Neisseria meningitidis Infecção de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas Derivadas do Endotélio Cerebral

Resumo

O protocolo aqui descrito destaca as principais etapas na diferenciação de células endoteliais cerebrais derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas, na preparação de Neisseria meningitidis para infecção e na coleta de amostras para outras análises moleculares.

Resumo

A meningite meningocócica é uma infecção com risco de vida que ocorre quando Neisseria meningitidis (meningococo , Nm) pode obter acesso ao sistema nervoso central (SNC) penetrando em células endoteliais cerebrais (CEBs) altamente especializadas. Como Nm é um patógeno humano-específico, a falta de sistemas modelo in vivo robustos torna o estudo das interações patógeno-hospedeiro entre Nm e CEBs desafiador e estabelece a necessidade de um modelo baseado em humanos que imite BECs nativas. As CEBs possuem propriedades de barreira mais apertadas quando comparadas às células endoteliais periféricas, caracterizadas por tight junctions complexas e elevada resistência elétrica transendotelial (TEER). No entanto, muitos modelos in vitro , como as CEBs primárias e as CEBs imortalizadas, não possuem ou perdem rapidamente suas propriedades de barreira após a remoção do microambiente neural nativo. Avanços recentes em tecnologias de células-tronco humanas desenvolveram métodos para derivar células endoteliais cerebrais a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) que melhor fenocopiam as CEBs quando comparadas a outros modelos humanos in vitro . O uso de BECs derivadas de iPSC (iPSC-BECs) para modelar a interação Nm-BEC tem o benefício de usar células humanas que possuem propriedades de barreira BEC e pode ser usado para examinar a destruição de barreira, ativação imune inata e interação bacteriana. Aqui demonstramos como derivar iPSC-BECs de iPSCs, além de preparação bacteriana, infecção e coleta de amostras para análise.

Introdução

A barreira hematoencefálica (BHE) e a barreira meníngea sangue-LCR (mBCSFB) são barreiras celulares extremamente apertadas que separam a circulação do sistema nervoso central (SNC) e são compostas principalmente por células endoteliais cerebrais (CEBs) altamente ^{especializadas1,2}. Juntas, as CEBs mantêm a homeostase cerebral adequada, regulando nutrientes e resíduos dentro e fora do cérebro, enquanto excluem muitas toxinas, drogas e patógenos ^1,2. A meningite bacteriana ocorre quando as bactérias transmitidas pelo sangue são capazes de interagir e penetrar na barreira formada pelas CEBs e causar inflamação. Neisseria meningitidis (Nm, meningococo) é uma bactéria Gram-negativa que coloniza a nasofaringe de 10% a 40% dos indivíduos saudáveis, mas em alguns casos pode causar doença sistêmica grave³. Nos indivíduos afetados, o Nm pode ter acesso à corrente sanguínea, onde pode causar púrpura fulminante, bem como penetrar nas CEBs que têm acesso ao SNC, causando meningite³. O Nm é uma das principais causas de meningite bacteriana em todo o mundo e, apesar dos esforços de vacinação, ainda é uma causa primária de meningite4. A intervenção médica moderna, como o tratamento com antibióticos, tem tornado essas condições sobreviventes, no entanto, aqueles afetados com meningite muitas vezes ficam com danos neurológicos permanentes ^5,6.

Estudos prévios identificaram fatores bacterianos e sinalização do hospedeiro que contribuem para as interações Nm-BEC 7,8,9,10,11. As adesinas e invasinas identificadas, como a proteína de opacidade Opc e pili tipo IV, bem como receptores como CD147, têm sido conduzidas em vários modelos de BEC in vitro, porém esses modelos carecem de muitas propriedades definidoras de BHE7,9,11,12. A compreensão completa das interações Nm-BEC permanece indefinida devido parcialmente à incapacidade de utilizar modelos in vivo, proteção vacinal incompleta e falta de modelos BEC humanos robustos in vitro.

