JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Erratum Notice
  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Erratum
  • Reprints and Permissions

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Summary

يسلط البروتوكول الموصوف هنا الضوء على الخطوات الرئيسية في التمييز بين الخلايا البطانية الشبيهة بالدماغ المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات ، وإعداد النيسرية السحائية للعدوى ، وجمع العينات للتحليلات الجزيئية الأخرى.

Abstract

التهاب السحايا بالمكورات السحائية هو عدوى تهدد الحياة تحدث عندما تتمكن النيسرية السحائية (المكورات السحائية ، نانومتر) من الوصول إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS) عن طريق اختراق الخلايا البطانية الدماغية عالية التخصص (BECs). نظرا لأن Nm هو ممرض خاص بالإنسان ، فإن عدم وجود أنظمة نموذجية قوية في الجسم الحي يجعل دراسة التفاعلات بين المضيف والممرض بين Nm و BECs أمرا صعبا ويؤسس الحاجة إلى نموذج قائم على الإنسان يحاكي BECs الأصلية. تمتلك BECs خصائص حاجز أكثر إحكاما عند مقارنتها بالخلايا البطانية المحيطية التي تتميز بتقاطعات ضيقة معقدة ومقاومة كهربائية مرتفعة عبر البطانة (TEER). ومع ذلك ، فإن العديد من النماذج في المختبر ، مثل BECs الأولية و BECs الخالدة ، إما تفتقر أو تفقد خصائصها الحاجزة بسرعة بعد إزالتها من البيئة المكروية العصبية الأصلية. طورت التطورات الحديثة في تقنيات الخلايا الجذعية البشرية طرقا لاشتقاق الخلايا البطانية الشبيهة بالدماغ من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) التي تعمل على تحسين BECs الظاهرية عند مقارنتها بالنماذج البشرية الأخرى في المختبر . إن استخدام BECs المشتقة من iPSC (iPSC-BECs) لنمذجة تفاعل Nm-BEC له فائدة في استخدام الخلايا البشرية التي تمتلك خصائص حاجز BEC ، ويمكن استخدامه لفحص تدمير الحاجز ، والتنشيط المناعي الفطري ، والتفاعل البكتيري. نوضح هنا كيفية اشتقاق iPSC-BECs من iPSCs بالإضافة إلى التحضير البكتيري والعدوى وجمع العينات للتحليل.

Introduction

الحاجز الدموي الدماغي (BBB) ، وحاجز الدم السحائي CSF (mBCSFB) عبارة عن حواجز خلوية ضيقة للغاية تفصل الدورة الدموية عن الجهاز العصبي المركزي (CNS) وتتكون بشكل أساسي من خلايا بطانة الدماغ عالية التخصص (BECs)1,2. معا ، تحافظ BECs على توازن الدماغ المناسب من خلال تنظيم العناصر الغذائية ومنتجات النفايات داخل وخارج الدماغ ، مع استبعاد العديد من السموم والأدوية ومسببات الأمراض 1,2. يحدث التهاب السحايا الجرثومي عندما تكون البكتيريا المنقولة بالدم قادرة على التفاعل مع الحاجز الذي تشكله BECs واختراقه وتسبب الالتهاب. النيسرية السحائية (Nm، المكورات السحائية) هي بكتيريا سالبة الجرام تستعمر الأنفية من 10-40٪ من الأفراد الأصحاء، ولكن في بعض الحالات يمكن أن تسبب مرضا جهازيا خطيرا3. في الأفراد المصابين ، يمكن أن يتمكن Nm من الوصول إلى مجرى الدم حيث يمكن أن يسبب فرفرية خاطفة وكذلك اختراق BECs للوصول إلى الجهاز العصبي المركزي مما يسبب التهاب السحايا3. Nm هو السبب الرئيسي لالتهاب السحايا الجرثومي في جميع أنحاء العالم ، وعلى الرغم من جهود التطعيم ، لا يزال السبب الرئيسي لالتهاب السحايا4. التدخل الطبي الحديث ، مثل العلاج بالمضادات الحيوية ، جعل هذه الظروف قابلة للبقاء على قيد الحياة ، ولكن المصابين بالتهاب السحايا غالبا ما يتركون مع تلف عصبي دائم 5,6.

حددت الدراسات السابقة العوامل البكتيرية وإشارات المضيف التي تساهم في تفاعلات Nm-BEC7،8،9،10،11. تم إجراء الالتصاقات والغزوات المحددة مثل بروتين العتامة Opc ، والنوع الرابع من البيلي ، بالإضافة إلى مستقبلات مثل CD147 ، على نماذج BEC المختلفة في المختبر ، ولكن هذه النماذج تفتقر إلى العديد من خصائص BBB المحددة7،9،11،12. لا يزال الفهم الكامل لتفاعلات Nm-BEC بعيد المنال ويرجع ذلك جزئيا إلى عدم القدرة على استخدام النماذج في الجسم الحي ، وحماية التطعيم غير الكاملة ، ونقص نماذج BEC البشرية القوية في المختبر.

