小鼠胚胎干细胞体外神经元分化

摘要

在这里，我们建立了一种低成本和易于操作的方法，将胚胎干细胞快速高效分化为神经元。该方法适用于实验室的推广，是神经学研究的有用工具。

摘要

小鼠胚胎干细胞（mESCs）的神经分化是阐明神经生成的关键机制并可能有助于再生医学的潜在工具。在这里，我们建立了一种高效和低成本的神经元分化方法，从mESC体外， 使用组合筛选的策略。根据此处定义的条件，2 天胚胎体形成 – 6 天视网膜酸诱导协议允许从 mESC 快速有效地分化为神经前体细胞 （NPC），如形成堆叠良好和中性状 A2lox 和 129 个内斯汀阳性衍生物所示。胚胎体的健康状态和使用网膜酸 （RA） 的时间点以及 RA 浓度在此过程中至关重要。在随后从NPC向神经元的分化中，N2B27中II（辅以神经基质介质）可以更好地支持神经元细胞的长期维持和成熟。该方法效率高、成本低、操作方便，是神经生物学和发育生物学研究的有力工具。

引言

胚胎干细胞（ESCs）是多能的，可以分化成神经前体细胞（NPC），随后在某些条件下进入神经元^1。基于ESC的神经生成提供了模仿神经生成的最佳平台，从而作为发展生物学研究的有用工具，并可能有助于再生医学^2，3。在过去的几十年里，许多诱导胚胎神经生成的策略被报道，如转基因方法^4，使用小分子^5，使用3D矩阵微环境^6，和共生技术^7。但是，这些协议大多条件有限或难以操作，因此不适合在大多数实验室中使用。

为了找到一种操作简单、成本低廉的方法，实现与 mESC 的有效神经分化，这里使用了组合筛查策略。如图1所述，胚胎神经生成的整个过程分为两个阶段。第一阶段是指从 mESC 到 NPC 的分化过程，第二阶段涉及从 NPC 到神经元的后续分化。基于操作方便、成本低、材料易用、分化效率高的原则，根据传统的单层培养系统或胚胎体形成系统^8、9，选择了第一阶段的7个协议和第二阶段的³个协议。利用细胞形态观察和免疫荧光检测，评估了两个阶段协议的分化效率。通过结合每个阶段最有效的协议，我们建立了神经分化与 mESC 的优化方法。

研究方案

1. 小鼠胚胎干细胞培养

1. 准备 0.1% 明胶涂层细胞培养皿或盘子。
   1. 加入2 mL的灭菌0.1%明胶（0.1%w/v在水中）到60毫米细胞培养皿。轻轻摇动，确保细胞培养皿均匀涂层。
   2. 将菜肴放入 37 °C 下的 5% CO₂ 孵化器中，并允许涂层 1 小时。
   3. 在播种细胞之前取出0.1%的明胶溶液。
      注意:去除明胶后，无需干燥或清洗涂层的盘子。
2. 小鼠胚胎干细胞（A2lox和129）培养
   1. 在 0.1% 明胶中孵化 mESC （A2lox 和 129） 细胞，分别在 5% CO₂ 孵化器中以 37 °C 在 mESC 生长介质中涂上 60 mm 细胞培养皿。mESC 增长介质包括 85% 淘汰 DMEM/F12、15% 淘汰血清置换 （KSR）、0.1 m β甲醇 （2ME）、2 mM 谷胱甘肽、 1%非必需氨基酸（NEAA）、1%青霉素/链霉素（P/S）、1000 U/mL白血病抑制因子（LIF）、10 nM CHIR-99021（GSK-3抑制剂）和0.33 nM PD0325901（MEK抑制剂）。
      警告:β甲醇易燃，具有吸入毒性。远离火源，戴上口罩，避免在使用时吸入。
   2. 每天更改 mESC 增长介质，以更好地促进 A2lox 和 129 的增长。
   3. 当细胞达到80%的汇合时，取出介质，在菜中加入1 mL的0.1%的试金石。轻轻摇动30s，以确保所有细胞上均覆盖试金石。
   4. 离开细胞约1分钟 ，尝试蛋白化，然后使用1 mL移液器去除试金石。
   5. 在菜中加入 2 mL 的 mESC 生长介质，上上下下几次移液器，使单个细胞悬架。
   6. 使用血细胞计尽可能准确地计算悬架中细胞的密度。
   7. 将细胞分成7组，使用 表1中显示的不同方案诱导分化。

