Neisseria meningitidis Инфекция индуцированных плюрипотентных эндотелиальных клеток головного мозга

Резюме

Протокол, описанный здесь, освещает основные этапы дифференцировки индуцированных плюрипотентных эндотелиальных клеток, полученных из стволовых клеток, подготовку Neisseria meningitidis к инфекции и сбор образцов для других молекулярных анализов.

Аннотация

Менингококковый менингит — это опасная для жизни инфекция, которая возникает, когда Neisseria meningitidis (meningococcus , Nm) может получить доступ к центральной нервной системе (ЦНС), проникая в высокоспециализированные эндотелиальные клетки головного мозга (БЭК). Поскольку Nm является патогеном, специфичным для человека, отсутствие надежных модельных систем in vivo затрудняет изучение взаимодействия между Nm и БЭК между патогеном-хозяином и устанавливает необходимость в модели, основанной на человеке, которая имитирует нативные БЭК. БЭК обладают более жесткими барьерными свойствами по сравнению с периферическими эндотелиальными клетками, характеризующимися сложными плотными соединениями и повышенным трансэндотелиальным электрическим сопротивлением (TEER). Тем не менее, многие модели in vitro , такие как первичные БЭК и иммортализированные БЭК, либо отсутствуют, либо быстро теряют свои барьерные свойства после удаления из нативного нейронного микроокружения. Недавние достижения в технологиях стволовых клеток человека позволили разработать методы получения эндотелиальных клеток головного мозга из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), которые лучше фенокопируют БЭК по сравнению с другими моделями человека in vitro . Использование БЭК, полученных из ИПСК (ИПСК-БЭК) для моделирования взаимодействия Nm-BEC, имеет преимущество использования клеток человека, обладающих барьерными свойствами BEC, и может быть использовано для изучения разрушения барьера, активации врожденного иммунитета и взаимодействия бактерий. В этой статье мы продемонстрируем, как получить ИПСК-БЭК из ИПСК в дополнение к бактериальной подготовке, инфекции и сбору образцов для анализа.

Введение

Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) и менингеальный гематоэнцефалический барьер (mBCSFB) представляют собой чрезвычайно плотные клеточные барьеры, которые отделяют кровоток от центральной нервной системы (ЦНС) и в основном состоят из высокоспециализированных эндотелиальных клеток головного мозга (БЭК)^1,2. Вместе БЭК поддерживают надлежащий гомеостаз мозга, регулируя поступление питательных веществ и продуктов жизнедеятельности в мозг и из него, исключая при этом многие токсины, лекарственные препараты и патогены ^1,2. Бактериальный менингит возникает, когда бактерии, переносимые через кровь, способны взаимодействовать с барьером, образованным БЭК, и проникать через него, вызывая воспаление. Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) — грамотрицательная бактерия, которая колонизирует носоглотку у 10\u201240 % здоровых людей, но в некоторых случаях может вызывать серьезное системное заболевание³. У больных людей Nm может получить доступ к кровотоку, где он может вызвать молниеносную пурпуру, а также проникнуть в БЭК, получая доступ к ЦНС, вызывая менингит³. Нм является ведущей причиной бактериального менингита во всем мире и, несмотря на усилия по вакцинации, по-прежнему является основной причиной менингита⁴. Современные медицинские вмешательства, такие как лечение антибиотиками, сделали эти состояния жизнеспособными, однако люди, страдающие менингитом, часто остаются с необратимыми неврологическими повреждениями ^5,6.

Предыдущие исследования идентифицировали бактериальные факторы и сигнализацию хозяина, которые способствуют взаимодействию Nm-BEC 7,8,9,10,11. Идентифицированные адгезины и инвазины, такие как белок непрозрачности Opc и pili IV типа, а также рецепторы, такие как CD147, были проведены на различных моделях BEC in vitro, однако в этих моделях отсутствуют многие определяющие свойства ГЭБ 7,9,11,12. Полное понимание взаимодействий Nm-BEC остается труднодостижимым отчасти из-за невозможности использования моделей in vivo, неполной защиты от вакцинации и отсутствия надежных моделей БЭК человека in vitro.