كانت نمذجة hBECs في المختبر صعبة بسبب الخصائص الفريدة ل BECs. بالمقارنة مع الخلايا البطانية المحيطية ، تحتوي BECs على عدد من الأنماط الظاهرية التي تعزز خصائص حاجزها مثل المقاومة الكهربائية العالية عبر البطانية (TEER) بسبب التقاطعات الضيقةالمعقدة 12. بمجرد إزالتها من البيئة المكروية للدماغ ، تفقد BECs بسرعة خصائصها الحاجزة التي تحد من فائدة النماذج الأولية أو الخالدة في المختبر التي تشكل فقط حاجزا ضعيفا12,13. إن الجمع بين الخصوصية البشرية للعدوى ب Nm ، وعدم وجود نماذج قوية في الجسم الحي ، والتحديات التي تواجه نمذجة BECs البشرية في المختبر يخلق حاجة إلى نماذج أفضل لفهم التفاعل المعقد بين المضيف والممرض بين Nm و BECs. في الآونة الأخيرة ، باستخدام تقنيات الخلايا الجذعية متعددة القدرات (iPSC) النموذجية التي يسببها الإنسان ، تم اشتقاق الخلايا الشبيهة ب BEC من iPSCs التي تحاكي بشكل أفضل BECs في الجسم الحي12،13،14،15. iPSC-BECs من أصل بشري ، وقابلة للتطوير بسهولة ، وتمتلك الأنماط الظاهرية المتوقعة ل BEC مقارنة بنظيراتها الأولية أو الخالدة12،13،14،15. بالإضافة إلى ذلك ، أثبتنا نحن وآخرون أن iPSC-BECs مفيدة لنمذجة الأمراض المختلفة للجهاز العصبي المركزي مثل التفاعل بين المضيف والممرض ، ومرض هنتنغتون ، ونقص MCT8 الذي يسبب متلازمة آلان هورندون دادلي16،17،18،19،20،21. نوضح هنا كيفية اشتقاق iPSC-BECs من مصادر iPSC المتجددة وإصابة iPSC-BECs ب Nm مما يؤدي إلى تنشيط الاستجابة المناعية الفطرية. نعتقد أن هذا النموذج مفيد لاستجواب التفاعل بين المضيف ومسبب المرض الذي لا يمكن تلخيصه في نماذج أخرى في المختبر ، وهو مفيد بشكل خاص عند فحص التفاعلات مع مسببات الأمراض البشرية المحددة مثل Nm.

Protocol

ملاحظة: تم تكييف جميع وسائل الإعلام / تحضير الكاشف ، وصيانة الخلايا الجذعية ، وخطوات التمايز من Stebbins et al.22.

1. إعداد المواد اللازمة لثقافة iPSC وتمايز BEC.

  1. طلاء مصفوفة من البلاستيك زراعة الأنسجة (TC) لثقافة IMR90-4 iPSC
    1. هلام مصفوفة الغشاء القاعدي القسمة (على سبيل المثال ، Matrigel) إلى 2.5 ملغ من القسامات وتخزينها في -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: اعمل بسرعة عند التعامل مع هلام المصفوفة والقسمة على الثلج ، حيث إنها تشكل مادة هلامية أعلى من 4 درجات مئوية ولا يمكن أن تكون معدلة بمجرد أن تتصلب.
    2. لطلاء بلاستيك TC ، أضف بسرعة حصة واحدة من هلام المصفوفة إلى 30 مل من وسيط النسر المعدل (DMEM) / F12 من Dulbecco في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. أضف 1 مل من الوسط إلى هلام المصفوفة المجمد ، والماصة لأعلى ولأسفل حتى يذوب ، وانقلها على الفور إلى الأنبوب المخروطي سعة 50 مل مع الوسط المتبقي.
    3. استخدم 1 مل من محلول طلاء الهلام المصفوفة هذا لكل بئر من صفيحة 6 آبار و 12 مل لكل قارورة T75.
      ملاحظة: يمكن تحضير بلاستيك TC المطلي بالهلام المصفوفي لمدة تصل إلى أسبوعين قبل استخدامه. ومع ذلك ، من الأهمية بمكان تجنب جفاف محلول هلام المصفوفة ، الأمر الذي قد يتطلب إضافة المزيد من DMEM / F12 من حين لآخر فوق الآبار.
  2. تحضير وسط صيانة الخلايا الجذعية عن طريق إضافة 50 مل من مكمل 50x إلى 450 مل من الوسط القاعدي لصيانة الخلايا الجذعية في البيئة المعقمة لخزانة السلامة الحيوية.
    ملاحظة: تم استخدام وسائط صيانة الخلايا الجذعية الأخرى (mTeSR و E8) في دراسات أخرى 13،14،15 ، 22،23،24،25.
  3. لتحضير 500 مل من الوسط غير المشروط (UM) ، امزج 392.5 مل من DMEM / F12 مع 100 مل من استبدال المصل بالضربة القاضية (KOSR) ، و 5 مل من الأحماض الأمينية غير الأساسية ، و L-glutamine بتركيز نهائي قدره 1 mM ، و 3.5 ميكرولتر من β-mercaptoethanol. قم بتعقيمه وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع.
  4. لتحضير 200 مل من وسط الخلايا البطانية (EC) بالإضافة إلى حمض الريتينويك (RA) بالإضافة إلى bFGF ، ادمج 198 مل من الوسط الخالي من مصل البطانة البشرية (hESFM) ، و 2 مل من المصل المشتق من الصفائح الدموية المعقم بالترشيح (PDS) ، و 20 نانوغرام / مل bFGF. قم بتعقيمه وتخزينه لمدة تصل إلى 2 أسابيع عند 4 درجات مئوية. قبل الإضافة إلى الخلايا مباشرة ، أضف 10 ميكرومتر من RA إلى وسط EC.
    ملاحظة: نظرا لإيقاف PDS وبالتالي قد يكون محدودا ، فقد تم إجراء هذا البروتوكول بنجاح باستخدام B27 بدلا من PDS15،23،26.
  5. لتحضير 200 مل من وسط EC بدون RA أو bFGF ، اجمع بين 198 مل من hESFM و 2 مل من PDS المعقم بالمرشح وتعقيم المرشح. يحفظ لمدة تصل إلى 4 أسابيع عند 4 درجات مئوية.

