajo un microscopio(Figura 2B).
   3. Transfiera los agregados celulares a tubos centrífugas de 15 ml y déjelos establecer por gravedad.
   4. Retire el sobrenadante cuidadosamente y agregue 10 ml de medio de diferenciación basal fresco I para volver a usarlos.
   5. Sembrar alrededor de 50 cuerpos embrionarios en 2 ml de medio de diferenciación basal I por pozo en placas de 6 pozos recubiertas de gelatina al 0,1%.
   6. Para la inducción de AR, agregue 2 μL de caldo de AR en cada pozo para hacer una concentración final de 1 μM.
   7. Coloque la placa en la incubadora de CO₂ al 5% a 37 °C y diferencie durante otros 6 días. Cambie todo el medio de diferenciación basal I (con 1 μM RA) cada 2 días.
5. Diferenciación de fase I mediante el protocolo 4 (Tabla 1)
   1. Semillas de aproximadamente 2 x 10⁴ mESC dentro de 2 ml de medio de diferenciación basal I por pozo en las placas de 6 pozos recubiertas de gelatina al 0,1%. Coloque la placa en la incubadora de CO₂ al 5% a 37 °C para permitir la fijación durante 6 h.
   2. Después de la fijación, lave las células dos veces con 2 ml de PBS. Añadir 2 ml de medio de diferenciación basal I a cada pozo y permitir la diferenciación durante 4 días en la incubadora de CO₂ del 5% a 37 °C.
   3. Para la inducción por AR, añadir 2 μL de caldo de AR trans en cada pozo (la concentración de trabajo es de 1 μM) para inducir la diferenciación durante otros 4 días.
   4. En todo el proceso, reemplace todo el medio cada 2 días.
6. Diferenciación de fase I mediante el protocolo 5 (Tabla 1)
   1. Semillas de aproximadamente 2 x 10⁴ mESC dentro de 2 ml de medio de diferenciación basal I por pozo en las placas de 6 pozos recubiertas de gelatina al 0,1%. Coloque la placa en la incubadora de CO₂ al 5% a 37 °C para permitir la fijación durante 6 h.
   2. Lave las células dos veces con 2 ml de PBS. Añadir 2 ml de medio de diferenciación basal I a cada pozo y permitir la diferenciación durante 2 días en la incubadora de CO₂ al 5% a 37 °C.
   3. Para la posterior inducción de AR, añadir 2 μL de caldo de AR en cada pozo para hacer una concentración final de 1 μM. Coloque la placa en la incubadora de CO₂ al 5% a 37 °C para inducir la diferenciación durante otros 6 días.
   4. En todo el proceso, reemplace todo el medio cada 2 días.
7. Diferenciación de fase I mediante el protocolo 6 (Tabla 1)
   1. Plantar 1,5 x 10⁶ mESC en un plato bacteriano nodhesivo en 10 ml de N2B27 medio II(Tabla 1)para permitir la formación de cuerpos embrionarios.
   2. El^día 2, recoja los agregados celulares como se describe en los pasos 2.3.2-2.3.3 y resuspend los cuerpos embrionarios usando 10 ml de N2B27 medio II fresco.
   3. Replantarlos en un nuevo plato bacteriano nodhesivo y permitir la diferenciación durante otros 2 días en la incubadora de CO₂ al 5% a 37 °C. Compruebe la formación de cuerpos embrionarios bajo microscopio.
   4. El día^4, recoge cuerpos embrionarios. Sembrar alrededor de 50 cuerpos embrionarios por pozo en placas de 6 pozos recubiertas de gelatina del 0,1% con 2 ml de N2B27 medio II.
   5. Añadir 2 μL de caldo de AR totalmente trans en cada pozo e inducir la diferenciación durante otros 4 días. Reemplace todo el medio (N2B27 medio II por 1 μM RA) cada dos días.
8. Diferenciación de fase I mediante el protocolo 7 (Tabla 1)
   1. Semillas de aproximadamente 2 x 10⁴ mESC dentro de 2 ml de medio de diferenciación basal I por pozo en las placas de 6 pozos recubiertas de gelatina al 0,1%. Coloque la placa en la incubadora de CO₂ al 5% a 37 °C para permitir la fijación durante 6 h.
   2. Lave las células dos veces con PBS. A continuación, añadir 2 ml de N2B27 medio II a cada pozo y permitir la diferenciación durante 8 días a 37 °C en una incubadora de CO_{2 del} 5%.
   3. Cambie todo el medio N2B27 II cada 2 días.