Моделирование hБЭК in vitro было сложной задачей из-за уникальных свойств БЭК. По сравнению с периферическими эндотелиальными клетками, БЭК имеют ряд фенотипов, которые усиливают их барьерные свойства, такие как высокое трансэндотелиальное электрическое сопротивление (TEER) из-за сложных плотных соединений¹². После удаления из микроокружения мозга БЭК быстро теряют свои барьерные свойства, ограничивая полезность первичных или иммортализированных моделей in vitro, которые образуют только слабый барьер^12,13. Сочетание специфичности NM-инфекций для человека, отсутствия надежных моделей in vivo и проблем моделирования БЭК человека in vitro создает потребность в более совершенных моделях для понимания сложного взаимодействия между хозяином и патогеном между Nm и БЭК. В последнее время с использованием технологий модельных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК) из ИПСК были получены БЭК-подобные клетки, которые лучше имитируют БЭК in vivo^12,13,14,15. ИПСК-БЭК имеют человеческое происхождение, легко масштабируются и обладают ожидаемыми фенотипами БЭК по сравнению с их первичными или иммортализированными аналогами^12,13,14,15. Кроме того, мы и другие ученые продемонстрировали, что ИПСК-БЭК полезны для моделирования различных заболеваний ЦНС, таких как взаимодействие патогена с хозяином, болезнь Хантингтона и дефицит MCT8, который вызывает синдром Аллана-Херндона-Дадли 16,17,18,19,20,21. В этой статье мы продемонстрируем, как получить ИПСК-БЭК из возобновляемых источников ИПСК и инфекцию ИПСК-БЭК Nm, приводящую к активации врожденного иммунного ответа. Мы считаем, что эта модель полезна для изучения взаимодействия хозяина и патогена, которое не может быть воспроизведено в других моделях in vitro, и особенно полезна при изучении взаимодействий с патогенами, специфичными для человека, такими как Nm.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы приготовления сред / реагентов, поддержания стволовых клеток и дифференцировки адаптированы из Stebbins et ^al.22.

1. Подготовка материалов, необходимых для культивирования ИПСК и дифференциации БЭК.

1. Матричное покрытие пластика для культуры тканей (ТС) для культуры ИМР90-4 iPSC
   1. Распределите матричный гель базальной мембраны (например, Matrigel) на аликвоты по 2,5 мг и храните при -20 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте быстро при работе с матричным гелем и аликвотой на льду, так как он образует гель при температуре выше 4 °C и не может быть аликвотирован после затвердевания.
   2. Для нанесения покрытия на пластик TC быстро добавьте одну аликвоту матричного геля в 30 мл среды Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 в конической пробирке объемом 50 мл. Добавьте 1 мл среды на замороженный матричный гель, пипеткой вверх и вниз до тех пор, пока он не разморозится, и сразу же перелейте в коническую пробирку объемом 50 мл с оставшейся средой.
   3. Используйте 1 мл этого матричного раствора для нанесения геля на лунку 6-луночной планшета и 12 мл на колбу T75.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Матричный пластик TC с гелевым покрытием можно приготовить за две недели до его использования. Тем не менее, очень важно избежать высыхания матричного гелевого раствора, что может потребовать периодического добавления большего количества DMEM/F12 в верхней части лунок.
2. Приготовьте поддерживающую среду для поддержания стволовых клеток, добавив 50 мл добавки 50x к 450 мл поддерживающей базальной среды стволовых клеток в стерильной среде шкафа биобезопасности.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Другие поддерживающие среды стволовых клеток (mTeSR и E8) были использованы в других исследованиях 13,14,15, ^22,23,24,25.
3. Для приготовления 500 мл некондиционированной среды (UM) смешайте 392,5 мл DMEM/F12 со 100 мл нокаут-замены сыворотки (KOSR), 5 мл заменимых аминокислот, L-глютамином в конечной концентрации 1 мМ и 3,5 мкл β-меркаптоэтанола. Процедить, стерилизовать и хранить при температуре 4 °C до 2 недель.
4. Для приготовления 200 мл среды эндотелиальных клеток (ЭК) плюс ретиноевая кислота (РА) плюс bFGF смешивают 198 мл свободной среды эндотелия сыворотки крови человека (hESFM), 2 мл стерилизованной фильтром сыворотки крови с низким содержанием тромбоцитов (PDS) и 20 нг/мл bFGF. Фильтр стерилизовать и хранить до 2 недель при температуре 4 °C. Непосредственно перед добавлением к клеткам добавьте 10 мкМ РА в ЕС-среду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку PDS был снят с производства и, следовательно, может быть ограничен, этот протокол был успешно проведен с использованием B27 вместо PDS 15,23,26.
5. Для приготовления 200 мл ЕС-среды без РА или ФГФ смешайте 198 мл ХЭСФМ и 2 мл стерилизованного фильтром ФДС и стерилизуйте фильтр. Хранить до 4 недель при температуре 4 °C.

