Diferenciação neuronal de células-tronco embrionárias do rato in vitro

Resumo

Aqui, estabelecemos um método de baixo custo e fácil de operar que direciona a diferenciação rápida e eficiente das células-tronco embrionárias para os neurônios. Este método é adequado para popularização entre laboratórios e pode ser uma ferramenta útil para a pesquisa neurológica.

Resumo

A diferenciação neural das células-tronco embrionárias do camundongo (mESCs) é uma ferramenta potencial para elucidar os principais mecanismos envolvidos na neurogênese e potencialmente ajudar na medicina regenerativa. Aqui, estabelecemos um método eficiente e de baixo custo para diferenciação neuronal dos mESCs invitro, utilizando a estratégia de triagem combinatória. Sob as condições aqui definidas, a formação do corpo embrionário de 2 dias + protocolo de indução de ácido retinóico de 6 dias permite diferenciação rápida e eficiente dos mESCs em células precursoras neurais (NPCs), como visto pela formação de A2lox bem empilhados e neuritas semelhantes a 129 derivativos que são nestin positivos. O estado saudável dos corpos embrionários e o ponto de tempo em que o ácido retinóico (RA) é aplicado, assim como as concentrações de RA, são críticos no processo. Na diferenciação subsequente dos NPCs em neurônios, o N2B27 médio II (suplementado pelo meio neurobásal) poderia suportar melhor a manutenção e maturação a longo prazo das células neuronais. O método apresentado é altamente eficiente, de baixo custo e de fácil operação, podendo ser uma poderosa ferramenta para pesquisa em neurobiologia e biologia do desenvolvimento.

Introdução

As células-tronco embrionárias (ESCs) são pluripotentes e podem se diferenciar em células precursoras neurais (NPCs) e, posteriormente, em neurônios sob certas condições¹. A neurogênese baseada em ESC fornece a melhor plataforma para imitar neurogênese, servindo assim como uma ferramenta útil para estudos de biologia do desenvolvimento e potencialmente auxiliar na medicina regenerativa^2,3. Nas últimas décadas, muitas estratégias foram relatadas para induzir neurogênese embrionária, como o método transgênico⁴, utilizando pequenas moléculas⁵, utilizando um microambiente de matriz^{3D 6}, e a técnica de cocultura⁷. No entanto, a maioria desses protocolos são limitados ou difíceis de operar, portanto, não são adequados para uso na maioria dos laboratórios.

Para encontrar um método fácil de operar e de baixo custo para obter uma diferenciação neural eficiente dos mESCs, uma estratégia de triagem combinatória foi usada aqui. Conforme descrito na Figura 1,todo o processo de neurogênese embrionária foi dividido em 2 fases. A fase I refere-se ao processo de diferenciação dos mESCs em NPCs, e a fase II refere-se à diferenciação subsequente dos NPCs em neurônios. Com base nos princípios de fácil operação, baixo custo, materiais facilmente disponíveis e alta eficiência de diferenciação, foram escolhidos sete protocolos na Fase I e três na Fase II com base no sistema tradicional de cultura monocamadas aderente ou no sistema de formação corporal embrionário^8,9. A diferenciação de eficiência dos protocolos em ambas as fases foi avaliada por meio da observação da morfologia celular e do ensaio de imunofluorescência. Através da combinação do protocolo mais eficiente de cada fase, estabelecemos o método otimizado para diferenciação neural dos mESCs.