3. Observación morfológica celular

1. Compruebe el estado de diferenciación de los 7 grupos mencionados anteriormente diariamente bajo un microscopio de luz de contraste de fase invertido.
2. Seleccione aleatoriamente al menos 12 campos y tome fotos para registrar los cambios morfológicos de cada grupo en D8.

4. Tinción de inmunofluorescencia

1. Preparación de la muestra: Plecciones de semillas en 0.1% coverslips recubiertos de gelatina y permiten la diferenciación durante 8 días utilizando los protocolos mencionados en el paso 2.
2. Enjuague: El día^8, saque las muestras de la incubadora y retire el medio de diferenciación por aspiración. Enjuague suavemente las células una vez con 1 ml de PBS durante 5 minutos.
3. Fijación: Agregue 1 ml de paraformaldehído al 4% a cada muestra y fije las celdas durante 20 minutos a temperatura ambiente (RT).
4. Enjuague: Después de la fijación, enjuague suavemente las células con 1 ml de PBS 3 veces, durante 5 minutos cada una.
5. Permeabilización: Añadir 1 ml de 0.2% TritonX-100 en PBS a cada muestra y dejar durante 8 minutos en RT.
6. Enjuague: Después de la permeabilización, enjuague suavemente las células con 1 ml de PBS 3 veces, durante 5 minutos cada una.
7. Bloqueo: Añadir 1 ml de suero de cabra al 10% en PBS a cada muestra e incubar en RT durante 1 h para bloquear cualquier interacción no específica.
8. Incubación con anticuerpo primario
   1. Diluir el anticuerpo anti-Nestin a una proporción de 1:100 usando 5% suero de cabra en PBS.
   2. Aplicar 500 μL de anticuerpo diluido en diferentes muestras e incubar durante la noche a 4 °C.
9. Enjuagar: Retire el anticuerpo y enjuague las muestras suavemente con 1 ml de PBS 3 veces durante 8 minutos cada una.
10. Incubación con anticuerpo secundario
    1. Diluya el IgG anti-ratón de cabra con etiqueta Alexa Fluor 488 a una proporción de 1:500 usando un 5% de suero de cabra en PBS.
    2. Aplicar 500 μL de anticuerpo diluido en diferentes muestras e incubar en la oscuridad durante 2 h en RT.
       NOTA: Después de aplicar anticuerpo secundario fluorescente, realice todos los pasos posteriores en la oscuridad para evitar que se calme la fluorescencia.
11. Enjuague: Retire el anticuerpo secundario y enjuague las muestras suavemente con 1 ml de PBS 3 veces durante 8 minutos cada una.
12. Tinción y montaje nuclear
    1. Coloque una gota del medio de montaje DAPI en el microsluro limpio.
    2. Retire cuidadosamente las muestras de las placas y coloque la muestra encima del medio de montaje DAPI con la celda boca abajo. Dejar en la oscuridad durante 5 minutos en RT.
    3. Retire el exceso de medio de montaje DAPI con papel absorbente.
13. Observación de microscopía de fluorescencia
    1. Coloque las muestras bajo la microscopía de fluorescencia y detecte la señal de DAPI y Alexa Fluor 488 utilizando filtros adecuados.
    2. Elija de manera uniforme y aleatoria 10-15 campos visuales diferentes para cada muestra y grabe las imágenes con una cámara CCD.