2. 从中小企业到NPC的差异化（第一阶段）

1. 准备 0.1% 明胶涂层细胞培养板或盖片。
   1. 使用前，准备 0.1% 明胶涂层 6 井板或盖片，如第 1.1 步。
2. 使用协议 1 （表 1）进行第一阶段分化
   1. 种子约2 x 10⁴ mESCs在2 mL的基底分化介质I每口井在0.1%明胶涂层6井板。检查显微镜下的细胞密度。
   2. 在 5% CO₂ 孵化器中以 37 °C 孵育细胞 6 小时，以便附件。
   3. 附着后，从孵化器中取出细胞，用2 mL的PBS清洗细胞两次。
   4. 在每个井中加入2 mL的基底分化介质I（表1），并将细胞放回孵化器。
   5. 离开细胞进行8天的分化。每2天更换一次基底分化介质I。
3. 使用协议 2 （表 1） 进行第一阶段分化
   1. 在 10 mL 的基底分化介质 I 中加入 1.5 x 10⁶ mESCs 到非粘性细菌盘中，以便在 5% CO₂ 孵化器中以 37 °C 形成胚胎体。
   2. 2天后，将细胞聚集物转移到15mL离心管中，让它们通过重力沉降。
   3. 去除超纳坦，加入10mL的新鲜基底分化介质I，以重新悬浮胚胎体。将它们重新种植到一个新的非粘性细菌盘中，并允许分化2天。
   4. 检查显微镜下胚胎体的形成（图2A）。
   5. 收集步骤 2.3.2-2.3.3 中描述的胚胎体。种子约50胚胎体在2mL的基底分化介质I每口井到0.1%明胶涂层6井板。
   6. 准备 1 mm 全跨 RA 库存（在 DMSO 中），并在分包装后将光线存放在 -80 °C 冰柜中。
      注意:RA是不稳定的，在准备RA库存时，应注意使其远离光线和减少空气接触。
   7. 对于 RA 感应，在每个油井中加入 2 μL 的 RA 库存，最终浓度为 1 μM。
   8. 将板放入 37 °C 的 5% CO₂ 孵化器中，再分化 4 天。
   9. 每2天更换2 mL的基底分化介质I（带1μM RA）。
4. 使用协议 3 （表 1） 分化第一阶段
   1. 将 1.5 x 10⁶ mESCs 种植到 10 mL 的基底分化介质 I 中，在 5% CO 2 孵化器中以 37 °C 的胚胎体形成₂ 天。
   2. 检查显微镜下胚胎体的形成（图2B）。
   3. 将细胞聚集物转移到15 mL离心管中，让它们通过重力稳定下来。
   4. 小心地取出超纳坦，加入10 mL的新鲜基底分化介质I来重新悬浮它们。
   5. 种子约50胚胎体到2 mL的基底分化介质I每口井到0.1%明胶涂层6井板。
   6. 对于 RA 感应，在每个油井中加入 2 μL 的 RA 库存，最终浓度为 1 μM。
   7. 将板放入 37 °C 下的 5% CO₂ 孵化器中，再分化 6 天。每 2 天更换一次整个基底分化介质 I（带 1 μM RA）。
5. 使用协议 4 （表 1） 进行第一阶段分化
   1. 种子约 2 x 10⁴ mESCs 在 2 mL 的基底分化介质 I 每口井上 0.1% 明胶涂层 6 井板。将板放入 37 °C 下的 5% CO₂ 孵化器中，以便附件 6 小时。
   2. 附件后，用2 mL的PBS清洗细胞两次。将 2 mL 的基底分化介质 I 添加到每个井中，并在 37 °C 的 5% CO₂ 孵化器中分化 4 天。
   3. 对于 RA 感应，在每个井中添加 2 μL 的全跨 RA 库存（工作浓度为 1 μM），以诱导分化再持续 4 天。
   4. 在整个过程中，每2天更换一次整个媒体。
6. 使用协议 5 （表 1） 进行第一阶段分化
   1. 种子约 2 x 10⁴ mESCs 在 2 mL 的基底分化介质 I 每口井上 0.1% 明胶涂层 6 井板。将板放入 37 °C 下的 5% CO₂ 孵化器中，以便附件 6 小时。
   2. 用 2 mL 的 PBS 清洗细胞两次。将 2 mL 的基底分化介质 I 添加到每个井中，并在 37 °C 的 5% CO 2 孵化器中进行₂ 天的分化。
   3. 对于后续的 RA 感应，在每口油井中加入 2 μL 的 RA 库存，使最终浓度为 1 μM。 将板放入 37 °C 下的 5% CO₂ 孵化器中，以诱导分化再持续 6 天。
   4. 在整个过程中，每2天更换一次整个媒体。
7. 使用协议 6 （表 1） 进行第一阶段分化
   1. 在N2B27介质II（表1）的10mL中将1.5 x 10⁶ mESCs植物成非粘性细菌盘，以允许胚胎体的形成。
   2. ^第2天，收集步骤2.3.2-2.3.3中描述的细胞聚合物，并使用10 mL的新鲜N2B27介质II重新悬生胚胎体。
   3. 将它们重新种植到一个新的非粘性细菌盘中，并在37°C的5%CO₂ 孵化器中再分化2天。 检查显微镜下胚胎体的形成。
   4. 第⁴ 天，收集胚胎体。种子约50胚胎体每井0.1%明胶涂层6井板与2 mL的N2B27中等II。
   5. 将 2 μL 的全跨 RA 库存添加到每个井中，并诱导分化再持续 4 天。每两天更换一次整个介质（N2B27 介质 II 与 1 μM RA）。
8. 使用协议 7 （表 1） 进行第一阶段分化
   1. 种子约 2 x 10⁴ mESCs 在 2 mL 的基底分化介质 I 每口井上 0.1% 明胶涂层 6 井板。将板放入 37 °C 下的 5% CO₂ 孵化器中，以便附件 6 小时。
   2. 用PBS清洗细胞两次。然后，在每个油井中添加 2 mL 的 N2B27 介质 II，并在 5% CO₂ 孵化器中在 37 °C 下进行 8 天的分化。
   3. 每2天更换一次整个N2B27介质II。