2. صيانة IMR90-4 ثقافة الخلية

ملاحظة: هنا نستخدم خط الخلايا IMR90-4 كمثال ، ولكن تم استخدام خطوط الخلايا الجذعية الأخرى المستحثة متعددة القدرات مثل CC3 و CD10 و CD12 و DF19-9-11T و 83iCTR و 00iCTR و CS03iCTRn2 بنجاح للتمايز إلى BECs 13،14،15،16،17،23،27،28.

  1. استزراع iPSCs عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 ويتم الاحتفاظ به عادة على ألواح 6 آبار بكثافات مختلفة مع2 مل من وسط صيانة الخلايا الجذعية لكل بئر.
  2. للحفاظ على ثقافة iPSC ، حدد بئرا واحدا للمرور غير متلاقى وله مسافات مفتوحة بين المستعمرات.
    1. نضح وسط الاستزراع ، أضف 1 مل من كاشف تفكك الخلايا غير الأنزيمية ، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 7 دقائق. أثناء الحضانة ، استبدل محلول هلام المصفوفة ، على لوحة جديدة من 6 آبار ، ب 2 مل من وسط صيانة الخلايا الجذعية الطازجة لكل بئر.
    2. قم بشفط كاشف تفكك الخلايا غير الأنزيمية بعناية مع الحرص على عدم نضح الخلايا التي لا تزال متصلة باللوحة.
    3. أضف 6 مل من وسط صيانة الخلايا الجذعية واشطف قاع البئر عدة مرات حتى تنفصل جميع الخلايا تماما. بعد ذلك ، قم بزرع اللوحة الجديدة المكونة من 6 آبار بكثافات متفاوتة ، عادة 1: 6 أو 1:12 للصيانة العادية.
      ملاحظة: باستخدام النسب المذكورة أعلاه ، يتم تقسيم الخلايا مرتين في الأسبوع تقريبا.
    4. حرك اللوحة إلى الحاضنة ووزع الخلايا المصنفة بالتساوي عبر الآبار عن طريق هز اللوحة ذهابا وإيابا ومن اليسار إلى اليمين ، والتوقف مؤقتا بين حركات الاهتزاز المتناوبة حتى يستقر الوسط.