2. Техническое обслуживание клеточной культуры IMR90-4

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы используем клеточную линию IMR90-4 в качестве примера, однако другие индуцированные плюрипотентные линии стволовых клеток, такие как CC3, CD10, CD12, DF19-9-11T, 83iCTR, 00iCTR и CS03iCTRn2, были успешно использованы для дифференцировки в БЭК 13,14,15,16,17,23,27,28.

1. Культивирование ИПСК при 37 °C в 5%_СО2 и обычно выдерживают на 6-луночных планшетах при различной плотности с 2 мл поддерживающей среды стволовых клеток на лунку.
2. Для поддержания культуры ИПСК выберите одну лунку для прохода, которая не сливается и имеет открытые пространства между колониями.
   1. Аспирируют питательную среду, добавляют 1 мл реагента для неферментативной диссоциации клеток и инкубируют при 37 °C в течение 7 мин. Во время инкубации замените матричный раствор геля на новую 6-луночную пластину 2 мл свежей среды для поддержания стволовых клеток на лунку.
   2. Осторожно аспирируйте реагент для неферментативной диссоциации клеток, стараясь не аспиратировать клетки, все еще прикрепленные к планшету.
   3. Добавьте 6 мл поддерживающей среды для поддержания стволовых клеток и промойте дно лунки несколько раз, пока все клетки полностью не отделятся. Затем засейте новую 6-луночную пластину с различной плотностью, обычно 1:6 или 1:12 для нормального обслуживания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используя вышеупомянутые соотношения, клетки разделяются примерно два раза в неделю.
   4. Переместите планшет в инкубатор и равномерно распределите засеянные клетки по лункам, встряхивая планшет вперед и назад и слева направо, делая паузы между чередующимися встряхивающими движениями, пока среда не осядет.