A modelagem de hBECs in vitro tem sido um desafio devido às propriedades únicas das CEBs. Comparadas às células endoteliais periféricas, as CEBs apresentam uma série de fenótipos que potencializam suas propriedades de barreira, como a alta resistência elétrica transendotelial (TEER) devido às tight junctions complexas¹². Uma vez removidas do microambiente cerebral, as CEBs perdem rapidamente suas propriedades de barreira, limitando a utilidade de modelos primários ou imortalizados in vitro, que formam apenas uma barreira fraca^12,13. A combinação da especificidade humana de infecções por Nm, a falta de modelos robustos in vivo e os desafios para modelar as CEBs humanas in vitro criam a necessidade de melhores modelos para entender a complexa interação patógeno-hospedeiro entre Nm e CEBs. Recentemente, utilizando tecnologias modelo de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSC), células semelhantes a ECEC têm sido derivadas de iPSCs que melhor mimetizam as CEBs in vivo^12,13,14,15. As iPSC-BECs são de origem humana, facilmente escaláveis e possuem fenótipos BEC esperados em comparação com suas contrapartes primárias ou imortalizadas^12,13,14,15. Além disso, nós e outros demonstramos que as iPSC-BECs são úteis para modelar várias doenças do SNC, como interação patógeno-hospedeiro, doença de Huntington e deficiência de MCT8 que causa a síndrome de Allan-Hurndon-Dudley16,17,18,19,20,21. Aqui, demonstramos como derivar iPSC-BECs de fontes renováveis de iPSC e a infecção de iPSC-BECs com Nm levando à ativação da resposta imune inata. Acreditamos que este modelo é útil para interrogar a interação patógeno-hospedeiro que não pode ser recapitulada em outros modelos in vitro e é especialmente útil quando examinamos interações com patógenos humanos específicos, como o Nm.

Protocolo

NOTA: Todas as etapas de preparação de meios/reagentes, manutenção de células-tronco e diferenciação são adaptadas de Stebbins et ^al.22.

1. Preparação dos materiais necessários para a cultura iPSC e diferenciação do BEC.

1. Revestimento de matriz de cultura de tecidos (CT) plástico para cultura IMR90-4 iPSC
   1. Alíquota gel de matriz de membrana basal (por exemplo, Matrigel) em alíquotas de 2,5 mg e armazenar a -20 °C.
      NOTA: Trabalhe rapidamente ao manusear o gel de matriz e a alíquota no gelo, pois ele forma um gel acima de 4 °C e não pode ser aliquotado depois de solidificado.
   2. Para o revestimento do plástico TC, adicione rapidamente uma alíquota de gel de matriz a 30 mL do meio Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 da Dulbecco em um tubo cônico de 50 mL. Adicionar 1 mL do meio sobre o gel de matriz congelado, pipetar para cima e para baixo até descongelar e transferir imediatamente para o tubo cônico de 50 mL com o meio restante.
   3. Utilizar 1 ml desta solução de revestimento em gel de matriz por poço de uma placa de 6 poços e 12 ml por frasco T75.
      NOTA: O plástico TC revestido com gel de matriz pode ser preparado até duas semanas antes de ser usado. No entanto, é fundamental evitar que a solução de gel de matriz seque, o que pode exigir a adição ocasional de mais DMEM/F12 no topo dos poços.
2. Preparar o meio de manutenção de células-tronco adicionando 50 mL de suplemento de 50x a 450 mL de meio basal de manutenção de células-tronco no ambiente estéril de um gabinete de biossegurança.
   NOTA: Outros meios de manutenção de células-tronco (mTeSR e E8) foram utilizados em outros estudos13,14,15,22,23,24,25.
3. Para preparar 500 mL de meio não condicionado (UMT), combinar 392,5 mL de DMEM/F12 com 100 mL de reposição sérica knock out (KOSR), 5 mL de aminoácidos não essenciais, L-glutamina na concentração final de 1 mM e 3,5 μL de β-mercaptoetanol. Filtrar-esterilizar e armazenar a 4 °C por até 2 semanas.
4. Para preparar 200 mL de meio de células endoteliais (EC) mais ácido retinóico (RA) mais bFGF, combinar 198 mL de meio livre de soro endotelial humano (hESFM), 2 mL de soro derivado pobre em plaquetas esterilizado por filtro (PDS) e 20 ng/mL de bFGF. Filtrar, esterilizar e armazenar por até 2 semanas a 4 °C. Imediatamente antes da adição às células, adicione 10 μM de RA ao meio EC.
   OBS: Como a PDS foi descontinuada e, portanto, pode ser limitada, este protocolo foi realizado com sucesso usando B27 no lugar da PDS 15,23,26.
5. Para preparar 200 mL de meio EC sem AR ou bFGF, combinar 198 mL de hESFM e 2 mL de PDS esterilizado por filtro e esterilizar por filtro. Conservar até 4 semanas a 4 °C.