3. تمايز الخلايا البطانية للدماغ عن iPSCs البشرية

  1. طلاء iPSCs للتمايز (اليوم -3 من بروتوكول التمايز)
    1. لكل IMR90-4 ثقافة صيانة تستخدم جيدا للوحة التمايز ، ونضح وسط الثقافة ، وإضافة 1 مل من كاشف تفكك الخلايا الأنزيمية لكل بئر ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
    2. قم بتعطيل كاشف تفكك الخلايا الأنزيمية عن طريق نقل 1 مل من معلق الخلية المنفصلة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل مع 2 مل على الأقل من وسط صيانة الخلايا الجذعية الطازجة لكل 1 مل من الخلايا. قم بتدوير تعليق الخلية عند 1500 × جم لمدة 5 دقائق.
    3. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من وسط صيانة الخلايا الجذعية لكل بئر من خلايا IMR90-4 المستخدمة ، وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم.
      ملاحظة: قد يكون من المفيد تخفيف 1: 1 باستخدام 0.4٪ تريبان أزرق للتمييز بين الخلايا الحية والميتة عند العد. اعتمادا على كثافة iPSCs ، عادة ما ينتج بئر واحد من لوحة6 آبار 1-10 6 خلايا.
    4. للتمايز في دورق T75 ، أضف 7.5 × 105 خلايا إلى 12 مل من وسط صيانة الخلايا الجذعية ومثبط ROCK (Y27632 ثنائي هيدروكلوريد) بتركيز نهائي يبلغ 10 ميكرومتر. نضح محلول طلاء هلام مصفوفة من قارورة T75 ونقل تعليق الخلية إلى القارورة. قم بتوزيع الخلايا بالتساوي عن طريق هز القارورة ذهابا وإيابا ومن اليسار إلى اليمين (انظر الخطوة 2.2.4) واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
      ملاحظة: من الأهمية بمكان إضافة مثبط ROCK في هذه الخطوة لتعزيز بقاء الخلايا الجذعية المفردة المنفصلة25,29. يجب توزيع الخلايا بالتساوي عبر القارورة وفي مفردات تظهر مورفولوجيا منتشرة تشبه اللحمة المتوسطة بسبب علاج مثبطات ROCK22.
  2. في اليوم -2 واليوم -1 ، قم بتغيير الوسائط إلى وسيط صيانة الخلايا الجذعية الجديدة ؛ 12 مل لكل T75.
  3. في اليوم 0 ، ابدأ التمايز عن طريق تغيير الوسائط إلى UM ؛ 12 مل لكل T75.
  4. قم بتغيير UM يوميا (اليوم 1 - اليوم 5).
    ملاحظة: تصل الخلايا عادة إلى نقطة التقاء بعد 2 إلى 3 أيام في UM ، والتي يمكن ملاحظتها بالعين المجردة أو من خلال مجهر المجال الساطع المقلوب. مع تقدم التمايز ، تصبح "المسالك العصبية" nestin + مرئية مع خلايا PECAM-1 + بينهما كما هو موضح سابقا13,14.
  5. قم بتوسيع عدد الخلايا البطانية بشكل انتقائي عن طريق التبديل إلى وسط EC مع 20 نانوغرام / مل bFGF و 10 ميكرومتر حمض الريتينويك (RA) (اليوم 6) والحضانة لمدة يومين. يمكن تحضير وسط EC مع bFGF قبل أسبوعين من ذلك. يضاف RA من المخزون المجمد في يوم الاستخدام (على سبيل المثال ، 1 ميكرولتر من مخزون RA 10 mM لكل 1 مل من EC + bFGF).
    ملاحظة: يمكن أيضا تحقيق التمايز الناجح دون مكملات التهاب المفاصل الروماتويدي في اليومين 6 و 8. ومع ذلك ، فإن إغفال RA سيؤدي إلى BECs مع انخفاض TEER12،13،14.
  6. لوحات زراعة خلايا معطف وإدراج غشاء (على سبيل المثال ، Transwell) مع الكولاجين IV و fibronectin (اليوم 7) ، لتنقية BECs والتجارب التالية.
    1. لطلاء حشوات الغشاء ، امزج 4 أجزاء من الكولاجين الوريدي (1 مجم / مل في 0.5 مجم / مل من حمض الأسيتيك) ، وجزء واحد من الفبرونيكتين (1 مجم / مل) و 5 أجزاء من الماء المعقم من درجة الأنسجة. يمكن تخفيف محلول ECM بنسبة 1: 5 لطلاء ألواح زراعة الخلايا (أي 4 أجزاء من الكولاجين الرابع ، 1 جزء من الفبرونيكتين ، 45 جزءا من الماء). احتضان بمحلول طلاء عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
      ملاحظة: يمكن أيضا طلاء الألواح وحشوات الغشاء لمدة 4 ساعات على الأقل قبل الزراعة الفرعية في نفس يوم خطوة التنقية.
  7. تنقية BECs عن طريق زراعة الخلايا المتمايزة على الكولاجين الوريدي والصفائح المغلفة بالفبرونيكتين أو إدخالات الغشاء (اليوم 8).
    1. نضح وسط EC وإضافة كاشف تفكك الخلايا الأنزيمية (12 مل لكل T75). احتضان عند 37 درجة مئوية حتى تنفصل 90٪ من الخلايا عن القارورة.
      ملاحظة: يمكن أن يستغرق تفكك الخلايا ما يصل إلى 1 ساعة.
    2. خلال فترة الحضانة ، قم بإزالة محلول طلاء الكولاجين الوريدي / الفبرونيكتين من الألواح / الحشوات المعدة مسبقا واتركها تجف في غطاء معقم. يستغرق الأمر حوالي 20 دقيقة حتى تجف الحشوات.
    3. بمجرد انفصال الخلايا ، اغسلها من القارورة باستخدام ماصة سعة 10 مل. ماصة صعودا وهبوطا لتحقيق تعليق خلية واحدة.
      ملاحظة: يعد التعليق أحادي الخلية مهما لعد الخلايا بشكل موثوق ولتحقيق طبقة أحادية صلبة.
    4. تمييع مع حجم متساو على الأقل من hESFM الطازجة في أنبوب مخروطي 50 مل وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم.
    5. حبيبات الخلايا في 1500 × غرام لمدة 10 دقائق.
    6. أعد تعليق الخلايا في الحجم المناسب من EC + bFGF + RA المحضرة حديثا لتحقيق تعليق 2 × 106 خلايا / مل للبذر على إدخالات الغشاء. أضف 500 ميكرولتر (1 × 106 خلايا) فوق ملحق 12 بئرا و 1.5 مل من وسط EC + bFGF + RA في الأسفل. للبذر على ألواح 24 و 48 بئرا ، قم بتخفيف تعليق الخلية 1: 2 وإضافة 500 ميكرولتر (5 × 10 5 خلايا) و 250 ميكرولتر (2.5 × 105 خلايا) لكل بئر ، على التوالي. قم بتوزيع الخلايا بالتساوي عبر البئر / الإدراج (انظر الخطوة 2.2.4) واحتضانها عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2.
  8. قم بتغيير الوسائط على الألواح / الإرسال إلى EC بدون bFGF أو RA (اليوم 9).
  9. قم بإجراء تجارب العدوى ، وقياس TEER ، وتلطيخ التألق المناعي كما هو موضح في الأقسام التالية (اليوم 10).
    ملاحظة: عادة ما تصل BECs المتمايزة والمنقاة بنجاح إلى ذروة TEER في اليوم 10 وتعبر عن علامات مميزة للخلايا البطانية للدماغ مثل PECAM-1 (CD31) و VE-cadherin ، وناقل الجلوكوز GLUT-1 ، وناقلات التدفق مثل p-glycoprotein ، ومكونات الوصلات الضيقة ZO-1 و Occludin و Claudin-5 13،14،16،17،19،22. ارجع إلى Lippmann et al. و Stebbins et al. وآخرون للحصول على مزيد من التفاصيل والصور لأنواع الخلايا والأشكال والتعبير عن العلامات الخاصة بنوع الخلية أثناء عملية التمايز13،14،15،16،17،19،22. يمكن العثور على صور تمثيلية لخلايا IMR90-4 في مراحل مختلفة من عملية تمايز BEC في الشكل التكميلي 1.