3. Дифференцировка эндотелиальных клеток головного мозга от ИПСК человека

1. Покрытие ИПСК для дифференцировки (3-й день протокола дифференцировки)
   1. В соответствии с IMR90-4 поддерживающую культуру хорошо используют для планшета для дифференцировки, аспирируют питательную среду, добавляют 1 мл реагента для ферментативной диссоциации клеток на лунку и инкубируют при 37 °C в течение 7 мин.
   2. Инактивируйте реагент для ферментативной диссоциации клеток, перенеся 1 мл диссоциированной клеточной суспензии в коническую пробирку объемом 15 мл с содержанием свежей среды для поддержания стволовых клеток не менее 2 мл на 1 мл клеток. Открутите клеточную суспензию со скоростью 1 500 x g в течение 5 минут.
   3. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл поддерживающей среды стволовых клеток на лунку используемых клеток IMR90-4 и подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Может быть полезно разбавить 1:1 0,4% трипановым синим, чтобы различать живые и мертвые клетки при подсчете. В зависимости от плотности ИПСК одна лунка 6-луночной планшета обычно дает 1\u20122 x 10⁶ клеток.
   4. Для дифференцировки в колбе Т75 добавляют 7,5 х 10⁵ клеток к 12 мл поддерживающей среды стволовых клеток и ингибитора РОК (дигидрохлорид Y27632) в конечной концентрации 10 мкМ. Отсасывайте раствор матричного геля из колбы Т75 и переносите клеточную суспензию в колбу. Распределите клетки равномерно, встряхивая колбу вперед и назад и слева направо (см. шаг 2.2.4), и инкубируйте при 37 °C и 5% CO₂.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе крайне важно добавить ингибитор РОК для повышения выживаемости диссоциированных одиночных стволовых клеток^25,29. Клетки должны быть равномерно распределены по колбе и в синглетах, демонстрируя распространенную мезенхимальную морфологию из-за обработки ингибитором РОК²².
2. В день -2 и день -1 смените среду на среду для поддержания свежих стволовых клеток; 12 мл на Т75.
3. В день 0 начните дифференциацию, сменив носитель на UM; 12 мл на Т75.
4. Меняйте единую систему обмена сообщениями ежедневно (день 1 – день 5).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки обычно достигают слияния через 2-3 дня в UM, что можно наблюдать невооруженным глазом или с помощью микроскопа с инвертированным светлым полем. По мере прогрессирования дифференцировки становятся видимыми «нервные тракты» nestin+ с клетками PECAM-1⁺ между ними, как описано ранее^13,14.
5. Селективно увеличивают популяцию эндотелиальных клеток путем перехода на ЕС-среду с 20 нг/мл bFGF и 10 мкМ ретиноевой кислоты (РА) (6-й день) и инкубации в течение двух суток. Среда EC с bFGF может быть приготовлена за две недели до этого. RA добавляется из замороженного материала в день использования (например, 1 мкл 10 мМ RA на 1 мл EC + bFGF).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Успешная дифференцировка может быть достигнута и без добавления РА на 6-й и 8-й день. Тем не менее, пропуск RA приведет к БЭК с уменьшенным TEER^12,13,14.
6. Покройте планшеты для клеточных культур и мембранные вставки (например, Transwell) коллагеном внутривенно и фибронектином (на 7-й день) для очистки БЭК и последующих экспериментов.
   1. Для покрытия мембранных вставок смешайте 4 части коллагена внутривенно (1 мг/мл в 0,5 мг/мл уксусной кислоты), 1 часть фибронектина (1 мг/мл) и 5 частей стерильной тканевой воды. Раствор ECM можно разбавить в соотношении 1:5 для покрытия планшетов с клеточными культурами (т.е. 4 части коллагена внутривенно, 1 часть фибронектина, 45 частей воды). Инкубируйте с раствором для покрытия при температуре 37 °C в течение ночи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины и мембранные вставки также могут быть покрыты не менее чем за 4 часа до субкультивирования в тот же день, что и этап очистки.
7. Очистите БЭК путем субкультивирования дифференцированных клеток на пластинах или мембранных вставках, покрытых коллагеном и фибронектином (день 8).
   1. Аспирировать ЕС-среду и добавить реагент для ферментативной диссоциации клеток (12 мл на Т75). Инкубируйте при температуре 37 °C до тех пор, пока 90% клеток не отделятся от колбы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диссоциация клеток может занять до 1 часа.
   2. Во время инкубации удалите раствор коллагена для внутривенного введения/фибронектина с предварительно подготовленных пластин/вкладышей и дайте им высохнуть в стерильном колпаке. Высыхание вкладышей занимает около 20 минут.
   3. После того, как клетки отделятся, смойте их с колбы с помощью пипетки объемом 10 мл. Пипетки вверх и вниз для получения одноклеточной суспензии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Одноклеточная суспензия важна для надежного подсчета клеток и получения твердых монослоев.
   4. Разведите по крайней мере равным объемом свежей hESFM в конической пробирке объемом 50 мл и подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра.
   5. Гранулируйте клетки при 1,500 x g в течение 10 мин.
   6. Ресуспендировать клетки в соответствующем объеме свежеприготовленного EC + bFGF + RA для получения суспензии 2 x 10⁶ клеток/мл для посева на мембранные вставки. Добавьте 500 мкл (1 x 10,⁶ ячеек) поверх 12-луночного вкладыша и 1,5 мл среды EC + bFGF + RA снизу. Для посева на 24- и 48-луночные планшеты разбавляют клеточную суспензию 1:2 и добавляют 500 мкл (5 х 10 5 ячеек) и 250 мкл (2,5 х 10⁵ ячеек) на лунку соответственно. Равномерно распределите ячейки по лунке/вставке (см. шаг 2.2.4) и инкубируйте при 37 °C при 5% CO₂.
8. Замените среду на пластинах/трансвеллах на EC без bFGF или RA (день 9).
9. Проводите эксперименты на инфекции, измерение TEER и иммунофлуоресцентное окрашивание, как описано в следующих разделах (день 10).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Успешно дифференцированные и очищенные БЭК обычно достигают пика TEER на 10-й день и экспрессируют характерные маркеры эндотелиальных клеток головного мозга, таких как PECAM-1 (CD31) и VE-кадгерин, транспортер глюкозы GLUT-1, транспортеры оттока, такие как p-гликопротеин, и компоненты плотного соединения ZO-1, окклюдин и клаудин-5 ^{13,14,16,17,19,22} . Обратитесь к Lippmann et al., Stebbins et al. и др. для получения более подробной информации и изображений типов клеток, морфологии и экспрессии маркеров, специфичных для типа клеток в процессе дифференцировки 13,14,15,16,17,19,22. Репрезентативные изображения клеток IMR90-4 на разных стадиях процесса дифференцировки БЭК можно найти на дополнительном рисунке 1.