Protocolo

1. Cultura de células-tronco embrionárias do rato

1. Prepare 0,1% de pratos ou pratos de cultura celular revestido de gelatina.
   1. Adicione 2 mL de gelatina esterilizada de 0,1% (0,1% w/v em água) a pratos de cultura celular de 60 mm. Arrase suavemente para garantir até mesmo o revestimento dos pratos da cultura celular.
   2. Coloque os pratos em uma incubadora de CO₂ de 5% a 37 °C e deixe o revestimento por 1h.
   3. Remova a solução de gelatina de 0,1% antes de semear as células.
      NOTA: Depois de remover a gelatina, não há necessidade de secar ou lavar os pratos revestidos.
2. Cultura de células-tronco embrionárias do rato (A2lox e 129)
   1. Incubar células mESCs (A2lox e 129) nas células de cultura celular de 0,1% revestidas de 60 mm em meio de crescimento mESC a 37 °C em uma incubadora de CO₂ de 5%, respectivamente. O meio de crescimento mESC consiste em 85% de DMEM/F12, 15% de substituição de soro knock-out (KSR), 0,1 mM β-mercaptoethanol (2ME), 2 mM GlutaMAX, 1% aminoácido não essencial (NEAA), 1% penicilina/estreptomicina (P/S), 1000 fator inibidor de leucemia U/mL (LIF), 10 nM CHIR-99021 (inibidor GSK-3) e 0,33 nM PD0325901 (inibidor de MEK).
      ATENÇÃO: β-mercaptoetanol é inflamável e tem toxicidade por inalação. Mantenha-se afastado das fontes de incêndio e use uma máscara para evitar a inalação quando usar.
   2. Mude o médio de crescimento do MESC diariamente para um melhor crescimento de A2lox e 129.
   3. Quando as células atingirem 80% de confluência, retire o meio e adicione 1 mL de 0,1% de trippsina ao prato. Arrase suavemente por 30 s para garantir a cobertura uniforme de trippsina em todas as células.
   4. Deixe as células por cerca de 1 minuto para tentar e,em seguida, remova a trippsina usando pipeta de 1 mL.
   5. Adicione 2 mL de mESC médio de crescimento ao prato, pipeta para cima e para baixo várias vezes para fazer uma única suspensão celular.
   6. Conte a densidade das células na suspensão o mais precisamente possível usando hemótmetro.
   7. Divida as células em 7 grupos e induz a diferenciação usando diferentes protocolos mostrados na Tabela 1.