4. المقاومة الكهربائية عبر بطانة الرحم (TEER) كمقياس لضيق الحاجز

ملاحظة: عادة ما يقرأ TEER على إدخالات الغشاء في اليومين 9 و 10 من التمايز لتأكيد التوليد الناجح للحاجز الذي يشكل iPSC-BECs (الشكل 1A).

  1. ضع مقياس الفولت-أوم الظهاري (EVOM) في البيئة المعقمة لغطاء السلامة الحيوية وقم بتوصيل القطب ب EVOM.
  2. قم بتطهير القطب عن طريق غمره في 70٪ EtOH لمدة 5 دقائق على الأقل واتركه يجف تماما.
    ملاحظة: حضانة أطول في 70٪ EtOH أو إزالة التلوث من القطب باستخدام محلول هيبوكلوريت 5٪ ممكن إذا لزم الأمر.
  3. استرجع iPSC-BECs على إدخالات الغشاء من الحاضنة وقم بقياس TEER.
    ملاحظة: من المهم قراءة TEER بسرعة بعد إزالتها من الحاضنة لأن تغير درجة الحرارة قد يؤثر على قياس TEER.
  4. اقرأ TEER عن طريق غمس القطب في الوسط بحيث يتم وضع القطب الأقصر أعلى الملحق ويصل القطب الأطول إلى الوسط المحيط بالإدخال.
    ملاحظة: تأكد من أن الأقطاب الكهربائية الموجودة على أطراف "عيدان تناول الطعام" مغطاة بالكامل بالسائل. إذا لزم الأمر ، قم بإمالة البئر لتحقيق ذلك قبل وضع اللوحة مرة أخرى للقياس.

5. تلطيخ المناعي (IF) للتحقق من صحة النمط الظاهري BEC

ملاحظة: للتحقق من جودة الخلايا المتمايزة والمنقاة بالكامل، يتم تلطيخ الطبقات الأحادية iPSC-BEC للعلامات المميزة للخلايا البطانية للدماغ في اليوم العاشر من عملية التمايز كما هو موضح سابقا (الشكل 1B\u2012G) 13،14،15،16،17،19،22.

  1. نضح المتوسطة وغسل 1x مع برنامج تلفزيوني.
  2. ثبت الخلايا بالميثانول البارد المثلج في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 15 دقيقة.
  3. اغسل 3x بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) وكتله بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) في PBS في RT لمدة 1 ساعة.
  4. نضح وإضافة الأجسام المضادة الأولية المخففة في حل حجب. احتضان في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: ارجع إلى جدول المواد و Stebbins et al. للحصول على معلومات تتعلق بمصدر وتخفيف الأجسام المضادة22.
  5. اغسل 3x باستخدام برنامج تلفزيوني قبل إضافة الأجسام المضادة الثانوية المخففة في محلول الحظر. احتضان في RT لمدة 1 ساعة. حماية العينات من الضوء من هذه النقطة فصاعدا.
  6. اغسل 2x مع برنامج تلفزيوني. ثم أضف DAPI بتخفيف 1: 5,000 في PBS وصمة عار في RT لمدة 15 دقيقة.
  7. اغسل 1x مع ترك PBS قيد التشغيل والتقط الصور باستخدام مجهر مضان.

6. تحضير البكتيريا وعدوى iPSC-BECs

  1. في اليوم السابق لتجربة العدوى (اليوم 9 من التمايز) ، ابدأ زراعة البكتيريا بين عشية وضحاها من المخزون المجمد. للعدوى ب Nm ، قم بخط البكتيريا على أجار كولومبيا بنسبة 5٪ من دم الأغنام (أجار الدم). احتضان المزارع البكتيرية في 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO2 بين عشية وضحاها.
  2. في اليوم التالي (اليوم 10) ، قم بإعداد PPM + طازج عن طريق استكمال وسائط البروتياز الببتون (PPM) ب 50 ميكرولتر من 2 M MgCl 2 ، و 50 ميكرولتر من2 M NaHCO3 ، و 100 ميكرولتر مكمل Kellogg لكل 10 مل. قم بتلقيح 10 مل من وسط PPM + في أنبوب مخروطي سعة 50 مل مع نيوتن متر من لوحة الاستزراع الليلي باستخدام قطعة قطن معقمة. احتضان الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة (أي حتى تصبح البكتيريا في مرحلة النمو اللوغاريتمي).
  3. أثناء الحضانة البكتيرية ، قم بإعداد iPSC-BECs في لوحة 24 بئرا أو على إدخالات غشائية للعدوى عن طريق استبدال الوسط القديم ب 400 ميكرولتر من وسط EC الطازج (بدون bFGF أو RA) لكل بئر / أعلى إدخال الغشاء.
  4. ثقافة بكتيرية بالطرد المركزي عند 4000 × جم لمدة 10 دقائق ونضح الوسائط. أعد تعليق الحبيبات البكتيرية في 250 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
  5. في 4 مل من برنامج تلفزيوني طازج ، استخدم جزءا من تعليق الخلايا البكتيرية واضبط على OD600 من 0.4 (حوالي 1 × 108 CFU / mL).
  6. بعد ذلك ، قم بتخفيف البكتيريا في وسط زراعة الخلايا (وسط EC) وفقا لتعدد العدوى المطلوب (MOI).
    ملاحظة: على سبيل المثال ، بالنسبة ل MOI من 10 ، قم بتخفيف 1:10 أو 1: 5 عند إصابة iPSC-BECs في لوحة 24 بئرا أو على إدخالات غشائية ، على التوالي (1 × 105 خلايا لكل طبقة أحادية في لوحة 24 بئرا). لم يتم تضمين إضافة المصل البشري في تحضير نانومتر للعدوى كما هو موضح في مخطوطات أخرى حيث لوحظ أن لها تأثيرا ضارا على النمط الظاهري لحاجز iPSC-BEC كما تم قياسه بواسطة TEER (البيانات غير معروضة) 30,31. ومع ذلك ، فإن تفاعل Nm و iPSC-BECs لا يتأثر بمصل بشري أو بدونه (البيانات غير معروضة).
  7. تصيب iPSC-BECs في كل بئر ب 100 ميكرولتر من معلق البكتيريا المحضر وتحتضنها في الوقت المطلوب للعدوى.
    ملاحظة: يرتفع التعبير عن عدد من السيتوكينات والكيموكينات المسببة للالتهابات في iPSC-BECs عند الإصابة ب Nm ، وبشكل بارز بعد 8 ساعات من العدوى كما هو موضح سابقا من قبل Martins-Gomes et al (الشكل 2) 19.