4. Трансэндотелиальное электрическое сопротивление (TEER) как мера барьерной плотности

ПРИМЕЧАНИЕ: TEER обычно считывается на мембранных вставках на 9-й и 10-й дни дифференцировки, чтобы подтвердить успешную генерацию барьерообразующих ИПСК-БЭК (рис. 1A).

1. Поместите эпителиальный вольт-омметр (EVOM) в стерильную среду колпака биобезопасности и подсоедините электрод к EVOM.
2. Продезинфицируйте электрод, погрузив его в 70% EtOH не менее чем на 5 минут и дайте ему полностью высохнуть.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости возможна более длительная инкубация в 70% EtOH или дезактивация электрода с использованием 5% раствора гипохлорита.
3. Извлеките из инкубатора ИПСК-БЭК на мембранных вставках и измерьте TEER.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно быстро считывать TEER после извлечения из инкубатора, так как изменение температуры может повлиять на измерение TEER.
4. Прочтите TEER, погрузив электрод в среду таким образом, чтобы более короткий электрод располагался поверх пластины, а более длинный электрод проникал в среду, окружающую пластину.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что электроды на кончиках «палочек для еды» полностью покрыты жидкостью. При необходимости наклоните лунку, чтобы добиться этого, прежде чем снова опустить пластину для измерения.

5. Иммунофлуоресцентное (ИФ) окрашивание для валидации фенотипа БЭК

ПРИМЕЧАНИЕ: Для валидации качества полностью дифференцированных и очищенных клеток монослои iPSC-BEC окрашивают на характерные маркеры эндотелиальных клеток головного мозга на 10-й день процесса дифференцировки, как описано ранее (рис. 1B\u2012G) 13,14,15,16,17,19,22.

