Differenziazione neuronale dalle cellule staminali embrionali del topo in vitro

Riepilogo

Qui, abbiamo stabilito un metodo a basso costo e facile da usare che indirizza una differenziazione rapida ed efficiente dalle cellule staminali embrionali ai neuroni. Questo metodo è adatto per la popolarità tra i laboratori e può essere uno strumento utile per la ricerca neurologica.

Abstract

La differenziazione neurale delle cellule staminali embrionali del topo (mESC) è un potenziale strumento per chiarire i meccanismi chiave coinvolti nella neurogenesi e potenzialmente aiutare nella medicina rigenerativa. Qui, abbiamo stabilito un metodo efficiente e a basso costo per la differenziazione neuronale dagli mESC invitro, utilizzando la strategia dello screening combinatorio. Nelle condizioni qui definite, la formazione del corpo embrionale di 2 giorni + il protocollo di induzione dell'acido retinoico di 6 giorni consente una differenziazione rapida ed efficiente dagli MESC alle cellule precursori neurali (NPC), come visto dalla formazione di derivati A2lox e 129 ben impilati e simili a neurite che sono positivi alla Nestin. Lo stato sano dei corpi embrioidi e il momento in cui viene applicato l'acido retinoico (RA), così come le concentrazioni di RA, sono fondamentali nel processo. Nella successiva differenziazione dai NPC ai neuroni, N2B27 medium II (integrato da mezzo neurobasale) potrebbe supportare meglio il mantenimento e la maturazione a lungo termine delle cellule neuronali. Il metodo presentato è altamente efficienza, a basso costo e facile da usare e può essere un potente strumento per la neurobiologia e la ricerca sulla biologia dello sviluppo.

Introduzione

Le cellule staminali embrionali (ESC) sono pluripotenti e possono differenziarsi in cellule precursori neurali (NPC) e successivamente in neuroni in determinate condizioni¹. La neurogenesi basata su ESC fornisce la migliore piattaforma per imitare la neurogenesi, fungendo così da strumento utile per gli studi di biologia dello sviluppo e potenzialmente aiutare nella medicina^{rigenerativa 2,3}. Negli ultimi decenni, sono state riportate molte strategie per indurre la neurogenesi embrionale, come il metodo transgenico^{4, utilizzando}piccole^{molecole 5,}utilizzando un microambiente a matrice 3D⁶e la tecnica di co-coltura⁷. Tuttavia, la maggior parte di questi protocolli sono condizioni limitate o difficili da usare, quindi non sono adatti per l'uso nella maggior parte dei laboratori.

Per trovare un metodo facile da usare e a basso costo per ottenere un'efficiente differenziazione neurale dagli MESC, qui è stata utilizzata una strategia di screening combinatorio. Come descritto nella figura 1, l'intero processo di neurogenesi embrionale è stato diviso in 2 fasi. La fase I si riferisce al processo di differenziazione dagli mESC ai PNG, e la fase II si riferisce alla successiva differenziazione dai PNG ai neuroni. Sulla base dei principi di facile funzionamento, basso costo, materiali facilmente disponibili e alta efficienza di differenziazione, sono stati scelti sette protocolli nella fase I e tre protocolli nella fase II in base al tradizionale sistema di coltura monostrato aderente o al sistema di formazione del corpo embrionale^8,9. L'efficienza di differenziazione dei protocolli in entrambe le fasi è stata valutata utilizzando l'osservazione della morfologia cellulare e il test di immunofluorescenza. Combinando il protocollo più efficiente di ogni fase, abbiamo stabilito il metodo ottimizzato per la differenziazione neurale dagli mESC.

