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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier haben wir eine kostengünstige und einfach zu bedienende Methode etabliert, die eine schnelle und effiziente Differenzierung von embryonalen Stammzellen in Neuronen leitet. Diese Methode eignet sich für die Popularisierung unter Laboratorien und kann ein nützliches Werkzeug für die neurologische Forschung sein.

Zusammenfassung

Die neuronale Differenzierung embryonaler Stammzellen (mESCs) ist ein mögliches Werkzeug zur Aufklärung der Schlüsselmechanismen der Neurogenese und potenzieller Hilfe in der regenerativen Medizin. Hier haben wir eine effiziente und kostengünstige Methode zur neuronalen Differenzierung von mESCs in vitroetabliert, mit der Strategie des kombinatorischen Screenings. Unter den hier definierten Bedingungen ermöglicht die 2-tägige embryoide Körperbildung + 6-Tage-Retinoinsäure-Induktionsprotokoll eine schnelle und effiziente Differenzierung von mESCs in neuronale Vorläuferzellen (NPCs), wie die Bildung von gut gestapelten und neuritigen A2lox- und 129 Derivaten sieht, die Nestin-positiv sind. Der gesunde Zustand von embryoiden Körpern und der Zeitpunkt, an dem Retinsäure (RA) angewendet wird, sowie die RA-Konzentrationen sind dabei von entscheidender Bedeutung. In der anschließenden Differenzierung von NPCs in Neuronen könnte N2B27 medium II (ergänzt durch Neurobasal medium) die langfristige Erhaltung und Reifung neuronaler Zellen besser unterstützen. Die vorgestellte Methode ist hochgradig effizient, kostengünstig und einfach zu bedienen und kann ein leistungsfähiges Werkzeug für die Neurobiologie und Entwicklungsbiologieforschung sein.

Einleitung

Embryonale Stammzellen (ESCs) sind pluripotent und können sich unter bestimmten Bedingungen in neuronale Vorläuferzellen (NPCs) und anschließend in Neuronen differenzieren1. ESC-basierte Neurogenese bietet die beste Plattform, um Neurogenese zu imitieren, und dient somit als nützliches Werkzeug für Entwicklungsbiologie-Studien und potenziell Hilfe in der regenerativen Medizin2,3. In den letzten Jahrzehnten wurden viele Strategien zur Induktion der embryonalen Neurogenese berichtet, wie die transgene Methode4, mit kleinen Molekülen5, mit einer 3D-Matrix-Mikroumgebung6, und die Co-Kultur-Technik7. Die meisten dieser Protokolle sind jedoch entweder bedingt oder schwer zu bedienen, daher sind sie für den Einsatz in den meisten Laboratorien nicht geeignet.

Um eine einfach zu bedienende und kostengünstige Methode zu finden, um eine effiziente neuronale Differenzierung von mESCs zu erreichen, wurde hier eine kombinatorische Screening-Strategie verwendet. Wie in Abbildung 1beschrieben, wurde der gesamte Prozess der embryonalen Neurogenese in 2 Phasen unterteilt. Phase I bezieht sich auf den Differenzierungsprozess von mESCs in NPCs, und Phase II bezieht sich auf die nachfolgende Differenzierung von NPCs in Neuronen. Basierend auf den Prinzipien der einfachen Bedienung, der niedrigen Kosten, der leicht zugänglichen Materialien und der hohen Differenzierungseffizienz wurden sieben Protokolle in Phase I und drei Protokolle in Phase II auf der Grundlage des traditionellen stickigen Monolayer-Kultursystems oder embryoiden Körperbildungssystems8,9ausgewählt. Die Differenzierungseffizienz von Protokollen in beiden Phasen wurde mittels Zellmorphologiebeobachtung und Immunfluoreszenz-Assay evaluiert. Durch die Kombination des effizientesten Protokolls jeder Phase haben wir die optimierte Methode zur neuronalen Differenzierung von mESCs etabliert.

Protokoll

1. Maus embryonale Stammzellkultur

  1. Bereiten Sie 0,1% gelatinebeschichtete Zellkultur-Gerichte oder Teller zu.
    1. 2 ml sterilisierte 0,1% Gelatine (0,1% w/v in Wasser) zu 60 mm Zellkulturschalen hinzufügen. Schaukeln Sie sanft, um eine gleichmäßige Beschichtung der Zellkulturgerichte zu gewährleisten.
    2. Die Gerichte bei 37 °C in einen 5% CO2-Inkubator geben und 1 h beschichten lassen.
    3. Entfernen Sie die 0,1% Gelatinelösung, bevor Sie die Zellen säen.
      HINWEIS: Nach dem Entfernen der Gelatine ist es nicht erforderlich, die beschichteten Gerichte zu trocknen oder zu waschen.
  2. Embryonale Stammzellen der Maus (A2lox und 129) Kultur
    1. Inkubieren Sie mESCs (A2lox und 129) Zellen in den 0,1% gelatinebeschichteten 60 mm Zellkulturschalen in mESC Wachstumsmedium bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator. Das mESC-Wachstumsmedium besteht aus 85% Knock-out DMEM/F12, 15% Knock-out Serumersatz (KSR), 0,1 mM β-Mercaptoethanol (2ME), 2 mM GlutaMAX, 1% nicht-essentielle Aminosäure (NEAA), 1% Penicillin/Streptomycin (P/S), 1000 U/mL Leukämie-Hemmfaktor (LIF), 10 nM CHIR-99021 (GSK-3-Hemmer) und 0,33 nM PD0325901 (MEK-Hemmer).
      VORSICHT: β-Mercaptoethanol ist entzündlich und hat Inhalationstoxizität. Halten Sie sich von Brandquellen fern und tragen Sie eine Maske, um einEinatmen bei Gebrauch zu vermeiden.
    2. Ändern Sie das mESC-Wachstumsmedium täglich für ein besseres Wachstum von A2lox und 129.
    3. Wenn die Zellen 80% Zusammenfluss erreichen, entfernen Sie das Medium und fügen Sie 1 ml 0,1% Trypsin in die Schale. Sanft für 30 s schaukeln, um eine gleichmäßige Abdeckung von Trypsin auf allen Zellen zu gewährleisten.
    4. Lassen Sie die Zellen für etwa 1 min zu trypsinizeund dann entfernen Sie das Trypsin mit 1 ml Pipette.
    5. Fügen Sie 2 ml mL mESC Wachstumsmedium auf die Schale, Pipette nach oben und unten mehrmals, um eine einzellige Suspension zu machen.
    6. Zählen Sie die Dichte der Zellen in der Suspension so genau wie möglich mit Hämozytometer.
    7. Teilen Sie die Zellen in 7 Gruppen auf und induzieren Sie eine Differenzierung anhand verschiedener Protokolle, die in Tabelle 1dargestellt sind.

2. Differenzierung von mESCs zu NPCs (Phase I)

  1. 0,1% gelatinebeschichtete Zellkulturplatten oder Decklippen zubereiten.
    1. Vor Gebrauch 0,1% gelatinebeschichtete 6-Well-Platten oder Decklippen wie in Schritt 1.1 zubereiten.
  2. Phase-I-Differenzierung mit Protokoll 1 (Tabelle 1)
    1. Samen ca. 2 x 104 mESCs in 2 ml Basaldifferenzierungsmedium I pro Brunnen in den 0,1% gelatinebeschichteten 6-Well-Platten. Überprüfen Sie die Zelldichte unter dem Mikroskop.
    2. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator für 6 h, um eine Anhaftung zu ermöglichen.
    3. Nach der Anhaftung nehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator heraus und waschen Sie die Zellen zweimal mit 2 ml PBS.
    4. Fügen Sie jedem Brunnen 2 ml Basaldifferenzierungsmedium I (Tabelle 1) hinzu und legen Sie die Zellen wieder in den Inkubator.
    5. Lassen Sie die Zellen für 8 Tage zur Differenzierung. Ersetzen Sie das Basaldifferenzierungsmedium I alle 2 Tage.
  3. Phase-I-Differenzierung mit Protokoll 2 (Tabelle 1)
    1. Fügen Sie 1,5 x 106 mESCs in eine nicht klebende bakterielle Schale in 10 ml Basaldifferenzierungsmedium I ein, um die embryoide Körperbildung bei 37 °C in einem 5%CO2-Inkubator zu ermöglichen.
    2. Nach 2 Tagen zellische Aggregate in 15 ml Zentrifugenrohre übertragen und durch Schwerkraft absetzen lassen.
    3. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 10 ml frisches Basaldifferenzierungsmedium I hinzu, um die embryoiden Körper wieder auszusetzen. Pflanzen Sie sie in eine neue nicht klebende bakterielle Schale ein und ermöglichen eine Differenzierung für weitere 2 Tage.
    4. Überprüfen Sie die Bildung von embryoiden Körpern unter dem Mikroskop (Abbildung 2A).
    5. Sammeln Sie embryoide Körper, wie in den Schritten 2.3.2-2.3.3 beschrieben. Samen etwa 50 embryoide Körper in 2 ml Basaldifferenzierungsmedium I pro Brunnen auf 0,1% gelatinebeschichtete 6-Well-Platten.
    6. 1 mM All-Trans RA-Lager (in DMSO) vorbereiten und nach der Unterverpackung in einem -80 °C-Gefrierschrank vor dem Licht lagern.
      HINWEIS: RA ist instabil, und es sollte darauf geachtet werden, es von Licht fernzuhalten und den Luftkontakt während der Vorbereitung des RA-Bestands zu reduzieren.
    7. Für die RA-Induktion fügen Sie in jedem Bohrwert 2 L RA-Lager hinzu, um eine Endkonzentration von 1 M zu erreichen.
    8. Legen Sie die Platte bei 37 °C in den 5% CO2-Inkubator und differenzieren Sie sie weitere 4 Tage.
    9. Ändern Sie alle 2 Tage das gesamte 2 ml Basaldifferenzierungsmedium I (mit 1 M RA).
  4. Phase-I-Differenzierung mit Protokoll 3 (Tabelle 1)
    1. 1,5 x 106 mESCs in eine nicht klebende bakterielle Schale in 10 ml Basaldifferenzierungsmedium I pflanzen. 2 Tage für die embryoide Körperbildung bei 37 °C in einem 5%CO2-Inkubator lassen.
    2. Überprüfen Sie die Bildung von embryoiden Körpern unter dem Mikroskop (Abbildung 2B).
    3. Zellaggregate in 15 ml Zentrifugenrohre übertragen und durch Schwerkraft absetzen lassen.
    4. Entfernen Sie den Überstand sorgfältig und fügen Sie 10 ml frisches Basaldifferenzierungsmedium I hinzu, um sie wieder auszusetzen.
    5. Säen Sie etwa 50 embryoide Körper in 2 ml Basaldifferenzierungsmedium I pro Brunnen auf 0,1% gelatinebeschichtete 6-Well-Platten.
    6. Für die RA-Induktion fügen Sie in jedem Bohrwert 2 L RA-Lager hinzu, um eine Endkonzentration von 1 M zu erreichen.
    7. Legen Sie die Platte bei 37 °C in den 5% CO2-Inkubator und differenzieren Sie sie für weitere 6 Tage. Ändern Sie alle 2 Tage das gesamte Basaldifferenzierungsmedium I (mit 1 M RA).
  5. Phase-I-Differenzierung mit Protokoll 4 (Tabelle 1)
    1. Samen ca. 2 x 104 mESCs innerhalb von 2 ml Basaldifferenzierungsmedium I pro Brunnen auf die 0,1% gelatinebeschichteten 6-Well-Platten. Legen Sie die Platte bei 37 °C in den 5% CO2-Inkubator, um eine Befestigung für 6 h zu ermöglichen.
    2. Nach der Befestigung die Zellen zweimal mit 2 ml PBS waschen. Fügen Sie jeweils 2 ml Basaldifferenzierungsmedium I zu jedem Brunnen hinzu und lassen Sie eine Differenzierung für 4 Tage im 5% CO2-Inkubator bei 37 °C zu.
    3. Für die RA-Induktion fügen Sie jedem Bohrgut 2 L All-Trans-RA-Bestand (die Arbeitskonzentration beträgt 1 M) hinzu, um weitere 4 Tage differenzierungzuregen.
    4. Ersetzen Sie im gesamten Prozess alle 2 Tage das gesamte Medium.
  6. Phase-I-Differenzierung mit Protokoll 5 (Tabelle 1)
    1. Samen ca. 2 x 104 mESCs innerhalb von 2 ml Basaldifferenzierungsmedium I pro Brunnen auf die 0,1% gelatinebeschichteten 6-Well-Platten. Legen Sie die Platte bei 37 °C in den 5% CO2-Inkubator, um eine Befestigung für 6 h zu ermöglichen.
    2. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 2 ml PBS. Fügen Sie jeweils 2 ml Basaldifferenzierungsmedium I zu jedem Brunnen hinzu und lassen Sie eine Differenzierung für 2 Tage im 5% CO2-Inkubator bei 37 °C zu.
    3. Für die anschließende RA-Induktion fügen Sie jedem Bohrkörper 2 L RA-Bestand hinzu, um eine Endkonzentration von 1 m zu erreichen. Legen Sie die Platte bei 37 °C in den 5% CO2-Inkubator, um für weitere 6 Tage eine Differenzierung zu induzieren.
    4. Ersetzen Sie im gesamten Prozess alle 2 Tage das gesamte Medium.
  7. Phase-I-Differenzierung mit Protokoll 6 (Tabelle 1)
    1. 1,5 x 106 mESCs in eine nicht klebende bakterielle Schale in 10 ml N2B27 Medium II(Tabelle 1) pflanzen, um die Bildung embryoider Körper zu ermöglichen.
    2. Sammeln Sie am2. Tag die in den Schritten 2.3.2-2.3.3 beschriebenen Zellaggregate und setzen Sie die embryoiden Körper mit 10 ml frischem N2B27-Medium II wieder aus.
    3. Pflanzen Sie sie in eine neue nicht klebende bakterielle Schale ein und lassen Sie sie für weitere 2 Tage im 5% CO2-Inkubator bei 37 °C differenzierungen. Überprüfen Sie die Bildung von embryoiden Körpern unter dem Mikroskop.
    4. Sammeln Sie am4. Tag embryoide Körper. Samen etwa 50 embryoide Körper pro Brunnen auf 0,1% gelatinebeschichtete 6-Well-Platten mit 2 ml N2B27 Medium II.
    5. Fügen Sie in jedem Brunnen 2 L All-Trans-RA-Bestände hinzu und induzieren Sie weitere 4 Tage Differenzierung. Ersetzen Sie das gesamte Medium (N2B27 medium II mit 1 M RA) alle zwei Tage.
  8. Phase-I-Differenzierung mit Protokoll 7 (Tabelle 1)
    1. Samen ca. 2 x 104 mESCs innerhalb von 2 ml Basaldifferenzierungsmedium I pro Brunnen auf die 0,1% gelatinebeschichteten 6-Well-Platten. Legen Sie die Platte bei 37 °C in den 5% CO2-Inkubator, um eine Befestigung für 6 h zu ermöglichen.
    2. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Dann fügen Sie 2 ml N2B27 medium II zu jedem Brunnen hinzu und lassen Sie eine Differenzierung für 8 Tage bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator zu.
    3. Ändern Sie das gesamte N2B27 Medium II alle 2 Tage.

3. Zellmorphologie Beobachtung

  1. Überprüfen Sie den Differenzierungsstatus der oben genannten 7 Gruppen täglich unter einem invertierten Phasenkontrastlichtmikroskop.
  2. Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip mindestens 12 Felder aus, und nehmen Sie Fotos auf, um die morphologischen Veränderungen jeder Gruppe auf D8 aufzuzeichnen.

4. Immunfluoreszenzfärbung

  1. Probenvorbereitung: Seed mESCs auf 0,1% gelatinebeschichteten Abdeckungen und ermöglichen eine Differenzierung für 8 Tage unter Verwendung der in Schritt 2 genannten Protokolle.
  2. Spülen: Am8. Tag die Proben aus dem Inkubator nehmen und das Differenzierungsmedium durch Aspiration entfernen. Spülen Sie die Zellen einmal mit 1 ml PBS für 5 min.
  3. Fixierung: Fügen Sie 1 ml 4% Paraformaldehyd zu jeder Probe hinzu und fixieren Sie die Zellen für 20 min bei Raumtemperatur (RT).
  4. Spülen: Spülen Sie die Zellen nach der Fixierung mit 1 ml PBS 3 mal, jeweils 5 min.
  5. Permeabilisierung: Fügen Sie 1 ml 0,2% TritonX-100 in PBS zu jeder Probe hinzu und lassen Sie sie 8 min bei RT.
  6. Spülen: Spülen Sie die Zellen nach permeabilisieren der Zellen mit 1 ml PBS 3 mal, jeweils 5 min.
  7. Blockierung: Fügen Sie 1 ml 10% Ziegenserum in PBS zu jeder Probe hinzu und inkubieren Sie bei RT für 1 h, um alle unspezifischen Wechselwirkungen zu blockieren.
  8. Inkubation mit primärem Antikörper
    1. Verdünnen Sie den Anti-Nestin-Antikörper im Verhältnis 1:100 mit 5% Ziegenserum in PBS.
    2. 500 l verdünnter Antikörper auf verschiedene Proben auftragen und über Nacht bei 4 °C inkubieren.
  9. Spülen: Entfernen Sie den Antikörper und spülen Sie die Proben vorsichtig mit 1 ml PBS 3 mal für jeweils 8 min.
  10. Inkubation mit Sekundärantikörper
    1. Verdünnen Sie das Alexa Fluor 488-markierte Ziegenanti-Maus-IgG im Verhältnis 1:500 mit 5% Ziegenserum in PBS.
    2. 500 l verdünnter Antikörper auf verschiedene Proben auftragen und bei RT 2 h im Dunkeln brüten.
      HINWEIS: Führen Sie nach dem Auftragen eines fluoreszierenden Sekundärantikörpers alle nachfolgenden Schritte im Dunkeln aus, um eine Fluoreszenzabschreckung zu verhindern.
  11. Spülen: Entfernen Sie den sekundären Antikörper und spülen Sie die Proben vorsichtig mit 1 ml PBS 3 mal für jeweils 8 min.
  12. Nukleare Färbung und Montage
    1. Legen Sie einen Tropfen DAPI-Montagemedium auf den sauberen Mikroschlitten.
    2. Nehmen Sie die Proben vorsichtig von den Platten ab und legen Sie die Probe mit der Zelle nach unten auf das DAPI-Montagemedium. Lassen Sie im Dunkeln für 5 min bei RT.
    3. Entfernen Sie überschüssiges DAPI-Montagemedium mit saugfähigem Papier.
  13. Fluoreszenzmikroskopische Beobachtung
    1. Stellen Sie die Proben unter die Fluoreszenzmikroskopie und erkennen Sie das Signal für DAPI und Alexa Fluor 488 mit geeigneten Filtern.
    2. Wählen Sie gleichmäßig und zufällig 10-15 verschiedene visuelle Felder für jedes Sample aus und zeichnen Sie die Bilder mit einer CCD-Kamera auf.

5. Differenzierung von NPCs zu Neuronen (Phase II)

  1. Bereiten Sie mESC-Derivate nach Phase-I-Differenzierung nach Protokoll 3 (8 Tage, Tabelle 1) vor, wie in Schritt 2.4 beschrieben, das die höchste Differenzierungseffizienz hat (siehe Abbildung 3).
    HINWEIS: Nach der Phase-I-Differenzierung sollte die Qualitätskontrolle mit Hilfe der oben genannten Zellmorphologiebeobachtung und Immunfluoreszenz-Assay durchgeführt werden, um eine gesunde und ertragreiche NPCs zu gewährleisten.
  2. Samen ca. 5 x 105 mESC-Derivate innerhalb von 2 ml Basaldifferenzierungsmedium I pro Brunnen auf die 0,1% gelatinebeschichteten 6-Well-Platten. Teilen Sie die mESC-Derivate nach dem Zufallsprinzip in 3 Gruppen auf, wie Phase II-Protokoll 1, Protokoll 2 und Protokoll 3.
  3. Legen Sie die Platte bei 37 °C in den 5% CO2-Inkubator, um eine Befestigung für 6 h zu ermöglichen. Waschen Sie sie zweimal mit 2 ml PBS.
  4. Fügen Sie 2 ml Basaldifferenzierungsmedium I, N2B27 Medium I und N2B27 Medium II (Tabelle 2) zu jedem Brunnen der oben genannten Gruppen hinzu.
  5. Legen Sie die Platten in den Inkubator und lassen Sie für weitere 10 Tage unterscheiden. Ändern Sie das entsprechende Medium alle 2 Tage.
  6. Überprüfen Sie den Differenzierungsstatus und zeichnen Sie die morphologischen Veränderungen auf, wie in Schritt 3 erwähnt.
  7. Bewerten Sie am 18. Tag die Erzeugung von Neuronen (β-Tubulin III positiv) und bestimmen Sie die Differenzierungseffizienz der 3 Protokolle unter Verwendung von Schritt 4.

Ergebnisse

2-Tage embryoide Körperbildung + 6-Tage-RA-Induktion funktioniert am besten bei der Unterscheidung von mESCs in NPCs (Phase I). Um das optimale Protokoll zu bestimmen, das die Differenzierung von mESCs in NPCs (Phase I) am besten fördert, wurden 7 Protokolle sowohl auf A2lox als auch auf 129 mESCs (Tabelle 1) getestet und der Differenzierungsstatus jeder Gruppe mit Lichtmikroskop überwacht. Wie in Abbildung 3Adargestellt, zeigten die meisten A2lox- und 129-Derivate unter ...

Diskussion

In der vorliegenden Studie haben wir eine einfache und effektive Methode zur neuronalen Differenzierung von mESCs mit kostengünstigen und leicht zu erhaltenden Materialien etabliert. Bei dieser Methode können 2 Tage embryoiden Körperbildung gefolgt von 6 Tagen RA-Induktion die Differenzierung von mESCs in NPCs wirksam fördern (Phase I-Protokoll 3). Für die Phase-II-Differenzierung induzieren N2B27 Medium II (Phase II-Protokoll 3) am effektivsten die Differenzierung von NPCs in Neuronen. Um den Erfolg zu gewährleist...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 31501099) und der Middle-aged and Young of the Education Department of Hubei Province, China (Nr. Q20191104). Und wir danken Professor Wensheng Deng von der Wuhan University of Science and Technology für die Bereitstellung der mausembryonalen Stammzelllinien A2lox.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-Nestin antibody [Rat-401]AbcamAb11306stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbitSigma AldrichT2200stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgGBeyotimeA0428stored at -20 °C and protect from light
B-27 Supplement (50X), serum freeGibco17504044stored at -20 °C, and protect from light
CHIR-99021 (CT99021)SelleckS1263stored at -20 °C
CoverslipsNEST801007
Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgGBeyotimeA0516stored at -20 °C and protect from light
DME/F-12 1:1 (1x)HyCloneSH30023.01Bstored at 4 °C
Fetal bovine serumHyCloneSH30084.03stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Fluorescence microscopyOlympusCKX53
GelatinGibcoCM0635Bstored at room temperature
GlutaMAX SupplementGibco35050061stored at 4 °C
Immunol Staining Primary Antibody dilution BufferBeyotimeP0103stored at 4 °C
KnockOut DMEM/F-12Gibco12660012stored at 4 °C
KnockOut Serum ReplacementGibco10828028stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Leukemia Inhibitory Factor humanSigmaL5283stored at -20 °C
Mounting Medium With DAPI - Aqueous, FluoroshieldAbcamab104139stored at 4 °C and protect from light
MEM Non-essential amino acids solutionGibco11140076stored at 4 °C
N-2 Supplement (100X)Gibco17502048stored at -20 °C and protect from light
Normal goat serumJackson005-000-121stored at -20 °C
Neurobasal MediumGibco21103049stored at 4 °C
Nonadhesive bacterial dishCorning3262
Phosphate Buffered Saline (1X)HyCloneSH30256.01Bstored at 4 °C
Penicillin/ Streptomycin SolutionHyCloneSV30010stored at 4 °C
PD0325901(Mirdametinib)SelleckS1036stored at -20 °C
Retinoic acidSigmaR2625stored at -80 °C and protect from light
Strain 129 Mouse Embryonic Stem CellsCyagenMUAES-01001Maintained in feeder-free culture system
Stem-Cellbanker (DMSO free)ZENOAQstem cellbanker DMSO freestored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Trypsin 0.25% (1X) SolutionHyCloneSH30042.01stored at 4 °C
Triton X-100SigmaT8787
2-MercaptoethanolGibco21985023stored at 4 °C and protect from light
4% paraformaldehydeBeyotimeP0098stored at -20 °C
6 - well plateCorning3516
60 mm cell culture dishCorning430166
15 ml centrifuge tubeNUNC339650

Referenzen

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