1. Аспирируйте средство и промойте 1 раз PBS.
2. Зафиксируйте клетки ледяным метанолом при комнатной температуре (RT) в течение 15 минут.
3. Промывают 3 раза фосфатным солевым буфером (PBS) и блокируют 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) в PBS при RT в течение 1 ч.
4. Аспирировать и добавлять первичные антитела, разведенные в блокирующем растворе. Выдерживают при температуре 4 °C в течение ночи.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к Таблице материалов и Stebbins et al. для получения информации, связанной с источником и разведением антител²².
5. Промойте 3 раза PBS перед добавлением вторичных антител, разведенных в блокирующем растворе. Инкубируют при РТ в течение 1 ч. С этого момента защищайте образцы от света.
6. Стирайте 2 раза с PBS. Затем добавляют DAPI в разведении 1:5 000 в PBS и окрашивают RT в течение 15 минут.
7. Промойте 1 раз, не снимая PBS, и сделайте снимки с помощью флуоресцентного микроскопа.

6. Подготовка бактерий и инфицирование ИПСК-БЭК

1. За день до эксперимента по заражению (9-й день дифференцировки) начинают ночное культивирование бактерий из замороженного сырья. При заражении Nm наносите бактерии на колумбийский агар с 5% овечьей крови (кровяной агар). Инкубируйте бактериальные культуры при температуре 37 °C и 5%_CO2 в течение ночи.
2. На следующий день (10-й день) приготовьте свежий PPM+, добавив пептонные среды Protease (PPM) 50 мкл 2 M MgCl 2, 50 мкл₂ M NaHCO₃ и 100 мкл добавки Kellogg's на 10 мл. Инокулируют 10 мл среды PPM+ в коническую пробирку объемом 50 мл с Nm из планшета для ночной культивации с помощью стерильного ватного тампона. Инкубируйте при встряхивании при 200 об/мин при 37 °C в течение 1,5 ч (т.е. до тех пор, пока бактерии не перейдут в логарифмическую фазу роста).
3. Во время бактериальной инкубации подготавливайте ИПСК-БЭК в 24-луночном планшете или на мембранных вставках для инфекции, заменяя старую среду 400 мкл свежей среды EC (без bFGF или RA) на лунку/верхнюю часть мембранной вставки.
4. Центрифужируют бактериальную культуру при 4000 х г в течение 10 мин и аспирируют среду. Ресуспендант бактериальной гранулы в 250 мкл PBS.
5. В 4 мл свежего PBS используют порцию суспензии бактериальных клеток и доводят наружный диаметр₆₀₀ 0,4 (примерно 1 x 10⁸ КОЕ/мл).
6. Затем разбавляют бактерии в питательной среде клеток (среда EC) в соответствии с желаемой кратностью инфекции (MOI).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Например, для MOI, равного 10, разбавьте 1:10 или 1:5 при инфицировании iPSC-BEC в 24-луночном планшете или на мембранных вставках, соответственно (1 x 10^{5 клеток} на монослой в 24-луночном планшете). Добавление сыворотки крови человека не включается в подготовку Nm к инфекции, как это было описано в других рукописях, поскольку было замечено, что оно оказывает вредное влияние на фенотип барьера iPSC-BEC, измеренный с помощью TEER (данные не показаны)^30,31. Тем не менее, взаимодействие Nm и iPSC-БЭК не влияет на сыворотку крови человека или без нее (данные не показаны).
7. Инфицируют ИПСК-БЭК в каждой лунке 100 мкл приготовленной бактериальной суспензии и инкубируют в течение желаемого времени заражения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Экспрессия ряда провоспалительных цитокинов и хемокинов повышена в ИПСК-БЭК при инфицировании Nm, наиболее заметно через 8 ч после инфицирования, как ранее описано Martins-Gomes et al. (Рисунок 2)¹⁹.

7. Активация врожденного иммунитета методом количественной ПЦР

ПРИМЕЧАНИЕ: Используя предпочтительный протокол выделения РНК, синтеза кДНК и кПЦР, соберите образцы и запустите кПЦР на выбранных цитокинах.