7. التنشيط المناعي الفطري عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي

ملاحظة: باستخدام عزل الحمض النووي الريبي المفضل ، وتخليق cDNA ، وبروتوكول qPCR ، قم بجمع العينات وتشغيل qPCR على السيتوكينات المحددة.

  1. 7.1. جمع الحمض النووي الريبي من عينات BEC بعد الإصابة في اليوم 10 من بروتوكول التمايز ، باستخدام الكواشف تشكل مجموعة عزل الحمض النووي الريبي المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: تجنب تلوث العينات بالنوكلياز من خلال العمل بعناية في بيئة نظيفة ومعقمة.
    1. قم بإعداد مخزن التحلل المؤقت وأضف 350 ميكرولتر إلى كل بئر / طبقة أحادية من iPSC-BECs.
    2. اجمع العينات عن طريق السحب لأعلى ولأسفل عدة مرات (على سبيل المثال ، 20x) ونقل التعليق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم.
      ملاحظة: يمكن تخزين العينات في -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة لعزل الحمض النووي الريبي.
    3. اتبع البروتوكول المرفق مع مجموعة عزل الحمض النووي الريبي لتنقية الحمض النووي الريبي من الخلايا والأنسجة المزروعة.
    4. بعد الشطف في الماء الخالي من النيوكلياز ، احتفظ بعينات الحمض النووي الريبي على الجليد لتقليل أي نشاط محتمل ل RNase.
    5. تقدير تركيزات الحمض النووي الريبي على مقياس الطيف الضوئي (على سبيل المثال ، Nanodrop).
  2. قم بإنشاء مكتبة cDNA من الحمض النووي الريبي الذي تم جمعه باستخدام مجموعة تخليق cDNA (انظر جدول المواد).
    1. قم بإعداد تفاعلات تتكون من مزيج رئيسي لتخليق cDNA ، على الأقل 200 نانوغرام (من الناحية المثالية 500 نانوغرام) من عينة الحمض النووي الريبي ، والماء الخالي من النيوكلياز في حجم تفاعل إجمالي محدد كما هو موضح في بروتوكول مجموعة تخليق cDNA.
    2. على جهاز تدوير حراري قياسي ، قم بتشغيل برنامج مناسب لكواشف مجموعة تخليق cDNA المستخدمة. على سبيل المثال: 25 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
    3. بعد التوليف ، قم بتخفيف cDNA حتى 1:10 في الماء الخالي من النيوكلياز وانقل العينات إلى 4 درجات مئوية على المدى القصير أو -20 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل.
      ملاحظة: قد يكون التخفيف المنخفض ضروريا إذا كان تركيز الحمض النووي الريبي منخفضا (على سبيل المثال ، أقل من 50 نانوغرام). يمكن تخزين cDNA المخفف عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى عام.
  3. قم بإجراء qPCR على عينات cDNA التي تستهدف نسخ جينات الاستجابة المناعية الفطرية مثل السيتوكينات والكيموكينات باستخدام مواد أولية مصممة بعناية ومعتمدة من صحتها.
    ملاحظة: نظرا لأن تصميم التمهيدي مهم جدا لجودة نتائج qPCR ، يجب اختبار كفاءة التمهيدي لإجراء سلسلة تخفيف ويجب تأكيد عدم وجود منتجات متعددة على هلام الحمض النووي.
    1. لكل تفاعل 25 ميكرولتر ، استخدم 0.5 ميكرولتر أمامي و 0.5 ميكرولتر عكسي التمهيدي (10 مللي مول في الماء الخالي من النيوكلياز) ، 1 ميكرولتر cDNA ، 10.5 ميكرولتر من النيوكلياز الخالي من H2O ، و 12.5 ميكرولتر qPCR المزيج الرئيسي.
    2. قم بإجراء التفاعل على جهاز qPCR باستخدام بروتوكول cycler التالي: (أ) 4 °C لمدة 2 دقيقة ؛ (ب) 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة؛ (ج) 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية؛ (د) 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة؛ دورة من خلال (ج) و (د) 45 مرة ؛ (ه) منحنى الذوبان الاختياري: 30-99 درجة مئوية بزيادات قدرها 1 درجة مئوية؛ 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    3. لتحليل البيانات ، استخدم حساب ΔΔCT لمقارنة مستويات تعبير السيتوكين والكيموكين بجين التدبير المنزلي المرجعي مثل 18S أو GAPDH.