2. Manutenção da cultura celular IMR90-4

NOTA: Aqui usamos a linhagem celular IMR90-4 como exemplo, porém outras linhagens de células-tronco pluripotentes induzidas como CC3, CD10, CD12, DF19-9-11T, 83iCTR, 00iCTR e CS03iCTRn2 têm sido empregadas com sucesso para diferenciação em CEBs 13,14,15,16,17,23,27,28.

1. Cultivar iPSCs a 37 °C em 5% CO 2 e tipicamente manter em placas de 6 poços em várias densidades com₂ mL de meio de manutenção de células-tronco por poço.
2. Para manutenção da cultura iPSC, selecione um único poço para passagem que não seja confluente e tenha espaços abertos entre colônias.
   1. Aspirar o meio de cultura, adicionar 1 mL de reagente de dissociação celular não enzimática e incubar a 37 °C por 7 min. Enquanto a incubação estiver em andamento, substitua a solução de gel de matriz, em uma nova placa de 6 poços, por 2 mL de meio de manutenção de células-tronco frescas por poço.
   2. Aspirar cuidadosamente o reagente de dissociação celular não enzimática, tomando cuidado para não aspirar células ainda aderidas à placa.
   3. Adicione 6 mL de meio de manutenção de células-tronco e lave o fundo do poço algumas vezes até que todas as células estejam completamente descoladas. Em seguida, semeie a nova placa de 6 poços com densidades variadas, tipicamente 1:6 ou 1:12 para manutenção normal.
      NOTA: Usando as proporções acima mencionadas, as células são divididas aproximadamente duas vezes por semana.
   4. Mova a placa para a incubadora e distribua as células semeadas igualmente pelos poços, agitando a placa para frente e para trás e da esquerda para a direita, fazendo uma pausa entre os movimentos alternados de agitação até que o meio se instale.