3. 细胞形态观察

1. 每天在倒相对比光显微镜下检查上述7组的分化状态。
2. 随机选择至少 12 个字段并拍照以记录 D8 上每个组的形态变化。

4. 免疫荧光染色

1. 样品制备:0.1%明胶涂层盖片上的种子 mESC，并允许使用第 2 步中提及的协议进行 8 天的分化。
2. 冲洗:^第8天 ，从孵化器中取出样品，并按吸入去除分化介质。用 1 mL 的 PBS 轻轻冲洗细胞一次 5 分钟。
3. 固定:在每个样品中添加4%的准甲醛的1mL，并在室温下固定细胞20分钟（RT）。
4. 冲洗:固定后，用1 mL的PBS轻轻冲洗细胞3次，每次5分钟。
5. 渗透:在 PBS 中添加 1 mL 的 0.2% 三元 X-100，并在 RT 中保留 8 分钟。
6. 冲洗:渗透后，用1mL的PBS轻轻冲洗细胞3次，每次5分钟。
7. 阻止:在PBS中添加1 mL的10%山羊血清到每个样本中，并在RT孵育1小时，以阻止任何非特定的相互作用。
8. 与原发性抗体的孵化
   1. 使用PBS中5%的山羊血清以1:100的比例稀释抗内斯汀抗体。
   2. 将500μL的稀释抗体涂抹到不同的样品上，并在4°C下孵育过夜。
9. 冲洗:去除抗体，用1mL的PBS轻轻冲洗样品，每次8分钟。
10. 二次抗体孵育
    1. 在PBS中使用5%的山羊血清，以1:500的比例稀释Alexa Fluor 488标签的山羊抗鼠IgG。
    2. 将500μL的稀释抗体涂抹在不同的样品上，并在RT中在黑暗中孵育2小时。
       注:应用荧光二次抗体后，在黑暗中执行所有后续步骤，以防止荧光淬火。
11. 冲洗:去除二次抗体，用1 mL的PBS轻轻冲洗样品，每次8分钟。
12. 核污渍和安装
    1. 将一滴 DAPI 安装介质放置在干净的微滑板上。
    2. 小心地从板中取出样品，并将样品放在 DAPI 安装介质顶部，细胞面朝下。在黑暗中离开 5 分钟在 Rt 。
    3. 用吸和纸去除多余的 DAPI 安装介质。
13. 荧光显微镜观察
    1. 将标本置于荧光显微镜下，使用适当的过滤器检测 DAPI 和 Alexa Fluor 488 的信号。
    2. 为每个样本均匀随机地选择 10-15 个不同的视场，并使用 CCD 摄像机记录图像。