Protocollo

1. Coltura delle cellule staminali embrionali del topo

1. Preparare piatti o piatti di coltura cellulare ricoperti di gelatina 0,1%.
   1. Aggiungere 2 mL di gelatina sterilizzata allo 0,1% (0,1% w/v in acqua) a piatti di coltura cellulare da 60 mm. Dondolare delicatamente per garantire un rivestimento uniforme delle stoviglie di coltura cellulare.
   2. Mettere i piatti in un incubatore di CO_{2 al 5%} a 37 °C e lasciare il rivestimento per 1 h.
   3. Rimuovere la soluzione di gelatina allo 0,1% prima di seminare le cellule.
      NOTA: Dopo aver rimosso la gelatina, non è necessario asciugare o lavare i piatti rivestiti.
2. Coltura delle cellule staminali embrionali del topo (A2lox e 129)
   1. Incubare le cellule mESC (A2lox e 129) nell'incubatore di coltura cellulare 0,1% rivestito di gelatina da 60 mm in un mezzo di crescita mESC rispettivamente a 37 °C in un incubatore di CO_{2 al 5%.} Il mezzo di crescita mESC è costituito per l'85% da DMEM/F12, per il 15% da sostituti del siero knock-out (KSR), per 0,1 mM β-mercaptoetanolo (2ME), 2 mM glutaMAX, 1% amminoacido non essenziale (NEAA), 1% penicillina/streptomicina (P/S), 1000 U/mL fattore inibitorio della leucemia (LIF), 10 nM CHIR-99021 (inibitore GSK-3) e 0,33 nM PD0325901 (inibitore MEK).
      ATTENZIONE: β-mercaptoetanolo è infiammabile e presenta tossicità per inalazione. Tenere lontano dalle fonti di fuoco e indossare una maschera per evitare l'inalazione durante l'uso.
   2. Cambia quotidianamente il mezzo di crescita mESC per una migliore crescita di A2lox e 129.
   3. Quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza, rimuovere il mezzo e aggiungere 1 mL dello 0,1% di tripside al piatto. Dondolare delicatamente per 30 s per garantire una copertura uniforme della tripside su tutte le cellule.
   4. Lasciare le celle per circa 1 minuto per tripinaree quindi rimuovere la tripina utilizzando pipetta da 1 mL.
   5. Aggiungere più volte 2 mL di mezzo di crescita mESC al piatto, pipetta su e giù più volte per effettuare una sospensione a cella singola.
   6. Contare la densità delle cellule nella sospensione nel modo più accurato possibile usando l'emocitometro.
   7. Dividere le celle in 7 gruppi e indurre la differenziazione utilizzando protocolli diversi indicati nella tabella 1.