3. Diferenciação de células endoteliais cerebrais de iPSCs humanas

1. Plaeamento de iPSCs para diferenciação (dia -3 do protocolo de diferenciação)
   1. Por cultura de manutenção IMR90-4 bem utilizada para placa para diferenciação, aspirar o meio de cultura, adicionar 1 mL de reagente de dissociação enzimática celular por poço e incubar a 37 °C por 7 min.
   2. Inativar o reagente de dissociação enzimática celular transferindo o 1 mL de suspensão celular dissociada para um tubo cônico de 15 mL com pelo menos 2 mL de meio de manutenção de células-tronco fresco por 1 mL de células. Gire a suspensão da célula a 1.500 x g por 5 min.
   3. Ressuspender o pellet celular em 1 mL de meio de manutenção de células-tronco por poço de células IMR90-4 utilizado e contar as células usando um hemocitômetro.
      NOTA: Pode ser útil diluir 1:1 com 0,4% de azul de tripano para distinguir entre células vivas e mortas durante a contagem. Dependendo da densidade das iPSCs, um poço de uma placa de 6 poços geralmente produz 1\u20122 x 10⁶ células.
   4. Para diferenciação em um frasco T75, adicionar 7,5 x 10⁵ células a 12 mL de meio de manutenção de células-tronco e inibidor de ROCK (dicloridrato de Y27632) na concentração final de 10 μM. Aspirar a solução de revestimento em gel da matriz de um balão T75 e transferir a suspensão celular para o frasco. Distribuir igualmente as células agitando o balão para frente e para trás e da esquerda para a direita (ver passo 2.2.4) e incubar a 37 °C e 5% de CO₂.
      NOTA: É fundamental adicionar inibidor de ROCK nesta etapa para aumentar a sobrevivência das células-tronco isoladas dissociadas^25,29. As células devem ser distribuídas uniformemente pelo frasco e em singlets exibindo morfologia espúrica semelhante à mesenquimais devido ao tratamento com inibidor de ROCK²².
2. No dia -2 e no dia -1, trocar o meio para o meio de manutenção de células-tronco fresco; 12 mL por T75.
3. No dia 0, inicie a diferenciação mudando a mídia para UM; 12 mL por T75.
4. Trocar a UM, diariamente, (dia 1 – dia 5).
   NOTA: As células tipicamente atingem a confluência após 2 a 3 dias na UM, que pode ser observada a olho nu ou através de um microscópio de campo brilhante invertido. À medida que a diferenciação progride, os "tratos neurais" nestina+ tornam-se visíveis com células PECAM-1⁺ entre elas, como descrito anteriormente^13,14.
5. Expandir seletivamente a população de células endoteliais mudando para meio EC com 20 ng/mL de bFGF e 10 μM de ácido retinóico (RA) (dia 6) e incubando por dois dias. O meio CE com bFGF pode ser preparado até duas semanas antes. A RA é adicionada a partir de estoque congelado no dia do uso (por exemplo, 1 μL de estoque de RA 10 mM por 1 mL de EC + bFGF).
   NOTA: A diferenciação bem-sucedida também pode ser alcançada sem suplementação de AR nos dias 6 e 8. A omissão da AR, entretanto, produzirá CEBs com TEER reduzido^12,13,14.
6. Revestir placas de cultura celular e inserções de membrana (por exemplo, Transwell) com colágeno IV e fibronectina (dia 7), para purificação das CEBs e experimentos subsequentes.
   1. Para o revestimento das inserções de membrana, combinar 4 partes de colágeno IV (1 mg/mL em 0,5 mg/mL de ácido acético), 1 parte de fibronectina (1 mg/mL) e 5 partes de água estéril de grau tecidual. A solução de MEC pode ser diluída 1:5 para revestir placas de cultura celular (ou seja, 4 partes de colágeno IV, 1 parte de fibronectina, 45 partes de água). Incubar com solução de revestimento a 37 °C durante a noite.
      NOTA: Placas e insertos de membrana também podem ser revestidos por pelo menos 4 h antes da subcultura no mesmo dia da etapa de purificação.
7. Purificar as CEBs subcultivando as células diferenciadas em placas revestidas com colágeno IV e fibronectina ou inserções de membrana (dia 8).
   1. Aspirar meio EC e adicionar reagente de dissociação enzimática celular (12 mL por T75). Incubar a 37 °C até que 90% das células se tenham libertado do frasco.
      NOTA: A dissociação celular pode levar até 1 h.
   2. Durante o tempo de incubação, remova a solução de revestimento de colágeno IV/fibronectina das placas/pastilhas previamente preparadas e deixe-as secar em uma capa estéril. Leva aproximadamente 20 min para as pastilhas secarem.
   3. Uma vez que as células tenham se destacado, lave-as do frasco com uma pipeta de 10 mL. Pipetar para cima e para baixo para obter uma suspensão de célula única.
      NOTA: A suspensão de célula única é importante para a contagem confiável de células e para alcançar monocamadas sólidas.
   4. Diluir com pelo menos igual volume de hESFM fresco em um tubo cônico de 50 mL e contar as células usando um hemocitômetro.
   5. Pelotar as células a 1.500 x g por 10 min.
   6. Ressuspender as células em volume apropriado de EC + bFGF + RA recém-preparadas para obter uma suspensão de 2 x 10⁶ células/mL para semeadura em inserções de membrana. Adicionar 500 μL (1 x 10⁶ células) sobre uma pastilha de 12 poços e 1,5 mL de meio EC + bFGF + RA na parte inferior. Para a semeadura em placas de 24 e 48 poços, diluir a suspensão celular 1:2 e adicionar 500 μL (5 x 10⁵ células) e 250 μL (2,5 x 10⁵ células) por poço, respectivamente. Distribuir as células uniformemente pelo poço/inserção (ver passo 2.2.4) e incubar a 37 °C a 5% de CO₂.
8. Trocar o meio em placas/transwells para EC sem bFGF ou AR (dia 9).
9. Realizar experimentos de infecção, medição de TEER e coloração de imunofluorescência conforme descrito nas seções a seguir (dia 10).
   NOTA: As CEBs diferenciadas e purificadas com sucesso tipicamente atingem o pico TEER no dia 10 e expressam marcadores característicos de células endoteliais cerebrais como PECAM-1 (CD31) e VE-caderina, o transportador de glicose GLUT-1, transportadores de efluxo como glicoproteína-p e componentes de junção apertada ZO-1, ocludina e Claudin-5 13,14,16,17,19,22 . Consultar Lippmann et al., Stebbins et al., entre outros, para maiores detalhes e imagens dos tipos celulares, morfologias e expressão de marcadores específicos do tipo celular durante o processo de diferenciação13,14,15,16,17,19,22. Imagens representativas das células IMR90-4 em diferentes estágios do processo de diferenciação da BEC podem ser encontradas na Figura Suplementar 1.