1. 7.1. Забор РНК из образцов БЭК после инфицирования на 10-е сутки протокола дифференцировки, используя реагенты из коммерчески доступного набора для выделения РНК (см. таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте загрязнения образцов нуклеазой, работая осторожно в очищенной и стерилизованной среде.
   1. Приготовьте лизисный буфер и добавьте 350 мкл в каждую лунку/монослой iPSC-BEC.
   2. Соберите образцы, пипетируя вверх и вниз несколько раз (например, 20 раз) и перенося суспензию в стерильную пробирку микроцентрифуги.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы можно хранить при температуре -80 °C до тех пор, пока они не будут готовы к выделению РНК.
   3. Следуйте протоколу, прилагаемому к набору для выделения РНК, для очистки РНК от культивируемых клеток и тканей.
   4. После элюирования в воде, не содержащей нуклеаз, храните образцы РНК на льду, чтобы свести к минимуму любую потенциальную активность РНКазы.
   5. Оцените концентрацию РНК на спектрофотометре (например, Nanodrop).
2. Сгенерируйте библиотеку кДНК из собранной РНК с помощью набора для синтеза кДНК (см. таблицу материалов).
   1. Организуйте реакции, состоящие из мастер-смеси синтеза кДНК, не менее 200 нг (в идеале 500 нг) образца РНК и воды, не содержащей нуклеаз, в определенном общем реакционном объеме, как описано в протоколе набора для синтеза кДНК.
   2. На стандартном амплификаторе запустите программу, подходящую для реагентов используемого набора для синтеза кДНК. Например: 25 °C в течение 2 мин, 55 °C в течение 10 мин, 95 °C в течение 1 мин.
   3. После синтеза разбавляют кДНК до 1:10 в безнуклеазной воде и перемещают образцы до 4 °C для кратковременного или -20 °C для длительного хранения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более низкое разведение может потребоваться, если концентрация РНК была низкой (например, ниже 50 нг). Разбавленная кДНК может храниться при -20 °C до года.
3. Выполняйте кПЦР образцов кДНК, нацеленных на транскрипции генов врожденного иммунного ответа, таких как цитокины и хемокины, с помощью тщательно разработанных и проверенных праймеров.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку дизайн праймера очень важен для качества результатов кПЦР, эффективность праймера должна быть проверена путем проведения серии разбавлений, и отсутствие нескольких продуктов должно быть подтверждено на геле ДНК.
   1. На реакцию 25 мкл используют 0,5 мкл прямого и 0,5 мкл обратного праймера (10 мМ в безнуклеазной воде), 1 мкл кДНК, 10,5 мкл безнуклеазного H₂O и 12,5 мкл мастер-смеси кПЦР.
   2. Проведите реакцию на машине для количественной ПЦР, используя следующий протокол амплификатора: (а) 4 °C в течение 2 мин; б) 95 °С в течение 15 мин; (c) 95 °C в течение 15 с; (d) 60 °C в течение 1 мин; выполнить (c) и (d) 45 раз; (e) опциональная кривая плавления: 30\u201299 °C с шагом 1 °C; 25 °C в течение 5 мин.
   3. Для анализа данных используйте расчет ΔΔCT для сравнения уровней экспрессии цитокинов и хемокинов с эталонным геном, отвечающим за домашнее хозяйство, таким как 18S или GAPDH.

Результаты

Протокол, описанный здесь, адаптирован из Stebbins et al. и освещает процесс дифференцировки ИПСК в эндотелиальные клетки мозга, обладающие свойствами ГЭБ, а также то, как использовать эту модель для исследований инфекций с использованием ИПСК-БЭК с Nm^19,22. При пр...