5. Diferenciación de los PNJ a las neuronas (Fase II)

1. Preparar derivados mESC en la diferenciación de fase I utilizando el protocolo 3 (8 días, Cuadro 1)como se detalla en el paso 2.4, que tiene la mayor eficiencia de diferenciación (véase la Figura 3).
   NOTA: Después de la diferenciación de la fase I, el control de calidad debe llevarse a cabo utilizando la observación de morfología celular y el ensayo de inmunofluorescencia mencionado anteriormente, para garantizar un PNJ sano y de alto rendimiento.
2. Semillas de aproximadamente 5 x 10⁵ derivados mESC dentro de 2 ml de medio de diferenciación basal I por pozo en las placas de 6 pozos recubiertas de gelatina al 0,1%. Divida aleatoriamente los derivados del mESC en 3 grupos, como el protocolo de fase II 1, el protocolo 2 y el protocolo 3, respectivamente.
3. Coloque la placa en la incubadora de CO₂ al 5% a 37 °C para permitir la fijación durante 6 h. Lávalo dos veces con 2 ml de PBS.
4. Añadir 2 ml de medio de diferenciación basal I, N2B27 medio I y N2B27 medio II(Tabla 2),respectivamente, a cada pozo de los grupos anteriores.
5. Coloque las placas en la incubadora y deje diferenciar durante otros 10 días. Cambie el medio correspondiente cada 2 días.
6. Compruebe el estado de diferenciación y registre los cambios morfológicos mencionados en el paso 3.
7. El día 18, evaluar la generación de neuronas (β-Tubulin III positivo) y determinar la eficiencia de diferenciación de los 3 protocolos que se utilizan en el paso 4.

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Resultados

La formación de cuerpos embrionados de 2 días + la inducción por AR de 6 días funciona mejor en la dirección de la diferenciación de los MESC en PNJ (Fase I). Para determinar el protocolo óptimo que mejor promueve la diferenciación de los MESC en PNJ (Fase I), se probaron 7 protocolos tanto en A2lox como en 129 mESCs(Cuadro 1)y se monitorizó el estado de diferenciación de cada grupo utilizando microscopio ligero. Como se muestra en la Figura 3A, la mayoría de los ...

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Discusión

En el presente estudio, establecimos un método simple y eficaz para la diferenciación neuronal de los mESC, con materiales de bajo costo y fácil obtención. En este método, 2 días de formación de cuerpos embrionados seguidos de 6 días de inducción por AR pueden promover eficazmente la diferenciación de los MESC en LOSP (Fase I-protocolo 3). Para la diferenciación de fase II, N2B27 medio II (Fase II-protocolo 3) más eficazmente inducen la diferenciación de los NPC en las neuronas. Para garantizar el éxito, se...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Nestin antibody [Rat-401]	Abcam	Ab11306	stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit	Sigma Aldrich	T2200	stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG	Beyotime	A0428	stored at -20 °C and protect from light
B-27 Supplement (50X), serum free	Gibco	17504044	stored at -20 °C, and protect from light
CHIR-99021 (CT99021)	Selleck	S1263	stored at -20 °C
Coverslips	NEST	801007
Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG	Beyotime	A0516	stored at -20 °C and protect from light
DME/F-12 1:1 (1x)	HyClone	SH30023.01B	stored at 4 °C
Fetal bovine serum	HyClone	SH30084.03	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Fluorescence microscopy	Olympus	CKX53
Gelatin	Gibco	CM0635B	stored at room temperature
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	stored at 4 °C
Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer	Beyotime	P0103	stored at 4 °C
KnockOut DMEM/F-12	Gibco	12660012	stored at 4 °C
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828028	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Leukemia Inhibitory Factor human	Sigma	L5283	stored at -20 °C
Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield	Abcam	ab104139	stored at 4 °C and protect from light
MEM Non-essential amino acids solution	Gibco	11140076	stored at 4 °C
N-2 Supplement (100X)	Gibco	17502048	stored at -20 °C and protect from light
Normal goat serum	Jackson	005-000-121	stored at -20 °C
Neurobasal Medium	Gibco	21103049	stored at 4 °C
Nonadhesive bacterial dish	Corning	3262
Phosphate Buffered Saline (1X)	HyClone	SH30256.01B	stored at 4 °C
Penicillin/ Streptomycin Solution	HyClone	SV30010	stored at 4 °C
PD0325901(Mirdametinib)	Selleck	S1036	stored at -20 °C
Retinoic acid	Sigma	R2625	stored at -80 °C and protect from light
Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells	Cyagen	MUAES-01001	Maintained in feeder-free culture system
Stem-Cellbanker (DMSO free)	ZENOAQ	stem cellbanker DMSO free	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Trypsin 0.25% (1X) Solution	HyClone	SH30042.01	stored at 4 °C
Triton X-100	Sigma	T8787
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023	stored at 4 °C and protect from light
4% paraformaldehyde	Beyotime	P0098	stored at -20 °C
6 - well plate	Corning	3516
60 mm cell culture dish	Corning	430166
15 ml centrifuge tube	NUNC	339650