4. Resistência elétrica transendotelial (TEER) como medida de estanqueidade da barreira

NOTA: O TEER é geralmente lido nas inserções da membrana nos dias 9 e 10 de diferenciação para confirmar a geração bem-sucedida de barreiras formando iPSC-BECs (Figura 1A).

1. Coloque o volt-ohm medidor epitelial (EVOM) no ambiente estéril de uma capela de biossegurança e conecte o eletrodo ao EVOM.
2. Desinfete o eletrodo submergindo-o em EtOH 70% por pelo menos 5 min e deixe secar completamente.
   NOTA: Incubação mais longa em EtOH a 70% ou descontaminação do eletrodo usando solução de hipoclorito a 5% é possível, se necessário.
3. Recupere as iPSC-BECs em inserções de membrana da incubadora e meça o TEER.
   NOTA: É importante ler o TEER rapidamente após a remoção da incubadora, pois a mudança de temperatura pode afetar a medição do TEA.
4. Leia TEER mergulhando o eletrodo no meio para que o eletrodo mais curto seja colocado em cima da pastilha e o eletrodo mais longo atinja o meio ao redor da inserção.
   NOTA: Certifique-se de que os eletrodos nas pontas dos "pauzinhos" estejam completamente cobertos por líquido. Se necessário, incline o poço para conseguir isso antes de colocar a placa novamente para medir.

5. Coloração por imunofluorescência (IF) para validação do fenótipo da BEC

OBS: Para validar a qualidade das células totalmente diferenciadas e purificadas, as monocamadas iPSC-BEC são coradas para os marcadores característicos das células endoteliais cerebrais no 10º dia do processo de diferenciação, conforme descrito anteriormente (Figura 1B\u2012G)13,14,15,16,17,19,22.