Обсуждение

Моделирование БЭК и ГЭБ сопряжено с трудностями, поскольку первичные и иммортализированные человеческие БЭК in vitro, как правило, не имеют устойчивых барьерных фенотипов. Появление технологий стволовых клеток человека позволило получить БЭК-подобные клетки, полученные из ИПСК, кот?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase (1x)	Sigma	A6964	Enzymatic cell dissociation reagent
Acetic acid	Sigma	A6283
All-trans retinoic acid (RA)	Sigma	R2625
Anti-CD31 (PECAM-1)	Thermo Scientific (Labvision)	RB-10333
Anti-Claudin-5	Invitrogen	4C3C2
Anti-Glut-1	Thermo Scientific (Labvision)	SPM498 (MA5-11315)
Anti-Occludin	Invitrogen	33-1500
Anti-VE-cadherin	Santa Cruz	sc-52751
Anti-ZO-1	Invitrogen	33-9100
Bacto Proteose Peptone	BD	211684
b-Mercaptoethanol	Merck (Sigma-Aldrich)	805740
Cell culture plates and flasks	Sarstedt
Centrifuge (Heraeus Megafuge 1.0R)	Thermo Scientific
Class II biosafety cabinet	Nuaire	NU-437-400E
CO2 Incubator (DHD Autoflow CO2 Air-Jacketed Incubator)	Nuaire
Collagen IV	Sigma	C5533
Columbia ager + 5 % sheep blood	Biomerieux	43049
Costar Transwell polyester filters (12- or 24-well)	Corning	3460, 3470
D(+)-Glucose	Merck (Sigma-Aldrich)	G8270
DAPI	Invitrogen	D1306
DMEM/F12	Gibco	31330-038
DMSO	ROTH	A994.1
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Gibco	21600-069
Epithelial Volt-Ohm Meter (Millicell ERS-2) with STX electrode	Merck (Millipore)	MERS00002
Fe(NO3)3	ROTH	5632.1
Fibronectin	Sigma	F1141
Fluoresence microscope (Eclipse Ti)	Nikon
Hemacytometer (Neubauer)	A. Hartenstein	ZK06
Human basic fibroblast growth factor (bFGF)	PeproTech	100-18B
Human Endothelial Serum Free Medium (hESFM)	Gibco	11111-044
Inverted microscope (Wilovert)	Hund (Will Wetzlar)
iPS(IMR90)-4 cells	WiCell
Kellogg's supplement			To prepare 110 ml of Kellogg's supplement, prepare 100 ml of 4 g/ml glucose, 0.1 g/ml glutamine, and 0.2 mg/ml thiamine pyrophosphate and 10 ml of 5 mg/ml Fe(NO3)3 and combine the solutions. Filter sterilize and store aliquoted at -20 °C.
Knockout serum replacement (KOSR)	Gibco	10828-028
L-glutamine (GlutaMAX)	Invitrogen	35050-038
LunaScript RT SuperMix Kit	NEB	E3010L	cDNA synthesis kit
Matrigel Matrix	Corning	354230
Methanol	ROTH	4627.5
MgCl2	ROTH	KK36.1
Micropipettes (Research Plus)	Eppendorf
NaHCO3	ROTH	6329
Nonessential amino acids (NEAA)	Gibco	11140-035
NucleoSpin RNA isolation kit	Machery-Nagel	740955	RNA isolation kit
Pipette boy (Accu-Jet Pro)	Brand
Platelet poor plasma-derived serum, bovine (PDS)	Fisher	50-443-029
PowerUp SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	A25742	qPCR master mix
qPCR film (MicroAmp Optical Adhesive Film)	Applied Biosystems	4211971
qPCR plates (MicroAmp Fast 96-well)	Applied Biosystems	4346907
ROCK inhibitor, Y27632 dihydrochloride	Tocris	1254
RT-PCR thermo cycler (StepOnePlus)	Applied Biosystems	4376600
Serological pipettes	Sarstedt
StemFlex basal medium + 50x StemFlex supplement	Gibco	A3349401	Stem-cell maintenance medium
Swinging Bucket Rotor (Heraeus #2704)	Thermo Scientific
Thiamine pyrophosphate	Sigma	C8754-5G
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061
Versene	Gibco	15040-033	Non-enzymatic cell dissociation reagent (EDTA)