2. Diferenciação de mESCs para NPCs (Fase I)

1. Prepare 0,1% de placas de cultura celular revestida de gelatina ou deslizamentos.
   1. Antes de usar, prepare 0,1% de gelatina revestida de 6 poços ou tampas como na etapa 1.1.
2. Diferenciação da Fase I utilizando o protocolo 1 (Tabela 1)
   1. Semente cerca de 2 x 10⁴ mESCs em 2 mL de diferenciação basal médio I por bem nas placas 0,1% revestidas de gelatina 6-well. Verifique a densidade celular sob um microscópio.
   2. Incubar as células a 37 °C em uma incubadora de CO₂ de 5% por 6h para permitir a fixação.
   3. Após o apego, retire as células da incubadora e lave as células duas vezes com 2 mL de PBS.
   4. Adicione 2 mL de diferenciação basal médio I(Tabela 1) a cada poço e coloque as células de volta na incubadora.
   5. Deixe as células para diferenciação por 8 dias. Substitua o meio de diferenciação basal I a cada 2 dias.
3. Diferenciação da Fase I utilizando o protocolo 2 (Tabela 1)
   1. Adicione 1,5 x 10⁶ mESCs em um prato bacteriano não adesivo em 10 mL de diferenciação basal médio I para permitir a formação do corpo embrionário a 37 °C em uma incubadora de CO₂ de 5%.
   2. Após 2 dias, a célula de transferência agrega em tubos de centrífugas de 15 mL e os deixa se estabelecer pela gravidade.
   3. Remova o supernasal e adicione 10 mL de diferenciação basal fresca do meio I para resuspensar os corpos embrióides. Replantá-los em um novo prato bacteriano não adesivo e permitir diferenciação por mais 2 dias.
   4. Verifique a formação de corpos embrionários sob o microscópio(Figura 2A).
   5. Recolher corpos embrionários conforme descrito nas etapas 2.3.2-2.3.3. Semente cerca de 50 corpos embrionários em 2 mL de meio de diferenciação basal I por poço em 0,1% de placas revestidas de gelatina 6-well.
   6. Prepare 1 mM de estoque de RA totalmente trans (em DMSO) e armazene longe da luz em um congelador de -80 °C após a sub-embalagem.
      NOTA: A RA é instável, e deve-se prestar atenção para mantê-lo longe da luz e reduzir o contato aéreo durante a preparação do estoque de RA.
   7. Para indução de RA, adicione 2 μL de estoque de RA em cada poço para fazer uma concentração final de 1 μM.
   8. Coloque a placa na incubadora de CO₂ de 5% a 37 °C e diferencie por mais 4 dias.
   9. Altere todo o 2 mL de diferenciação basal médio I (com RA de 1 μM) a cada 2 dias.
4. Diferenciação da Fase I utilizando o protocolo 3 (Tabela 1)
   1. Plante 1,5 x 10⁶ mESCs em um prato bacteriano não adesivo em 10 mL de diferenciação basal médio I. Deixe por 2 dias para formação corporal embrionária a 37 °C em uma incubadora de CO₂ de 5%.
   2. Verifique a formação de corpos embrionários sob um microscópio(Figura 2B).
   3. Transfira os agregados celulares em tubos de centrífugas de 15 mL e deixe-os se estabelecer pela gravidade.
   4. Remova o supernatante cuidadosamente e adicione 10 mL de diferenciação basal fresca do meio I para resuspensá-los.
   5. Semente cerca de 50 corpos embrionários em 2 mL de meio de diferenciação basal I por poço em 0,1% de placas revestidas de gelatina 6-well.
   6. Para indução de RA, adicione 2 μL de estoque de RA em cada poço para fazer uma concentração final de 1 μM.
   7. Coloque a placa na incubadora de CO₂ de 5% a 37 °C e diferencie por mais 6 dias. Altere todo o meio de diferenciação basal I (com RA de 1 μM) a cada 2 dias.
5. Diferenciação da Fase I utilizando o protocolo 4 (Tabela 1)
   1. Semente cerca de 2 x 10⁴ mESCs dentro de 2 mL de meio de diferenciação basal I por bem nas placas de 0,1% revestidas de gelatina 6-well. Coloque a placa na incubadora de CO₂ de 5% a 37 °C para permitir a fixação por 6h.
   2. Após o apego, lave as células duas vezes com 2 mL de PBS. Adicione 2 mL de diferenciação basal médio I a cada poço e deixe a diferenciação por 4 dias na incubadora de 5% de CO₂ a 37 °C.
   3. Para indução de RA, adicione 2 μL de estoque de RA totalmente trans em cada poço (a concentração de trabalho é de 1 μM) para induzir a diferenciação por mais 4 dias.
   4. Em todo o processo, substitua todo o meio a cada 2 dias.
6. Diferenciação da Fase I utilizando o protocolo 5 (Tabela 1)
   1. Semente cerca de 2 x 10⁴ mESCs dentro de 2 mL de meio de diferenciação basal I por bem nas placas de 0,1% revestidas de gelatina 6-well. Coloque a placa na incubadora de CO₂ de 5% a 37 °C para permitir a fixação por 6h.
   2. Lave as células duas vezes com 2 mL de PBS. Adicione 2 mL de diferenciação basal médio I a cada poço e deixe a diferenciação por 2 dias na incubadora de 5% de CO₂ a 37 °C.
   3. Para a indução de RA subsequente, adicione 2 μL de estoque de RA em cada poço para fazer uma concentração final de 1 μM. Coloque a placa na incubadora de CO₂ de 5% a 37 °C para induzir a diferenciação por mais 6 dias.
   4. Em todo o processo, substitua todo o meio a cada 2 dias.
7. Diferenciação da Fase I utilizando o protocolo 6 (Tabela 1)
   1. Plante 1,5 x 10⁶ mESCs em um prato bacteriano não adesivo em 10 mL de N2B27 médio II(Tabela 1) para permitir a formação de corpos embrióides.
   2. No^2º dia, recolher os agregados celulares conforme descrito nas etapas 2.3.2-2.3.3 e resuspensar os corpos embrióides utilizando 10 mL de n2B27 médio II fresco.
   3. Replante-os em um novo prato bacteriano não adesivo e permita diferenciação por mais 2 dias na incubadora de CO₂ de 5% a 37 °C. Verifique a formação de corpos embrionários sob microscópio.
   4. No^4º dia, colete corpos embrionários. Semente cerca de 50 corpos embrionários por poço em placas de 6 poços revestidos de gelatina com 2 mL de N2B27 médio II.
   5. Adicione 2 μL de estoque de RA totalmente trans em cada poço e induza a diferenciação por mais 4 dias. Substitua todo o meio (N2B27 médio II por 1 μM RA) a cada dois dias.
8. Diferenciação da Fase I utilizando o protocolo 7 (Tabela 1)
   1. Semente cerca de 2 x 10⁴ mESCs dentro de 2 mL de meio de diferenciação basal I por bem nas placas de 0,1% revestidas de gelatina 6-well. Coloque a placa na incubadora de CO₂ de 5% a 37 °C para permitir a fixação por 6h.
   2. Lave as células duas vezes com PBS. Em seguida, adicione 2 mL de N2B27 médio II a cada poço e deixe a diferenciação por 8 dias a 37 °C em uma incubadora de CO_{2 de 5%.}
   3. Troque todo o N2B27 médio II a cada 2 dias.

3. Observação da morfologia celular

1. Verifique o status de diferenciação dos 7 grupos acima mencionados diariamente sob um microscópio de luz de contraste de fase invertida.
2. Selecione aleatoriamente pelo menos 12 campos e tire fotos para registrar as alterações morfológicas de cada grupo em D8.

4. Mancha de imunofluorescência

1. Preparação da amostra: Seed mESCs em tampas revestidas de gelatina de 0,1% e permitem diferenciação por 8 dias utilizando os protocolos mencionados na etapa 2.
2. Enxágüe: No^8º dia, retire as amostras da incubadora e remova o meio de diferenciação por aspiração. Enxágue suavemente as células uma vez com 1 mL de PBS por 5 min.
3. Fixação: Adicione 1 mL de 4% de paraformaldeído a cada amostra e fixe as células por 20 minutos à temperatura ambiente (TR).
4. Enxágüe: Após a fixação, enxágue suavemente as células com 1 mL de PBS 3 vezes, por 5 minutos cada.
5. Permeabilização: Adicione 1 mL de 0,2% TritonX-100 em PBS a cada amostra e deixe por 8 min na RT.
6. Enxágüe: Após a permeabilização, enxágue suavemente as células com 1 mL de PBS 3 vezes, por 5 minutos cada.
7. Bloqueio: Adicione 1 mL de soro de cabra de 10% em PBS a cada amostra e incubar na RT por 1h para bloquear quaisquer interações não específicas.
8. Incubação com anticorpo primário
   1. Diluir o anticorpo anti-Nestin a uma proporção de 1:100 usando 5% de soro de cabra na PBS.
   2. Aplique 500 μL de anticorpo diluído em diferentes amostras e incubar durante a noite a 4 °C.
9. Enxágüe: Remova o anticorpo e enxágue as amostras suavemente com 1 mL de PBS 3 vezes por 8 minutos cada.
10. Incubação com anticorpos secundários
    1. Diluir o Alexa Fluor 488-rotulado anti-rato IgG com uma proporção de 1:500 usando 5% de soro de cabra em PBS.
    2. Aplique 500 μL de anticorpo diluído em diferentes amostras e incubar no escuro por 2 h no RT.
       NOTA: Após aplicar anticorpos secundários fluorescentes, realize todas as etapas subsequentes no escuro para evitar a saciamento da fluorescência.
11. Enxágüe: Remova o anticorpo secundário e enxágue as amostras suavemente com 1 mL de PBS 3 vezes por 8 minutos cada.
12. Coloração nuclear e montagem
    1. Coloque uma gota de meio de montagem DAPI no microslídeo limpo.
    2. Retire cuidadosamente das amostras das placas e coloque a amostra em cima do meio de montagem da DAPI com a célula de frente para baixo. Deixe no escuro por 5 minutos no RT.
    3. Remova o excesso de dopi médio de montagem com papel absorvente.
13. Observação de microscopia de fluorescência
    1. Coloque os espécimes sob a microscopia de fluorescência e detecte o sinal para DAPI e Alexa Fluor 488 usando filtros adequados.
    2. Escolha uniforme e aleatoriamente 10-15 campos visuais diferentes para cada amostra e grave as imagens com uma câmera CCD.

5. Diferenciação de NPCs para neurônios (Fase II)

1. Prepare os derivados mESC sob a diferenciação da Fase I utilizando o protocolo 3 (8 dias, Tabela 1) conforme detalhado na etapa 2.4, que tem a maior eficiência de diferenciação (Ver Figura 3).
   NOTA: Após a diferenciação da fase I, deve ser realizado o controle de qualidade utilizando observação de morfologia celular e ensaio de imunofluorescência mencionado acima, para garantir um NPCs saudável e de alto rendimento.
2. Semente cerca de 5 x 10⁵ mESC derivados dentro de 2 mL de diferenciação basal médio I por bem nas placas de 0,1% revestidas de gelatina 6-well. Divida aleatoriamente os derivados do mESC em 3 grupos, como o protocolo fase II 1, o protocolo 2 e o protocolo 3, respectivamente.
3. Coloque a placa na incubadora de CO₂ de 5% a 37 °C para permitir a fixação por 6h. Lave-os duas vezes com 2 mL de PBS.
4. Adicione 2 mL de diferenciação basal médio I, N2B27 médio I e N2B27 médio II(Tabela 2), respectivamente,a cada poço dos grupos acima.
5. Coloque as placas na incubadora e deixe diferenciar por mais 10 dias. Troque o meio correspondente a cada 2 dias.
6. Verifique o estado de diferenciação e regise as alterações morfológicas mencionadas na etapa 3.
7. No dia 18, avalie a geração de neurônios (β-Tubulin III positivo) e determine a eficiência de diferenciação dos 3 protocolos utilizando na etapa 4.

Resultados

Formação corporal embrionária de 2 dias + a indução de RA de 6 dias funciona melhor na direção da diferenciação de mESCs em NPCs (Fase I). Para determinar o protocolo ideal que melhor promove a diferenciação de mESCs em NPCs (Fase I), 7 protocolos foram testados tanto em A2lox quanto em 129 mESCs(Tabela 1) e o status de diferenciação de cada grupo foi monitorado por microscópio leve. Como mostrado na Figura 3A, a maioria dos derivados A2lox e 129 em formação ...

Discussão

No presente estudo, estabelecemos um método simples e eficaz para diferenciação neuronal dos mESCs, com baixo custo e materiais de fácil obtenção. Neste método, 2 dias de formação corporal embrionária seguida de 6 dias de indução de RA podem efetivamente promover a diferenciação de mESCs em NPCs (Fase I-protocolo 3). Para a diferenciação da fase II, o N2B27 médio II (Fase II-protocolo 3) induz mais efetivamente a diferenciação dos NPCs em neurônios. Para garantir o sucesso, mais atenção deve ser dad...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Nestin antibody [Rat-401]	Abcam	Ab11306	stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit	Sigma Aldrich	T2200	stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG	Beyotime	A0428	stored at -20 °C and protect from light
B-27 Supplement (50X), serum free	Gibco	17504044	stored at -20 °C, and protect from light
CHIR-99021 (CT99021)	Selleck	S1263	stored at -20 °C
Coverslips	NEST	801007
Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG	Beyotime	A0516	stored at -20 °C and protect from light
DME/F-12 1:1 (1x)	HyClone	SH30023.01B	stored at 4 °C
Fetal bovine serum	HyClone	SH30084.03	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Fluorescence microscopy	Olympus	CKX53
Gelatin	Gibco	CM0635B	stored at room temperature
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	stored at 4 °C
Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer	Beyotime	P0103	stored at 4 °C
KnockOut DMEM/F-12	Gibco	12660012	stored at 4 °C
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828028	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Leukemia Inhibitory Factor human	Sigma	L5283	stored at -20 °C
Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield	Abcam	ab104139	stored at 4 °C and protect from light
MEM Non-essential amino acids solution	Gibco	11140076	stored at 4 °C
N-2 Supplement (100X)	Gibco	17502048	stored at -20 °C and protect from light
Normal goat serum	Jackson	005-000-121	stored at -20 °C
Neurobasal Medium	Gibco	21103049	stored at 4 °C
Nonadhesive bacterial dish	Corning	3262
Phosphate Buffered Saline (1X)	HyClone	SH30256.01B	stored at 4 °C
Penicillin/ Streptomycin Solution	HyClone	SV30010	stored at 4 °C
PD0325901(Mirdametinib)	Selleck	S1036	stored at -20 °C
Retinoic acid	Sigma	R2625	stored at -80 °C and protect from light
Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells	Cyagen	MUAES-01001	Maintained in feeder-free culture system
Stem-Cellbanker (DMSO free)	ZENOAQ	stem cellbanker DMSO free	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Trypsin 0.25% (1X) Solution	HyClone	SH30042.01	stored at 4 °C
Triton X-100	Sigma	T8787
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023	stored at 4 °C and protect from light
4% paraformaldehyde	Beyotime	P0098	stored at -20 °C
6 - well plate	Corning	3516
60 mm cell culture dish	Corning	430166
15 ml centrifuge tube	NUNC	339650