1. Aspirar o meio e lavar 1x com PBS.
2. Fixar as células com metanol gelado à temperatura ambiente (TR) durante 15 minutos.
3. Lavar 3x com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e bloquear com 10% de soro fetal bovino (SFB) em PBS no TR por 1 h.
4. Aspirar e adicionar anticorpos primários diluídos em solução de bloqueio. Incubar a 4 °C durante a noite.
   NOTA: Consulte a Tabela de Materiais e Stebbins e col. para informações relacionadas à fonte e diluição dos anticorpos²².
5. Lavar 3x com PBS antes de adicionar anticorpo secundário diluído em solução de bloqueio. Incubar em TR por 1 h. Proteja as amostras da luz a partir deste ponto.
6. Lave 2x com PBS. Em seguida, adicionar DAPI em uma diluição de 1:5.000 em PBS e corar em RT por 15 min.
7. Lave 1x deixando o PBS ligado e tire imagens usando um microscópio de fluorescência.

6. Preparação de bactérias e infecção de iPSC-BECs

1. No dia anterior ao experimento de infecção (dia 9 de diferenciação), iniciar uma cultura noturna da bactéria a partir de estoque congelado. Para infecção por Nm, esticar bactérias em ágar Columbia com 5% de sangue de carneiro (ágar sangue). Incubar culturas bacterianas a 37 °C e 5% CO₂ durante a noite.
2. No dia seguinte (dia 10), preparar PPM+ fresco suplementando meio de peptona protease (PPM) com 50 μL de 2 M MgCl₂, 50 μL de 2 M NaHCO₃ e 100 μL de Kellogg's suplemento por 10 mL. Inocular 10 mL de meio PPM+ em um tubo cônico de 50 mL com Nm da placa de cultura noturna usando um cotonete estéril. Incubar agitando a 200 rpm a 37 °C por 1,5 h (ou seja, até que as bactérias estejam na fase logarítmica de crescimento).
3. Durante a incubação bacteriana, prepare iPSC-BECs em uma placa de 24 poços ou em inserções de membrana para infecção, substituindo o meio antigo por 400 μL de meio EC fresco (sem bFGF ou RA) por poço/topo de inserção de membrana.
4. Centrifugar a cultura bacteriana a 4000 x g por 10 min e aspirar o meio. Ressuspender o pellet bacteriano em 250 μL de PBS.
5. Em 4 mL de PBS fresco, use uma porção da suspensão de células bacterianas e ajuste para um OD₆₀₀ de 0,4 (aproximadamente 1 x 10⁸ UFC/mL).
6. Em seguida, diluir as bactérias em meio de cultura celular (meio CE) de acordo com a multiplicidade de infecção desejada (MOI).
   NOTA: Por exemplo, para um MOI de 10, diluir 1:10 ou 1:5 ao infectar iPSC-BECs em uma placa de 24 poços ou em inserções de membrana, respectivamente (1 x 10⁵ células por monocamada em uma placa de 24 poços). A adição de soro humano não está incluída na preparação de Nm para infecção, como foi descrito em outros manuscritos, pois foi observado um impacto deletério no fenótipo de barreira iPSC-BEC medido pelo TEER (dados não mostrados)^30,31. No entanto, a interação de Nm e iPSC-BECs não é afetada com ou sem soro humano (dados não mostrados).
7. Infectar iPSC-BECs em cada poço com 100 μL da suspensão da bactéria preparada e incubar pelo tempo desejado de infecção.
   NOTA: A expressão de um número de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias está elevada nas CEBe-iPSC quando infectadas com Nm, mais proeminentemente após 8 h de infecção, como descrito anteriormente por Martins-Gomes et al (Figura 2)¹⁹.

7. Ativação imune inata por PCR quantitativo

NOTA: Usando um isolamento de RNA preferido, síntese de cDNA e protocolo de qPCR, colete amostras e execute qPCR em citocinas selecionadas.