2. Differenziazione dai MESC ai PNG (fase I)

1. Preparare 0,1% piatti di coltura cellulare rivestiti di gelatina o coverlips.
   1. Prima dell'uso, preparare 0,1% di gelatina rivestita con 6 piastre o coverlips come nel passaggio 1.1.
2. Differenziazione della fase I mediante protocollo n. 1(tabella 1)
   1. Seme circa 2 x 10⁴ mESC in 2 mL di mezzo di differenziazione basale I per pozzo nelle piastre a 6 pozzetti rivestite con gelatina allo 0,1%. Controllare la densità cellulare al microscopio.
   2. Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore di CO_{2 al 5%} per 6 ore per consentire l'attacco.
   3. Dopo l'attacco, eserti dalle cellule dall'incubatrice e lavare le cellule due volte con 2 mL di PBS.
   4. Aggiungere 2 mL di mezzo di differenziazione basale I (Tabella 1) a ciascun pozzo e rimettere le cellule nell'incubatrice.
   5. Lasciare le cellule per la differenziazione per 8 giorni. Sostituire il mezzo di differenziazione basale I ogni 2 giorni.
3. Differenziazione della fase I mediante protocollo n. 2(tabella 1)
   1. Aggiungere 1,5 x 10⁶ mESC in un piatto batterico non adeso in 10 mL di mezzo di differenziazione basale I per consentire la formazione del corpo embrionale a 37 °C in un incubatore di CO_{2 al 5%.}
   2. Dopo 2 giorni, trasferire gli aggregati cellulari in tubi di centrifuga da 15 ml e lasciarli depositare per gravità.
   3. Rimuovere il supernatante e aggiungere 10 mL di mezzo di differenziazione basale fresco I per risospendire i corpi embrioidi. Ripiantarli in un nuovo piatto batterico non adeso e consentire la differenziazione per altri 2 giorni.
   4. Controllare la formazione di corpi embrioidi al microscopio (Figura 2A).
   5. Raccogliere corpi embrio embrioni come descritto nei passaggi 2.3.2-2.3.3. Semina circa 50 corpi embriobi in 2 mL di mezzo di differenziazione basale I per pozzo su piastre a 6 porci ricoperte di gelatina allo 0,1%.
   6. Preparare 1 mM di materiale RA tutto trans (in DMSO) e conservare lontano dalla luce in un congelatore a -80 °C dopo il sub-imballaggio.
      NOTA: RA è instabile e si dovrebbe prestare attenzione a tenerlo lontano dalla luce e ridurre il contatto con l'aria durante la preparazione del materiale RA.
   7. Per l'induzione RA, aggiungere 2 μL di materiale RA in ogni pozzo per effettuare una concentrazione finale di 1 μM.
   8. Posizionare la piastra nell'incubatore di CO_{2 al 5%} a 37 °C e differenziare per altri 4 giorni.
   9. Cambiare l'intero mezzo di differenziazione basale I (con 1 μM RA) ogni 2 giorni.
4. Differenziazione della fase I mediante protocollo n. 3(tabella 1)
   1. Piantare 1,5 x 10⁶ mESC in un piatto batterico non adeso in 10 mL di mezzo di differenziazione basale I. Lasciare per 2 giorni per la formazione del corpo embrionale a 37 °C in un incubatore di CO_{2 al 5%.}
   2. Controllare la formazione di corpi embrioidi al microscopio (Figura 2B).
   3. Trasferire gli aggregati cellulari in tubi di centrifuga da 15 ml e lasciarli depositare per gravità.
   4. Rimuovere con cura il supernatante e aggiungere 10 mL di mezzo di differenziazione basale fresco I per risospendirli.
   5. Seminare circa 50 corpi embrioidi in 2 mL di mezzo di differenziazione basale I per pozzo su piastre a 6 porci ricoperte di gelatina allo 0,1%.
   6. Per l'induzione RA, aggiungere 2 μL di materiale RA in ogni pozzo per effettuare una concentrazione finale di 1 μM.
   7. Posizionare la piastra nell'incubatore di CO_{2 al 5%} a 37 °C e differenziare per altri 6 giorni. Cambiare l'intero mezzo di differenziazione basale I (con 1 μM RA) ogni 2 giorni.
5. Differenziazione della fase I mediante protocollo n. 4(tabella 1)
   1. Seme circa 2 x 10⁴ mESC entro 2 mL dal mezzo di differenziazione basale I per pozzo sulle piastre a 6 pozzetti rivestite con gelatina allo 0,1%. Posizionare la piastra nell'incubatore di CO_{2 al 5%} a 37 °C per consentire l'attacco per 6 ore.
   2. Dopo l'attacco, lavare le celle due volte con 2 mL di PBS. Aggiungere 2 mL di mezzo di differenziazione basale I ad ogni pozzo e consentire la differenziazione per 4 giorni nell'incubatore di CO_{2 al 5%} a 37 °C.
   3. Per l'induzione RA, aggiungere 2 μL di materiale RA completamente trans in ogni pozzo (la concentrazione di lavoro è di 1 μM) per indurre la differenziazione per altri 4 giorni.
   4. Nell'intero processo, sostituire l'intero mezzo ogni 2 giorni.
6. Differenziazione della fase I mediante protocollo n. 5(tabella 1)
   1. Seme circa 2 x 10⁴ mESC entro 2 mL dal mezzo di differenziazione basale I per pozzo sulle piastre a 6 pozzetti rivestite con gelatina allo 0,1%. Posizionare la piastra nell'incubatore di CO_{2 al 5%} a 37 °C per consentire l'attacco per 6 ore.
   2. Lavare le cellule due volte con 2 mL di PBS. Aggiungere 2 mL di mezzo di differenziazione basale I ad ogni pozzo e consentire la differenziazione per 2 giorni nell'incubatore di CO_{2 al 5%} a 37 °C.
   3. Per la successiva induzione RA, aggiungere 2 μL di materiale RA in ogni pozzo per effettuare una concentrazione finale di 1 μM. Posizionare la piastra nell'incubatore di CO_{2 del 5%} a 37 °C per indurre la differenziazione per altri 6 giorni.
   4. Nell'intero processo, sostituire l'intero mezzo ogni 2 giorni.
7. Differenziazione della fase I mediante protocollo n. 6(tabella 1)
   1. Piantare 1,5 x 10⁶ mESC in una piastra batterica non adesiva in 10 mL di N2B27 medium II(tabella 1)per consentire la formazione di corpi embrioidi.
   2. Il 2^{° giorno,} raccogliere gli aggregati cellulari come descritto nei passaggi 2.3.2-2.3.3 e resuspend i corpi embrioidi utilizzando 10 mL di N2B27 medio II fresco.
   3. Ripiantarli in un nuovo piatto batterico non adeso e consentire la differenziazione per altri 2 giorni nell'incubatore di CO_{2 al 5%} a 37 °C. Controllare la formazione di corpi embrioidi al microscopio.
   4. Il 4,^raccogliere corpi embrionale. Semina circa 50 corpi embriombrioidi per pozzo su piatti a 6 po 'rivestiti di gelatina 0,1% con 2 mL di N2B27 medium II.
   5. Aggiungere 2 μL di materiale RA completamente trans in ogni pozzo e indurre la differenziazione per altri 4 giorni. Sostituire l'intero mezzo (N2B27 medium II con 1 μM RA) ogni due giorni.
8. Differenziazione della fase I mediante protocollo n. 7(tabella 1)
   1. Seme circa 2 x 10⁴ mESC entro 2 mL dal mezzo di differenziazione basale I per pozzo sulle piastre a 6 pozzetti rivestite con gelatina allo 0,1%. Posizionare la piastra nell'incubatore di CO_{2 al 5%} a 37 °C per consentire l'attacco per 6 ore.
   2. Lavare le celle due volte con PBS. Quindi, aggiungere 2 mL di N2B27 medium II ad ogni pozzo e consentire la differenziazione per 8 giorni a 37 °C in un incubatore di CO_{2 al 5%.}
   3. Cambiare l'intero N2B27 medium II ogni 2 giorni.

3. Osservazione della morfologia cellulare

1. Controllare lo stato di differenziazione dei suddetti 7 gruppi al giorno sotto un microscopio a contrasto di fase invertito.
2. Seleziona casualmente almeno 12 campi e scatta foto per registrare i cambiamenti morfologici di ogni gruppo su D8.

4. Colorazione immunofluorescenza

1. Preparazione del campione: Semi mESC su coverlips rivestiti di gelatina allo 0,1% e consentire la differenziazione per 8 giorni utilizzando i protocolli menzionati nella fase 2.
2. Risciacquo: L'8 ° giorno, prelevare i campioni dall'incubatore e rimuovere il mezzo di differenziazione per aspirazione. Risciacquare delicatamente le cellule una volta con 1 mL di PBS per 5 minuti.
3. Fissazione: Aggiungere 1 mL di paraformaldeide al 4% a ciascun campione e fissare le cellule per 20 minuti a temperatura ambiente (RT).
4. Risciacquo: Dopo la fissazione, sciacquare delicatamente le cellule con 1 mL di PBS 3 volte, per 5 minuti ciascuna.
5. Permeabilizzazione: Aggiungere 1 mL dello 0,2% di TritonX-100 in PBS a ciascun campione e lasciare per 8 minuti a RT.
6. Risciacquo: Dopo la permeabilità, sciacquare delicatamente le cellule con 1 mL di PBS 3 volte, per 5 minuti ciascuna.
7. Blocco: Aggiungere 1 mL di siero di capra al 10% in PBS a ciascun campione e incubare a RT per 1 h per bloccare eventuali interazioni non specifiche.
8. Incubazione con anticorpo primario
   1. Diluire l'anticorpo anti-nestina con un rapporto di 1:100 usando il 5% di siero di capra in PBS.
   2. Applicare 500 μL di anticorpi diluiti su diversi campioni e incubare durante la notte a 4 °C.
9. Risciacquare: Rimuovere l'anticorpo e risciacquare delicatamente i campioni con 1 mL di PBS 3 volte per 8 minuti ciascuno.
10. Incubazione con anticorpo secondario
    1. Diluire l'IgG anti-topo di capra etichettato Alexa Fluor 488 con un rapporto di 1:500 usando il 5% di siero di capra in PBS.
    2. Applicare 500 μL di anticorpo diluito su diversi campioni e incubare al buio per 2 ore a RT.
       NOTA: Dopo aver applicato anticorpi secondari fluorescenti, eseguire tutti i passaggi successivi al buio per evitare la tempra a fluorescenza.
11. Risciacquare: Rimuovere l'anticorpo secondario e risciacquare delicatamente i campioni con 1 mL di PBS 3 volte per 8 minuti ciascuno.
12. Colorazione e montaggio nucleare
    1. Posizionare una goccia di supporto di montaggio DAPI sul microslide pulito.
    2. Eslevare con cura i campioni dalle piastre e posizionare il campione sopra il supporto di montaggio DAPI con la cella a faccia in giù. Lasciare al buio per 5 minuti a RT.
    3. Rimuovere il mezzo di montaggio DAPI in eccesso con carta assorbente.
13. Osservazione della microscopia a fluorescenza
    1. Posizionare i campioni sotto la microscopia a fluorescenza e rilevare il segnale per DAPI e Alexa Fluor 488 utilizzando filtri adeguati.
    2. Scegli in modo uniforme e casuale 10-15 campi visivi diversi per ogni campione e registra le immagini con una fotocamera CCD.