5. 从 NPC 到神经元的差异（第二阶段）

1. 使用协议 3（8 天，表 1）在 I 阶段分化下准备 mESC 衍生工具，详见步骤 2.4，具有最高的分化效率（见图 3）。
   注:第一阶段分化后，应采用上述细胞形态观察和免疫荧光检测进行质量控制，以确保NPC健康高产。
2. 种子约 5 x 10⁵ mESC 衍生物在 2 mL 的基底分化介质 I 每口井上 0.1% 明胶涂层 6 井板。随机将 mESC 衍生工具分为 3 组，分别是第二阶段协议 1、协议 2 和协议 3。
3. 将板放入 37 °C 下的 5% CO₂ 孵化器中，以便附件 6 小时。用2 mL的PBS清洗两次。
4. 在上述组的每口井中分别添加2 mL的基底分化介质I、N2B27介质I和N2B27介质II（表2）。
5. 将板放入孵化器中，并允许再区分 10 天。每2天更换一次相应的介质。
6. 检查分化状态并记录第 3 步中提到的形态变化。
7. 在第18天，评估神经元的生成（β-Tubulin III阳性），并确定第4步中使用的3个协议的分化效率。

结果

2 天胚胎体形成 + 6 天 RA 感应最能指导 MESC 分化到 NPC （第一阶段）。为了确定最能促进将 mESC 分化为 NPC（第一阶段）的最佳方案，在 A2lox 和 129 mESC （表 1）上测试了 7 个协议，并使用光显微镜监测了每个组的分化状态。如 图3A所示，在"2天胚胎体形成+6天RA诱导"治疗下，大多数A2lox和129个衍生物（第一阶段协议3）显示堆积良好和中性状形态，这表明NPC的形成。?...

讨论

在本研究中，我们建立了一种简单而有效的神经元分化方法，具有成本低、材料易用等功能。在这种方法中，2天的胚胎体形成，然后是6天的RA诱导，可以有效地促进mESC在NPC中的分化（第一阶段协议3）。对于二期分化，N2B27介质II（II-协议3）最有效地诱导从NPC分化为神经元。为确保成功，应更多地注意几个关键步骤。

首先，胚胎体的健康状态是整个分化过程的关键。三维胚胎...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Nestin antibody [Rat-401]	Abcam	Ab11306	stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit	Sigma Aldrich	T2200	stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG	Beyotime	A0428	stored at -20 °C and protect from light
B-27 Supplement (50X), serum free	Gibco	17504044	stored at -20 °C, and protect from light
CHIR-99021 (CT99021)	Selleck	S1263	stored at -20 °C
Coverslips	NEST	801007
Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG	Beyotime	A0516	stored at -20 °C and protect from light
DME/F-12 1:1 (1x)	HyClone	SH30023.01B	stored at 4 °C
Fetal bovine serum	HyClone	SH30084.03	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Fluorescence microscopy	Olympus	CKX53
Gelatin	Gibco	CM0635B	stored at room temperature
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	stored at 4 °C
Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer	Beyotime	P0103	stored at 4 °C
KnockOut DMEM/F-12	Gibco	12660012	stored at 4 °C
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828028	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Leukemia Inhibitory Factor human	Sigma	L5283	stored at -20 °C
Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield	Abcam	ab104139	stored at 4 °C and protect from light
MEM Non-essential amino acids solution	Gibco	11140076	stored at 4 °C
N-2 Supplement (100X)	Gibco	17502048	stored at -20 °C and protect from light
Normal goat serum	Jackson	005-000-121	stored at -20 °C
Neurobasal Medium	Gibco	21103049	stored at 4 °C
Nonadhesive bacterial dish	Corning	3262
Phosphate Buffered Saline (1X)	HyClone	SH30256.01B	stored at 4 °C
Penicillin/ Streptomycin Solution	HyClone	SV30010	stored at 4 °C
PD0325901(Mirdametinib)	Selleck	S1036	stored at -20 °C
Retinoic acid	Sigma	R2625	stored at -80 °C and protect from light
Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells	Cyagen	MUAES-01001	Maintained in feeder-free culture system
Stem-Cellbanker (DMSO free)	ZENOAQ	stem cellbanker DMSO free	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Trypsin 0.25% (1X) Solution	HyClone	SH30042.01	stored at 4 °C
Triton X-100	Sigma	T8787
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023	stored at 4 °C and protect from light
4% paraformaldehyde	Beyotime	P0098	stored at -20 °C
6 - well plate	Corning	3516
60 mm cell culture dish	Corning	430166
15 ml centrifuge tube	NUNC	339650