1. 7.1. Coletar o RNA de amostras de BEC após a infecção no dia 10 do protocolo de diferenciação, usando reagentes de um kit de isolamento de RNA disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: Evite a contaminação por nucleases das amostras trabalhando cuidadosamente em um ambiente limpo e esterilizado.
   1. Preparar tampão de lise e adicionar 350 μL a cada poço/monocamada de iPSC-BECs.
   2. Coletar as amostras pipetando para cima e para baixo várias vezes (por exemplo, 20x) e transferindo a suspensão para um tubo de microcentrífuga estéril.
      NOTA: As amostras podem ser armazenadas a -80 °C até estarem prontas para o isolamento do RNA.
   3. Siga o protocolo fornecido com o kit de isolamento de RNA para purificação de RNA de células e tecidos cultivados.
   4. Após a eluição em água livre de nucleases, mantenha as amostras de RNA no gelo para minimizar qualquer atividade potencial da RNase.
   5. Estimar as concentrações de RNA em um espectrofotômetro (por exemplo, Nanodrop).
2. Gere uma biblioteca de cDNA a partir do RNA coletado usando um kit de síntese de cDNA (consulte Tabela de Materiais).
   1. Estabelecer reações consistindo em mistura mestre de síntese de cDNA, pelo menos 200 ng (idealmente 500 ng) de RNA da amostra e água livre de nuclease em um volume total de reação definido, conforme descrito no protocolo do kit de síntese de cDNA.
   2. Em um termociclador padrão, execute um programa apropriado para os reagentes do kit de síntese de cDNA usado. Por exemplo: 25 °C por 2 min, 55 °C por 10 min, 95 °C por 1 min.
   3. Após a síntese, diluir o cDNA até 1:10 em água livre de nucleases e mover as amostras para 4 °C para armazenamento de curto prazo ou -20 °C para armazenamento de longo prazo.
      NOTA: Pode ser necessária uma diluição mais baixa se a concentração de ARN for baixa (por exemplo, abaixo de 50 ng). O cDNA diluído pode ser armazenado a -20 °C por até um ano.
3. Realizar qPCR nas amostras de cDNA visando transcritos de genes da resposta imune inata, como citocinas e quimiocinas, com primers cuidadosamente projetados e validados.
   NOTA: Como o design do primer é muito importante para a qualidade dos resultados da qPCR, a eficiência do primer deve ser testada conduzindo uma série de diluição e a ausência de vários produtos deve ser confirmada em um gel de DNA.
   1. Para cada reação de 25 μL, use 0,5 μL de primer forward e 0,5 μL reverso (10 mM em água livre de nuclease), 1 μL de cDNA, 10,5 μL de H₂O livre de nuclease e 12,5 μL de mistura mestre de qPCR.
   2. Realizar a reação em uma máquina qPCR usando o seguinte protocolo de ciclador: (a) 4 °C por 2 min; b) 95 °C durante 15 minutos; c) 95 °C por 15 s; d) 60 °C durante 1 min; percorrer (c) e (d) 45 vezes; e) Curva de fusão opcional: 30\u201299 °C em incrementos de 1 °C; 25 °C por 5 min.
   3. Para a análise dos dados, use o cálculo ΔΔCT para comparar os níveis de expressão de citocinas e quimiocinas com um gene housekeeping de referência, como 18S ou GAPDH.

Resultados

O protocolo aqui descrito é adaptado de Stebbins e col. e destaca o processo de diferenciação de iPSCs em células endoteliais cerebrais que possuem propriedades BBB, e como utilizar esse modelo para estudos de infecção usando iPSC-BECs com Nm^19,22. As iPSC-BECs, quando diferenciadas adequadamente, exibem propriedades de barreira apertadas medidas pelo TEER que são frequentemente maiores que 2000 Ω·cm², e expressam marcadores endoteliais como V...