النتائج

البروتوكول الموصوف هنا مقتبس من Stebbins et al. ويسلط الضوء على عملية التمييز بين iPSCs إلى خلايا بطانية تشبه الدماغ تمتلك خصائص BBB ، وكيفية استخدام هذا النموذج لدراسات العدوى باستخدام iPSC-BECs مع Nm19,22. وعند تمييز المستضدات ثنائية السلسلة ونقاط الضعف والإحصاء، عند تميي...

Discussion

واجهت نمذجة BECs و BBB تحديات ، حيث تميل BECs البشرية الأولية والخالدة ، في المختبر ، إلى الافتقار إلى الأنماط الظاهرية القوية للحواجز. سمح ظهور تقنيات الخلايا الجذعية البشرية بتوليد خلايا شبيهة ب BEC مشتقة من iPSC والتي تحتفظ بالأنماط الظاهرية BBB المميزة المتوقعة مثل العلامات البطانية ، وتعب...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

يتم دعم L.M.E. من خلال برنامج التدريب البحثي DFG GRK2157 بعنوان "نماذج الأنسجة ثلاثية الأبعاد لدراسة الالتهابات الميكروبية بواسطة مسببات الأمراض البشرية" الممنوحة ل A. S-U. يتم دعم BJK من خلال زمالة ما بعد الدكتوراه من قبل مؤسسة Alexander von Humboldt. بالإضافة إلى ذلك ، نعترف ب Lena Wolter لمساعدتها الفنية في إنشاء iPSC-BECs في الثقافة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Accutase (1x)SigmaA6964Enzymatic cell dissociation reagent
Acetic acidSigmaA6283
All-trans retinoic acid (RA)SigmaR2625
Anti-CD31 (PECAM-1)Thermo Scientific (Labvision)RB-10333
Anti-Claudin-5Invitrogen4C3C2
Anti-Glut-1Thermo Scientific (Labvision)SPM498 (MA5-11315)
Anti-OccludinInvitrogen33-1500
Anti-VE-cadherinSanta Cruzsc-52751
Anti-ZO-1Invitrogen33-9100
Bacto Proteose PeptoneBD211684
b-MercaptoethanolMerck (Sigma-Aldrich)805740
Cell culture plates and flasksSarstedt
Centrifuge (Heraeus Megafuge 1.0R)Thermo Scientific
Class II biosafety cabinetNuaireNU-437-400E
CO2 Incubator (DHD Autoflow CO2 Air-Jacketed Incubator)Nuaire
Collagen IVSigmaC5533
Columbia ager + 5 % sheep bloodBiomerieux43049
Costar Transwell polyester filters (12- or 24-well)Corning3460, 3470
D(+)-GlucoseMerck (Sigma-Aldrich)G8270
DAPIInvitrogenD1306
DMEM/F12Gibco31330-038
DMSOROTHA994.1
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)Gibco21600-069
Epithelial Volt-Ohm Meter (Millicell ERS-2) with STX electrodeMerck (Millipore)MERS00002
Fe(NO3)3ROTH5632.1
FibronectinSigmaF1141
Fluoresence microscope (Eclipse Ti)Nikon
Hemacytometer (Neubauer)A. HartensteinZK06
Human basic fibroblast growth factor (bFGF)PeproTech100-18B
Human Endothelial Serum Free Medium (hESFM)Gibco11111-044
Inverted microscope (Wilovert)Hund (Will Wetzlar)
iPS(IMR90)-4 cellsWiCell
Kellogg's supplementTo prepare 110 ml of Kellogg's supplement, prepare 100 ml of 4 g/ml glucose, 0.1 g/ml glutamine, and 0.2 mg/ml thiamine pyrophosphate and 10 ml of 5 mg/ml Fe(NO3)3 and combine the solutions. Filter sterilize and store aliquoted at -20 °C.
Knockout serum replacement (KOSR)Gibco10828-028
L-glutamine (GlutaMAX)Invitrogen35050-038
LunaScript RT SuperMix KitNEBE3010LcDNA synthesis kit
Matrigel MatrixCorning354230
MethanolROTH4627.5
MgCl2ROTHKK36.1
Micropipettes (Research Plus)Eppendorf
NaHCO3ROTH6329
Nonessential amino acids (NEAA)Gibco11140-035
NucleoSpin RNA isolation kitMachery-Nagel740955RNA isolation kit
Pipette boy (Accu-Jet Pro)Brand
Platelet poor plasma-derived serum, bovine (PDS)Fisher50-443-029
PowerUp SYBR Green Master MixApplied BiosystemsA25742qPCR master mix
qPCR film (MicroAmp Optical Adhesive Film)Applied Biosystems4211971
qPCR plates (MicroAmp Fast 96-well)Applied Biosystems4346907
ROCK inhibitor, Y27632 dihydrochlorideTocris1254
RT-PCR thermo cycler (StepOnePlus)Applied Biosystems4376600
Serological pipettesSarstedt
StemFlex basal medium + 50x StemFlex supplementGibcoA3349401Stem-cell maintenance medium
Swinging Bucket Rotor (Heraeus #2704)Thermo Scientific
Thiamine pyrophosphateSigmaC8754-5G
Trypan Blue Solution, 0.4%Gibco15250061
VerseneGibco15040-033Non-enzymatic cell dissociation reagent (EDTA)