5. Differenziazione dai PNG ai neuroni (Fase II)

1. Preparare i derivati mESC nell'ambito della differenziazione di fase I utilizzando il protocollo 3 (8giorni, tabella 1 ) come descritto nella fase 2.4, che ha la massima efficienza di differenziazione (cfr. figura 3).
   NOTA: Dopo la differenziazione della fase I, il controllo di qualità deve essere effettuato utilizzando l'osservazione della morfologia cellulare e il saggio di immunofluorescenza sopra menzionato, per garantire un NPC sano e ad alto rendimento.
2. Seme circa 5 x 10⁵ derivati mESC entro 2 mL dal mezzo di differenziazione basale I per pozzo sulle piastre a 6 porci rivestite con gelatina allo 0,1%. Dividi casualmente le derivate mESC in 3 gruppi, rispettivamente come protocollo di fase II 1, protocollo 2 e protocollo 3.
3. Posizionare la piastra nell'incubatore di CO_{2 al 5%} a 37 °C per consentire l'attacco per 6 ore. Lavarli due volte con 2 mL di PBS.
4. Aggiungere 2 mL di mezzo di differenziazione basale I, N2B27 medio I e N2B27 medio II (tabella 2), rispettivamente, a ciascun pozzo dei gruppi di cui sopra.
5. Posizionare le piastre nell'incubatore e lasciare differenziare per altri 10 giorni. Cambiare il mezzo corrispondente ogni 2 giorni.
6. Controllare lo stato di differenziazione e registrare i cambiamenti morfologici come menzionato nel passaggio 3.
7. Il giorno 18, valutare la generazione di neuroni (β-Tubulina III positivo) e determinare l'efficienza di differenziazione dei 3 protocolli utilizzando nel passaggio 4.

Risultati

La formazione del corpo embrionale di 2 giorni + l'induzione ra di 6 giorni funziona meglio per dirigere la differenziazione degli MESC in NPC (Fase I). Per determinare il protocollo ottimale che promuove meglio la differenziazione degli MESC in NPC (fase I), sono stati testati 7 protocolli sia su A2lox che su 129 mESC(tabella 1)e lo stato di differenziazione di ciascun gruppo è stato monitorato utilizzando il microscopio a luce. Come mostrato nella figura 3A, la maggior pa...

Discussione

Nel presente studio, abbiamo stabilito un metodo semplice ed efficace per la differenziazione neuronale dagli mESC, con materiali a basso costo e facilmente ostruibili. In questo metodo, 2 giorni di formazione del corpo embrionale seguiti da 6 giorni di induzione ra possono promuovere efficacemente la differenziazione degli MESC in NPC (protocollo di fase I 3). Per la differenziazione di fase II, N2B27 medium II (Phase II-protocol 3) induce più efficacemente la differenziazione dai PNG ai neuroni. Per garantire il succe...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Nestin antibody [Rat-401]	Abcam	Ab11306	stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit	Sigma Aldrich	T2200	stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG	Beyotime	A0428	stored at -20 °C and protect from light
B-27 Supplement (50X), serum free	Gibco	17504044	stored at -20 °C, and protect from light
CHIR-99021 (CT99021)	Selleck	S1263	stored at -20 °C
Coverslips	NEST	801007
Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG	Beyotime	A0516	stored at -20 °C and protect from light
DME/F-12 1:1 (1x)	HyClone	SH30023.01B	stored at 4 °C
Fetal bovine serum	HyClone	SH30084.03	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Fluorescence microscopy	Olympus	CKX53
Gelatin	Gibco	CM0635B	stored at room temperature
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	stored at 4 °C
Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer	Beyotime	P0103	stored at 4 °C
KnockOut DMEM/F-12	Gibco	12660012	stored at 4 °C
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828028	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Leukemia Inhibitory Factor human	Sigma	L5283	stored at -20 °C
Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield	Abcam	ab104139	stored at 4 °C and protect from light
MEM Non-essential amino acids solution	Gibco	11140076	stored at 4 °C
N-2 Supplement (100X)	Gibco	17502048	stored at -20 °C and protect from light
Normal goat serum	Jackson	005-000-121	stored at -20 °C
Neurobasal Medium	Gibco	21103049	stored at 4 °C
Nonadhesive bacterial dish	Corning	3262
Phosphate Buffered Saline (1X)	HyClone	SH30256.01B	stored at 4 °C
Penicillin/ Streptomycin Solution	HyClone	SV30010	stored at 4 °C
PD0325901(Mirdametinib)	Selleck	S1036	stored at -20 °C
Retinoic acid	Sigma	R2625	stored at -80 °C and protect from light
Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells	Cyagen	MUAES-01001	Maintained in feeder-free culture system
Stem-Cellbanker (DMSO free)	ZENOAQ	stem cellbanker DMSO free	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Trypsin 0.25% (1X) Solution	HyClone	SH30042.01	stored at 4 °C
Triton X-100	Sigma	T8787
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023	stored at 4 °C and protect from light
4% paraformaldehyde	Beyotime	P0098	stored at -20 °C
6 - well plate	Corning	3516
60 mm cell culture dish	Corning	430166
15 ml centrifuge tube	NUNC	339650