Discussão

A modelagem de BECs e do BBB tem tido desafios, pois as CEBs humanas primárias e imortalizadas, in vitro, tendem a carecer de fenótipos de barreira robustos. O advento das tecnologias de células-tronco humanas permitiu a geração de células BEC-like derivadas de iPSC que retêm fenótipos BBB característicos esperados, como marcadores endoteliais, expressão de tight junction, propriedades de barreira, resposta a outros tipos de células do SNC e transportadores funcionais de efluxo 12,13,14,15,

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase (1x)	Sigma	A6964	Enzymatic cell dissociation reagent
Acetic acid	Sigma	A6283
All-trans retinoic acid (RA)	Sigma	R2625
Anti-CD31 (PECAM-1)	Thermo Scientific (Labvision)	RB-10333
Anti-Claudin-5	Invitrogen	4C3C2
Anti-Glut-1	Thermo Scientific (Labvision)	SPM498 (MA5-11315)
Anti-Occludin	Invitrogen	33-1500
Anti-VE-cadherin	Santa Cruz	sc-52751
Anti-ZO-1	Invitrogen	33-9100
Bacto Proteose Peptone	BD	211684
b-Mercaptoethanol	Merck (Sigma-Aldrich)	805740
Cell culture plates and flasks	Sarstedt
Centrifuge (Heraeus Megafuge 1.0R)	Thermo Scientific
Class II biosafety cabinet	Nuaire	NU-437-400E
CO2 Incubator (DHD Autoflow CO2 Air-Jacketed Incubator)	Nuaire
Collagen IV	Sigma	C5533
Columbia ager + 5 % sheep blood	Biomerieux	43049
Costar Transwell polyester filters (12- or 24-well)	Corning	3460, 3470
D(+)-Glucose	Merck (Sigma-Aldrich)	G8270
DAPI	Invitrogen	D1306
DMEM/F12	Gibco	31330-038
DMSO	ROTH	A994.1
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Gibco	21600-069
Epithelial Volt-Ohm Meter (Millicell ERS-2) with STX electrode	Merck (Millipore)	MERS00002
Fe(NO3)3	ROTH	5632.1
Fibronectin	Sigma	F1141
Fluoresence microscope (Eclipse Ti)	Nikon
Hemacytometer (Neubauer)	A. Hartenstein	ZK06
Human basic fibroblast growth factor (bFGF)	PeproTech	100-18B
Human Endothelial Serum Free Medium (hESFM)	Gibco	11111-044
Inverted microscope (Wilovert)	Hund (Will Wetzlar)
iPS(IMR90)-4 cells	WiCell
Kellogg's supplement			To prepare 110 ml of Kellogg's supplement, prepare 100 ml of 4 g/ml glucose, 0.1 g/ml glutamine, and 0.2 mg/ml thiamine pyrophosphate and 10 ml of 5 mg/ml Fe(NO3)3 and combine the solutions. Filter sterilize and store aliquoted at -20 °C.
Knockout serum replacement (KOSR)	Gibco	10828-028
L-glutamine (GlutaMAX)	Invitrogen	35050-038
LunaScript RT SuperMix Kit	NEB	E3010L	cDNA synthesis kit
Matrigel Matrix	Corning	354230
Methanol	ROTH	4627.5
MgCl2	ROTH	KK36.1
Micropipettes (Research Plus)	Eppendorf
NaHCO3	ROTH	6329
Nonessential amino acids (NEAA)	Gibco	11140-035
NucleoSpin RNA isolation kit	Machery-Nagel	740955	RNA isolation kit
Pipette boy (Accu-Jet Pro)	Brand
Platelet poor plasma-derived serum, bovine (PDS)	Fisher	50-443-029
PowerUp SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	A25742	qPCR master mix
qPCR film (MicroAmp Optical Adhesive Film)	Applied Biosystems	4211971
qPCR plates (MicroAmp Fast 96-well)	Applied Biosystems	4346907
ROCK inhibitor, Y27632 dihydrochloride	Tocris	1254
RT-PCR thermo cycler (StepOnePlus)	Applied Biosystems	4376600
Serological pipettes	Sarstedt
StemFlex basal medium + 50x StemFlex supplement	Gibco	A3349401	Stem-cell maintenance medium
Swinging Bucket Rotor (Heraeus #2704)	Thermo Scientific
Thiamine pyrophosphate	Sigma	C8754-5G
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061
Versene	Gibco	15040-033	Non-enzymatic cell dissociation reagent (EDTA)