References

  1. Rua, R., McGavern, D. B. Advances in Meningeal Immunity. Trends in Molecular Medicine. 24 (6), 542-559 (2018).
  2. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  3. Rouphael, N. G., Stephens, D. S. Neisseria meningitidis: Biology, microbiology, and epidemiology. Methods in Molecular Biology. , (2012).
  4. Stephens, D. S., Greenwood, B., Brandtzaeg, P. Epidemic meningitis, meningococcaemia, and Neisseria meningitidis. Lancet. 369 (9580), 2196-2210 (2007).
  5. Le Guennec, L., Coureuil, M., Nassif, X., Bourdoulous, S. Strategies used by bacterial pathogens to cross the blood-brain barrier. Cellular Microbiology. , (2020).
  6. Doran, K. S., et al. Host-pathogen interactions in bacterial meningitis. Acta Neuropathologica. 131 (2), 185-209 (2016).
  7. Cunha, C. S. E., Griffiths, N. J., Virji, M. Neisseria meningitidis opc invasin binds to the sulphated tyrosines of activated vitronectin to attach to and invade human brain endothelial cells. PLoS Pathogens. , (2010).
  8. Coureuil, M., et al. Meningococcus hijacks a β2-adrenoceptor/β-arrestin pathway to cross brain microvasculature endothelium. Cell. 143 (7), 1149-1160 (2010).
  9. Bernard, S. C., et al. Pathogenic Neisseria meningitidis utilizes CD147 for vascular colonization. Nature Medicine. 20 (7), 725-731 (2014).
  10. Slanina, H., Hebling, S., Hauck, C. R., Schubert-Unkmeir, A. Cell invasion by neisseria meningitidis requires a functional interplay between the focal adhesion kinase, Src and cortactin. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
  11. Unkmeir, A., et al. Fibronectin mediates Opc-dependent internalization of Neisseria meningitidis in human brain microvascular endothelial cells. Molecular Microbiology. 46 (4), 933-946 (2002).
  12. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2015).
  13. Lippmann, E. S., et al. Derivation of Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).
  14. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2014).
  15. Hollmann, E. K., Bailey, A. K., Potharazu, A. V., Neely, M. D., Bowman, A. B., Lippmann, E. S. Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. , (2017).
  16. Kim, B. J., et al. Modeling Group B Streptococcus and Blood-Brain Barrier Interaction by Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells. mSphere. , (2017).
  17. Kim, B. J., et al. Streptococcus agalactiae disrupts P-glycoprotein function in brain endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 26 (2019).
  18. Kim, B. J., Shusta, E. V., Doran, K. S. Past and Current Perspectives in Modeling Bacteria and Blood–Brain Barrier Interactions. Frontiers in Microbiology. , (2019).
  19. Martins Gomes, S. F., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells as a Cellular Model to Study Neisseria meningitidis Infection. Frontiers in Microbiology. , (2019).
  20. Vatine, G. D., et al. Modeling Psychomotor Retardation using iPSCs from MCT8-Deficient Patients Indicates a Prominent Role for the Blood-Brain Barrier. Cell Stem Cell. , (2016).
  21. Lim, R. G., et al. Huntington's Disease iPSC-Derived Brain Microvascular Endothelial Cells Reveal WNT-Mediated Angiogenic and Blood-Brain Barrier Deficits. Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).
  22. Stebbins, M. J., Wilson, H. K., Canfield, S. G., Qian, T., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells. Methods. 101, 93-102 (2016).
  23. Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).
  24. Wilson, H. K., Canfield, S. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Exploring the effects of cell seeding density on the differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. , (2015).
  25. Wilson, H. K., Faubion, M. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Cryopreservation of brain endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells is enhanced by rho-associated coiled coil-containing kinase inhibition. Tissue Engineering - Part C: Methods. , (2016).
  26. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. , (2017).
  27. Sances, S., et al. Human iPSC-Derived Endothelial Cells and Microengineered Organ-Chip Enhance Neuronal Development. Stem Cell Reports. , (2018).
  28. Canfield, S. G., et al. An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Journal of Neurochemistry. , (2017).
  29. Kurosawa, H. Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. , (2012).
  30. Schubert-Unkmeir, A., Sokolova, O., Panzner, U., Eigenthaler, M., Frosch, M. Gene expression pattern in human brain endothelial cells in response to Neisseria meningitidis. Infection and Immunity. 75 (2), 899-914 (2007).
  31. Sokolova, O., et al. Interaction of Neisseria meningitidis with human brain microvascular endothelial cells: Role of MAP- and tyrosine kinases in invasion and inflammatory cytokine release. Cellular Microbiology. 6 (12), 1153-1166 (2004).
  32. Alimonti, J. B., et al. Zika virus crosses an in vitro human blood brain barrier model. Fluids and Barriers of the CNS. , (2018).
  33. Kim, B. J., Schubert-unkmeir, A. In vitro Models for Studying the Interaction of Neisseria meningitidis with Human Brain Endothelial Cells. Neisseria meningitidis: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. 1969, 135-148 (2019).
  34. Kim, B. J., et al. Bacterial induction of Snail1 contributes to blood-brain barrier disruption. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2473-2483 (2015).

Erratum


Formal Correction: Erratum: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells
Posted by JoVE Editors on 10/12/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells Larvae. The Authors section was updated from:

Leo M. Endres1
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama

to:

Leo M. Endres1
Sarah F. Hathcock2
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

TEERBECsBECsiPSCsBECs IPSC IPSC BECs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved