JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Erratum Notice
  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Erratum
  • Reprints and Permissions

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Summary

הפרוטוקול המתואר כאן מדגיש את השלבים העיקריים בהתמיינות תאי אנדותל דמויי מוח המושרים פלוריפוטנטים, הכנת Neisseria meningitidis לזיהום, ואיסוף דגימות לניתוחים מולקולריים אחרים.

Abstract

דלקת קרום המוח מנינגוקוק היא זיהום מסכן חיים המתרחש כאשר Neisseria meningitidis (מנינגוקוק, Nm) יכול לקבל גישה למערכת העצבים המרכזית (CNS) על ידי חדירה לתאי אנדותל מוח מיוחדים מאוד (BECs). מכיוון ש-Nm הוא פתוגן ספציפי לאדם, המחסור במערכות מודל in vivo חזקות הופך את המחקר של אינטראקציות מארח-פתוגן בין Nm ל-BECs למאתגר ומבסס את הצורך במודל מבוסס אדם המחקה BECs מקוריים. לתאי BEC יש תכונות מחסום הדוקות יותר בהשוואה לתאי אנדותל היקפיים המאופיינים בצמתים הדוקים מורכבים ובהתנגדות חשמלית טרנס-אנדותל מוגברת (TEER). עם זאת, מודלים רבים במבחנה , כגון BECs ראשוניים ו- BECs מונצחים, חסרים או מאבדים במהירות את תכונות המחסום שלהם לאחר הסרת המיקרו-סביבה העצבית הטבעית. ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיות תאי גזע אנושיים פיתחה שיטות להפקת תאי אנדותל דמויי מוח מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) המשפרים את הפנוקופיה, בהשוואה למודלים אנושיים אחרים במבחנה . לשימוש ב-BECs שמקורם ב-iPSC (iPSC-BECs) כדי למדל אינטראקציה של Nm-BEC יש יתרון בשימוש בתאים אנושיים בעלי תכונות מחסום BEC, וניתן להשתמש בהם כדי לבחון הרס מחסומים, הפעלה חיסונית מולדת ואינטראקציה חיידקית. כאן אנו מדגימים כיצד להפיק iPSC-BECs מ- iPSCs בנוסף להכנת חיידקים, זיהום ואיסוף דגימות לניתוח.

Introduction

מחסום הדם-מוח (BBB), ומחסום הדם-CSF של קרום המוח (mBCSFB) הם מחסומים תאיים הדוקים ביותר המפרידים בין זרימת הדם למערכת העצבים המרכזית (CNS) ומורכבים בעיקר מתאי אנדותל מוח מיוחדים מאוד (BECs)1,2. יחד, BECs שומרים על הומאוסטזיס תקין במוח על ידי ויסות חומרי מזון ומוצרי פסולת בתוך המוח ומחוצה לו, תוך הרחקת רעלים, תרופות ופתוגנים רבים 1,2. דלקת קרום המוח חיידקית מתרחשת כאשר חיידקים הנישאים בדם מסוגלים לתקשר עם המחסום שנוצר על ידי BECs ולחדור אותו, ולגרום לדלקת. Neisseria meningitidis (Nm, מנינגוקוק) הוא חיידק גראם-שלילי המאכלס את הנסופריינקס של 10\u201240% מהאנשים הבריאים, אך במקרים מסוימים עלול לגרום למחלה מערכתית קשה3. אצל אנשים מושפעים, Nm יכול לקבל גישה לזרם הדם, שם הוא יכול לגרום purpura fulminans, כמו גם לחדור BECs מקבל גישה CNS גרימת דלקת קרום המוח3. Nm הוא גורם מוביל לדלקת קרום המוח חיידקית ברחבי העולם, ולמרות מאמצי החיסון, הוא עדיין הגורם העיקרי לדלקת קרום המוח4. התערבות רפואית מודרנית, כגון טיפול אנטיביוטי, הפכה מצבים אלה לשרידות, אולם אלה שנפגעו מדלקת קרום המוח נותרים לעתים קרובות עם נזק נוירולוגי קבוע 5,6.

מחקרים קודמים זיהו גורמים חיידקיים ואיתות מארח התורמים לאינטראקציות Nm-BEC 7,8,9,10,11. הדבקים והפולשים שזוהו כגון חלבון האטימות Opc, ו- Type-IV pili, כמו גם קולטנים כגון CD147, נערכו על מודלים שונים של BEC במבחנה, אולם מודלים אלה חסרים תכונות BBB מוגדרות רבות 7,9,11,12. הבנה מלאה של אינטראקציות Nm-BEC נותרה חמקמקה, בין היתר בשל חוסר היכולת להשתמש במודלים in vivo, הגנה חלקית מפני חיסונים והיעדר מודלים חזקים של BEC אנושיים במבחנה.

מידול hBECs במבחנה היה מאתגר בשל התכונות הייחודיות של BECs. בהשוואה לתאי אנדותל היקפיים, לתאי BEC יש מספר פנוטיפים המשפרים את תכונות המחסום שלהם, כגון התנגדות חשמלית טרנס-אנדותל גבוהה (TEER) עקב צמתים הדוקים מורכבים12. לאחר שהוסרו מהמיקרו-סביבה במוח, BECs מאבדים במהירות את תכונות המחסום שלהם, מה שמגביל את התועלת של מודלים ראשוניים או מונצחים במבחנה שיוצרים רק מחסום חלש12,13. השילוב של הספציפיות האנושית של זיהומי ננומטר, היעדר מודלים חזקים in vivo ואתגרים במידול BECs אנושיים במבחנה יוצר צורך במודלים טובים יותר כדי להבין את האינטראקציה המורכבת בין ננומטר לפתוגן בין ננומטר ל-BEC. לאחרונה נעשה שימוש בטכנולוגיות מודל של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSC), תאים דמויי BEC הופקו מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) המחקים טוב יותר BECs in vivo12,13,14,15. iPSC-BECs הם ממקור אנושי, ניתנים להרחבה בקלות, ובעלי פנוטיפים צפויים של BEC בהשוואה לעמיתיהם העיקריים או המונצחים 12,13,14,15. בנוסף, אנו ואחרים הוכחנו כי iPSC-BECs שימושיים למידול מחלות שונות של מערכת העצבים המרכזית, כגון אינטראקציה בין פונדקאי לפתוגן, מחלת הנטינגטון ומחסור ב-MCT8 הגורם לתסמונת אלן-הורנדון-דאדלי 16,17,18,19,20,21. במאמר זה אנו מדגימים כיצד להפיק iPSC-BECs ממקורות מתחדשים של iPSC וזיהום של iPSC-BECs בננומטר, מה שמוביל להפעלת התגובה החיסונית המולדת. אנו מאמינים כי מודל זה שימושי לחקירת אינטראקציה בין פונדקאי לפתוגן שאינה ניתנת לשחזור במודלים אחרים במבחנה, והוא שימושי במיוחד כאשר בוחנים אינטראקציות עם פתוגנים ספציפיים לבני אדם כגון ננומטר.

Protocol

הערה: כל הכנת המדיה / מגיב, תחזוקת תאי גזע ושלבי התמיינות מותאמים מ- Stebbins et al.22.

1. הכנת החומרים הדרושים לתרבות iPSC ובידול BEC.

  1. ציפוי מטריצה של פלסטיק תרבית רקמה (TC) לתרבית IMR90-4 iPSC
    1. Aliquot מרתף ממברנה מטריקס ג'ל (למשל, Matrigel) לתוך 2.5 מ"ג aliquots ולאחסן ב -20 ° C.
      הערה: יש לעבוד במהירות בעת הטיפול בג'ל המטריצה ובאליציטוט על קרח, מכיוון שהוא יוצר ג'ל מעל 4 מעלות צלזיוס ולא ניתן לאחותו לאחר שהתמצק.
    2. לציפוי פלסטיק TC, הוסף במהירות aliquot אחד של ג'ל מטריצה ל- 30 מ"ל של מדיום הנשר השונה (DMEM)/F12 של Dulbecco בצינור חרוטי של 50 מ"ל. מוסיפים 1 מ"ל של המדיום על ג'ל המטריקס הקפוא, פיפטה למעלה ולמטה עד שהוא מופשר, ומעבירים מיד לצינור החרוטי 50 מ"ל עם המדיום הנותר.
    3. השתמש 1 מ"ל של תמיסת ציפוי ג'ל מטריצה זו לכל באר של צלחת 6 בארות ו 12 מ"ל לכל בקבוק T75.
      הערה: ניתן להכין פלסטיק TC מצופה ג'ל מטריצה עד שבועיים לפני השימוש בו. עם זאת, קריטי להימנע מכך שתמיסת ג'ל המטריצה מתייבשת, מה שעשוי לדרוש הוספה מדי פעם של DMEM/F12 נוסף על גבי הבארות.
  2. הכן מדיום תחזוקת תאי גזע על ידי הוספת 50 מ"ל של תוספת 50x ל 450 מ"ל של תווך בסיסי לתחזוקת תאי גזע בסביבה סטרילית של ארון בטיחות ביולוגית.
    הערה: אמצעי תחזוקת תאי גזע אחרים (mTeSR ו- E8) שימשו במחקרים אחרים 13,14,15, 22,23,24,25.
  3. להכנת 500 מ"ל של מדיום לא מותנה (UM), ערבבו 392.5 מ"ל של DMEM/F12 עם 100 מ"ל של תחליף סרום נוק אאוט (KOSR), 5 מ"ל של חומצות אמינו לא חיוניות, L-גלוטמין בריכוז סופי של 1 מילימול, ו-3.5 מיקרוליטר של β-מרקפטואתנול. יש לסנן-לעקר ולאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים.
  4. כדי להכין 200 מ"ל של תאי אנדותל (EC) בינוניים בתוספת חומצה רטינואית (RA) בתוספת bFGF, שלבו 198 מ"ל של מדיום ללא סרום אנדותל אנושי (hESFM), 2 מ"ל של סרום נגזר מעוקר טסיות (PDS) ו-20 ננוגרם/מ"ל bFGF. יש לסנן, לעקר ולאחסן עד שבועיים בטמפרטורה של 4°C. ממש לפני התוספת לתאים, הוסף 10 מיקרומטר של RA למדיום EC.
    הערה: מכיוון ש-PDS הופסק ולכן עשוי להיות מוגבל, פרוטוקול זה בוצע בהצלחה באמצעות B27 במקום PDS 15,23,26.
  5. כדי להכין 200 מ"ל של מדיום EC ללא RA או bFGF, שלב 198 מ"ל של hESFM ו -2 מ"ל של PDS מעוקר מסנן ועיקור מסנן. יש לאחסן עד 4 שבועות בטמפרטורה של 4°C.

2. תחזוקת תרבית תאים IMR90-4

הערה: כאן אנו משתמשים בקו תאי IMR90-4 כדוגמה, אולם קווי תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אחרים כגון CC3, CD10, CD12, DF19-9-11T, 83iCTR, 00iCTR ו- CS03iCTRn2 שימשו בהצלחה להבחנה ל- BECs 13,14,15,16,17,23,27,28.

  1. תרבית iPSCs ב 37 ° C ב 5% CO 2 ובדרך כלל לשמור על לוחות 6 באר בצפיפות שונים עם2 מ"ל של תווך תחזוקה תאי גזע לכל באר.
  2. לשמירה על תרבות iPSC, בחר באר אחת למעבר שאינה חופפת ויש בה שטחים פתוחים בין מושבות.
    1. שאפו את מדיום התרבית, הוסיפו 1 מ"ל של מגיב דיסוציאציה של תאים לא אנזימטיים, ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך 7 דקות. בזמן שהדגירה נמשכת, החלף את תמיסת ג'ל המטריצה, על צלחת חדשה בת 6 בארות, עם 2 מ"ל של אמצעי תחזוקה טריים של תאי גזע לכל באר.
    2. שאפו בזהירות את מגיב הדיסוציאציה התאית הלא אנזימטית, תוך הקפדה שלא לשאוף תאים שעדיין מחוברים לצלחת.
    3. מוסיפים 6 מ"ל של אמצעי תחזוקה של תאי גזע ושוטפים את תחתית הבאר מספר פעמים עד שכל התאים מנותקים לחלוטין. לאחר מכן, זרעו את הצלחת החדשה בעלת 6 הקידוחים בצפיפויות משתנות, בדרך כלל 1:6 או 1:12 לתחזוקה רגילה.
      הערה: באמצעות היחסים הנ"ל, התאים מפוצלים כפעמיים בשבוע.
    4. העבירו את הצלחת לאינקובטור ופזרו את תאי הזרעים באופן שווה על פני הבארות על ידי ניעור הצלחת קדימה ואחורה ומשמאל לימין, תוך הפסקה בין תנועות ניעור לסירוגין עד שהמדיום שוקע.

3. התמיינות של תאי אנדותל במוח מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים

  1. ציפוי iPSCs לבידול (יום -3 של פרוטוקול הבידול)
    1. לכל תרבית תחזוקה IMR90-4 המשמשת היטב לצלחת להתמיינות, לשאוף את מדיום התרבית, להוסיף 1 מ"ל של מגיב דיסוציאציה תאים אנזימטי לכל באר, ולדגור ב 37 ° C במשך 7 דקות.
    2. נטרל את מגיב הדיסוציאציה האנזימטי של התאים על ידי העברת 1 מ"ל של תרחיף תאים מנותק לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל עם לפחות 2 מ"ל של אמצעי תחזוקה טריים של תאי גזע לכל 1 מ"ל של תאים. סובב את מתלה התא במהירות של 1,500 x גרם למשך 5 דקות.
    3. להשהות מחדש את גלולת התא ב 1 מ"ל של אמצעי תחזוקה של תאי גזע לכל באר של תאי IMR90-4 בשימוש, ולספור את התאים באמצעות המוציטומטר.
      הערה: ייתכן שיהיה מועיל לדלל 1:1 עם 0.4% טריפאן כחול כדי להבחין בין תאים חיים ומתים בעת ספירה. בהתאם לצפיפות של iPSCs, באר אחת של צלחת 6 בארות מניבה בדרך כלל 1\u20122 x 106 תאים.
    4. להתמיינות בצלוחית T75, יש להוסיף 7.5 x 105 תאים ל-12 מ"ל של מדיום תחזוקת תאי גזע ומעכב ROCK (Y27632 דיהידרוכלוריד) בריכוז סופי של 10 מיקרומטר. תמיסת ציפוי ג'ל מטריצה שואפת מבקבוק T75 ומעבירים את תרחיף התא לצלוחית. פזרו את התאים באופן שווה על ידי ניעור הבקבוק קדימה ואחורה ומשמאל לימין (ראו שלב 2.2.4) ודגרו בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2.
      הערה: זה קריטי להוסיף מעכב ROCK בשלב זה כדי לשפר את ההישרדות של תאי גזע בודדים מנותקים25,29. התאים צריכים להיות מפוזרים באופן שווה על פני הבקבוק ובסינגלים המציגים מורפולוגיה מפוזרת, דמוית מזנכימלית עקב הטיפול במעכבי ROCK22.
  2. ביום -2 וביום -1, שנה את המדיה למדיום תחזוקת תאי גזע טריים; 12 מ"ל לכל T75.
  3. ביום 0, התחל בידול על ידי שינוי מדיה ל- UM; 12 מ"ל לכל T75.
  4. שנה UM מדי יום (יום 1 - יום 5).
    הערה: התאים בדרך כלל מגיעים למפגש לאחר 2 עד 3 ימים ב- UM, אשר ניתן לצפות בעין בלתי או דרך מיקרוסקופ שדה בהיר הפוך. ככל שההתמיינות מתקדמת, "מערכות עצביות" של nestin+ הופכות גלויות עם תאי PECAM-1+ בין לבין כפי שתואר קודם לכן 13,14.
  5. להרחיב באופן סלקטיבי את אוכלוסיית תאי האנדותל על ידי מעבר לתווך EC עם 20 ננוגרם/מ"ל bFGF ו-10 מיקרומטר חומצה רטינואית (RA) (יום 6) ודגרה במשך יומיים. EC בינוני עם bFGF ניתן להכין עד שבועיים לפני. RA מתווסף ממלאי קפוא ביום השימוש (למשל, 1 μL של 10 mM מלאי RA לכל 1 מ"ל של EC + bFGF).
    הערה: ניתן להשיג בידול מוצלח גם ללא תוספת של RA בימים 6 ו-8. עם זאת, השמטת RA תניב BECs עם TEER מופחת12,13,14.
  6. ציפוי צלחות תרבית תאים ותוספות קרום (למשל, Transwell) עם קולגן IV ופיברונקטין (יום 7), לטיהור BECs ולאחר ניסויים.
    1. לציפוי של תוספות ממברנה, ערבבו 4 חלקים קולגן IV (1 מ"ג/מ"ל ב-0.5 מ"ג/מ"ל חומצה אצטית), חלק אחד פיברונקטין (1 מ"ג/מ"ל) ו-5 חלקים מים סטריליים באיכות רקמה. ניתן לדלל את תמיסת ECM ביחס 1:5 לציפוי לוחות תרבית תאים (כלומר, 4 חלקים קולגן IV, חלק אחד פיברונקטין ו-45 חלקים מים). יש לדגור עם תמיסת ציפוי בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה.
      הערה: ניתן גם לצפות צלחות ותוספות קרום במשך 4 שעות לפחות לפני תרבית משנה באותו יום של שלב הטיהור.
  7. לטהר BECs על ידי subculturing התאים ממוינים על קולגן IV לוחות מצופים פיברונקטין או תוספות ממברנה (יום 8).
    1. לשאוף EC בינוני ולהוסיף מגיב דיסוציאציה תאים אנזימטי (12 מ"ל לכל T75). יש לדגור בטמפרטורה של 37°C עד ש-90% מהתאים התנתקו מהבקבוק.
      הערה: דיסוציאציה של תאים עשויה להימשך עד שעה אחת.
    2. בזמן הדגירה, הסירו את תמיסת ציפוי הקולגן IV/פיברונקטין מצלחות/תוספות שהוכנו בעבר והניחו להן להתייבש במכסה מנוע סטרילי. לוקח בערך 20 דקות לתוספות להתייבש.
    3. לאחר ניתוק התאים, שטפו אותם מהבקבוק באמצעות פיפטה של 10 מ"ל. פיפטה למעלה ולמטה כדי להשיג השעיה של תא בודד.
      הערה: תרחיף תא בודד חשוב לספירת תאים אמינה ולהשגת חד-שכבות מוצקות.
    4. לדלל עם לפחות נפח שווה של hESFM טרי בצינור חרוטי 50 מ"ל ולספור תאים באמצעות המוציטומטר.
    5. מטילים את התאים על 1,500 x גרם במשך 10 דקות.
    6. יש להשהות תאים בנפח מתאים של EC + bFGF + RA טריים שהוכנו כדי להשיג השעיה של 2 x 106 תאים/מ"ל לזריעה על תוספות ממברנה. הוסף 500 μL (1 x 106 תאים) על גבי תוספת 12 בארות ו 1.5 מ"ל של EC + bFGF + RA בינוני בתחתית. לזריעה על לוחות 24 ו -48 בארות, לדלל את תרחיף התא 1: 2 ולהוסיף 500 μL (5 x 105 תאים) ו 250 μL (2.5 x 105 תאים) לכל באר, בהתאמה. יש לפזר תאים באופן שווה על פני הבאר/להכניס (ראה שלב 2.2.4) ולדגור ב-37°C תחת 5% CO2.
  8. שנה מדיה על צלחות/טרנסוולים ל- EC ללא bFGF או RA (יום 9).
  9. ביצוע ניסויי זיהום, מדידת TEER וצביעה אימונופלואורסצנטית כמתואר בסעיפים הבאים (יום 10).
    הערה: BECs ממוינים ומטוהרים בהצלחה מגיעים בדרך כלל לשיא TEER ביום 10 ומבטאים סמנים אופייניים של תאי אנדותל במוח כגון PECAM-1 (CD31) ו- VE-cadherin, מעביר הגלוקוז GLUT-1, מובילי efflux כגון p-גליקופרוטאין, ורכיבי צומת הדוק ZO-1, Occludin, ו- Claudin-5 13,14,16,17,19,22 . עיין ב- Lippmann et al., Stebbins et al. ואחרים לקבלת פרטים נוספים ותמונות של סוגי התא, מורפולוגיות וביטוי של סמנים ספציפיים לסוג התא במהלך תהליך ההתמיינות 13,14,15,16,17,19,22. תמונות מייצגות של תאי IMR90-4 בשלבים שונים בתהליך התמיינות BEC ניתן למצוא באיור משלים 1.

4. התנגדות חשמלית טרנסאנדותל (TEER) כמדד להידוק מחסום

הערה: TEER נקרא בדרך כלל על תוספות ממברנה בימים 9 ו-10 של התמיינות כדי לאשר יצירה מוצלחת של מחסומים היוצרים iPSC-BECs (איור 1A).

  1. מקם את מד הוולט-אוהם האפיתל (EVOM) בסביבה סטרילית של מכסה מנוע בטיחות ביולוגית וחבר את האלקטרודה ל- EVOM.
  2. יש לחטא את האלקטרודה על ידי טבילתה ב-70% EtOH למשך 5 דקות לפחות ולתת לה להתייבש לחלוטין.
    הערה: דגירה ארוכה יותר ב-70% EtOH או טיהור האלקטרודה באמצעות תמיסת היפוכלוריט 5% אפשרית במידת הצורך.
  3. אחזר את iPSC-BECs על תוספות ממברנה מן האינקובטור ולמדוד TEER.
    הערה: חשוב לקרוא TEER במהירות לאחר ההסרה מהאינקובטור מכיוון ששינוי הטמפרטורה עלול להשפיע על מדידת TEER.
  4. קרא את TEER על ידי טבילת האלקטרודה בתווך כך שהאלקטרודה הקצרה יותר תמוקם על גבי האינסרט והאלקטרודה הארוכה יותר תגיע למדיום המקיף את העלון.
    הערה: ודא שהאלקטרודות בקצות "מקלות האכילה" מכוסות לחלוטין בנוזל. במידת הצורך, הטו את הבאר כדי להשיג זאת לפני שתניחו שוב את הצלחת למדידה.

5. צביעת Immunofluorescence (IF) לאימות פנוטיפ BEC

הערה: כדי לאמת את האיכות של התאים המתמיינים והמטוהרים במלואם, חד-שכבות iPSC-BEC מוכתמות עבור הסמנים האופייניים של תאי אנדותל במוח ביום ה-10 של תהליך ההתמיינות כפי שתואר קודם לכן (איור 1B\u2012G) 13,14,15,16,17,19,22.

  1. שאפו את המדיום ושטפו 1x עם PBS.
  2. תקן תאים עם מתנול קר כקרח בטמפרטורת החדר (RT) למשך 15 דקות.
  3. יש לשטוף 3x עם מלח חוצץ פוספט (PBS) ולחסום עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) ב- PBS ב- RT למשך שעה אחת.
  4. לשאוף ולהוסיף נוגדנים ראשוניים מדוללים בתמיסת חסימה. יש לדגור על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    הערה: עיין בטבלת החומרים ו- Stebbins et al. למידע הקשור למקור ודילול הנוגדנים22.
  5. יש לשטוף 3x עם PBS לפני הוספת נוגדן משני מדולל בתמיסת חסימה. דגירה ב-RT למשך שעה אחת. הגן על דגימות מפני אור מנקודה זו ואילך.
  6. יש לשטוף פעמיים עם PBS. לאחר מכן, הוסף DAPI בדילול של 1:5,000 ב- PBS והכתים ב- RT למשך 15 דקות.
  7. יש לשטוף 1x ולהשאיר את PBS דולק ולצלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

6. הכנת חיידקים וזיהום של iPSC-BECs

  1. יום לפני ניסוי ההדבקה (יום 9 להתמיינות), התחילו תרבית לילה של החיידקים ממלאי קפוא. להדבקה ב-Nm, יש למרוח חיידקים על אגר קולומביה עם 5% דם כבשים (אגר דם). לדגור על תרביות חיידקים בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 למשך הלילה.
  2. למחרת (יום 10), הכינו PPM+ טרי על ידי תוספת פרוטאז פפטון מדיה (PPM) עם 50 μL של 2 M MgCl 2, 50 μL של2 M NaHCO3, ותוסף של 100 μL Kellogg לכל 10 מ"ל. יש לחסן 10 מ"ל של PPM+ בינוני בצינור חרוטי של 50 מ"ל עם Nm מצלחת תרבית הלילה באמצעות צמר גפן סטרילי. לדגור על רעידות ב-200 סל"ד ב-37°C למשך שעה וחצי (כלומר, עד שהחיידקים נמצאים בשלב גידול לוגריתמי).
  3. במהלך הדגירה החיידקית, יש להכין iPSC-BECs בצלחת של 24 בארות או על תוספות ממברנה לזיהום על ידי החלפת התווך הישן ב-400 μL של מדיום EC טרי (ללא bFGF או RA) לכל באר/ראש ממברנה נוסף.
  4. תרבית חיידקים צנטריפוגה ב 4000 x גרם במשך 10 דקות ושואפת את התקשורת. להשהות מחדש את גלולת החיידקים ב 250 μL של PBS.
  5. ב-4 מ"ל של PBS טרי, יש להשתמש בחלק מתרחיף תאי החיידק ולהתאים ל-OD600 של 0.4 (בערך 1 x 108 CFU/מ"ל).
  6. לאחר מכן, לדלל את החיידקים בתווך תרבית תאים (EC medium) בהתאם לריבוי הרצוי של זיהום (MOI).
    הערה: לדוגמה, עבור MOI של 10, יש לדלל 1:10 או 1:5 בעת הדבקת iPSC-BECs בצלחת של 24 בארות או בתוספות ממברנה, בהתאמה (1 x 105 תאים לכל חד-שכבה בצלחת של 24 בארות). תוספת של נסיוב אנושי אינה כלולה בהכנת Nm לזיהום כפי שתואר בכתבי יד אחרים, שכן נצפתה השפעה מזיקה על פנוטיפ מחסום iPSC-BEC כפי שנמדד על ידי TEER (נתונים לא מוצגים)30,31. עם זאת, האינטראקציה של Nm ו- iPSC-BECs אינה מושפעת עם או בלי סרום אנושי (הנתונים אינם מוצגים).
  7. להדביק iPSC-BECs בכל באר עם 100 μL של החיידקים מוכנים תרחיף לדגור על הזמן הרצוי של ההדבקה.
    הערה: ביטוי של מספר ציטוקינים וכימוקינים מעודדי דלקת מוגבר ב-iPSC-BECs כאשר הם נגועים ב-Nm, באופן הבולט ביותר לאחר 8 שעות של זיהום, כפי שתואר קודם לכן על-ידי Martins-Gomes et al (איור 2)19.

7. הפעלה חיסונית מולדת על ידי PCR כמותי

הערה: באמצעות בידוד RNA מועדף, סינתזת cDNA ופרוטוקול qPCR, אספו דגימות והריצו qPCR על ציטוקינים נבחרים.

  1. 7.1. לאסוף את ה-RNA מדגימות BEC לאחר ההדבקה ביום ה-10 של פרוטוקול ההתמיינות, באמצעות ריאגנטים היוצרים ערכת בידוד RNA מסחרית (ראה טבלת חומרים).
    הערה: הימנע מזיהום נוקלאז של דגימות על-ידי עבודה זהירה בסביבה נקייה ומעוקרת.
    1. הכינו חיץ ליזיס והוסיפו 350 μL לכל באר/שכבה אחת של iPSC-BECs.
    2. אספו את הדגימות על ידי צנרת מעלה ומטה מספר פעמים (למשל, פי 20) והעברת המתלה לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי.
      הערה: ניתן לאחסן דגימות בטמפרטורה של -80°C עד שהן מוכנות לבידוד RNA.
    3. עקוב אחר הפרוטוקול שסופק עם ערכת בידוד RNA לטיהור RNA מתאים ורקמות בתרבית.
    4. לאחר ההפחתה במים נטולי נוקלאז, יש לשמור דגימות RNA על קרח כדי למזער כל פעילות פוטנציאלית של RNase.
    5. הערכת ריכוזי RNA על ספקטרופוטומטר (למשל, Nanodrop).
  2. צור ספריית cDNA מהרנ"א שנאסף באמצעות ערכת סינתזת cDNA (ראה טבלת חומרים).
    1. הגדר תגובות המורכבות מתערובת אב לסינתזה cDNA, לפחות 200 ננוגרם (רצוי 500 ננוגרם) של רנ"א דגימה, ומים נטולי נוקלאז בנפח תגובה כולל מוגדר כמתואר בפרוטוקול של ערכת סינתזת cDNA.
    2. על מחזור תרמי סטנדרטי, הפעל תוכנית המתאימה לריאגנטים של ערכת סינתזת cDNA בשימוש. לדוגמה: 25°C למשך 2 דקות, 55°C למשך 10 דקות, 95°C למשך דקה אחת.
    3. לאחר הסינתזה, לדלל את cDNA עד 1:10 במים נטולי נוקלאז ולהעביר דגימות ל 4 ° C לטווח קצר או -20 ° C לאחסון לטווח ארוך.
      הערה: דילול נמוך יותר עשוי להיות נחוץ אם ריכוז RNA היה נמוך (למשל, מתחת 50 ng). cDNA מדולל יכול להיות מאוחסן ב -20 ° C עד שנה.
  3. בצע qPCR על דגימות cDNA המכוונות לתעתיקים של גנים של תגובה חיסונית מולדת כגון ציטוקינים וכימוקינים עם פריימרים שתוכננו ואומתו בקפידה.
    הערה: מכיוון שתכנון פריימר חשוב מאוד לאיכות תוצאות qPCR, יש לבדוק את יעילות הפריימר בביצוע סדרת דילול ולוודא היעדר מוצרים מרובים על ג'ל DNA.
    1. לכל תגובה של 25 μL, יש להשתמש בפריימר הפוך 0.5 μL קדימה ו-0.5 μL הפוך (10 mM במים נטולי נוקלאז), 1 μL cDNA, 10.5 μL נטול נוקלאז H2O ו-12.5 μL qPCR Master Mix.
    2. בצע את התגובה במכשיר qPCR באמצעות פרוטוקול המחזור הבא: (א) 4 ° C למשך 2 דקות; (ב) 95° צלזיוס למשך 15 דקות; (ג) 95° צלזיוס למשך 15 שניות; (ד) 60° צלזיוס למשך דקה אחת; מחזור דרך (ג) ו-(ד) 45 פעמים; (ה) עקומת התכה אופציונלית: 30\u201299 °C במרווחים של 1°C; 25°C למשך 5 דקות.
    3. לניתוח נתונים, השתמש בחישוב ΔΔCT כדי להשוות את רמות ביטוי הציטוקינים והכימוקינים לגן ייחוס כגון 18S או GAPDH.

תוצאות

הפרוטוקול המתואר כאן מאומץ על ידי Stebbins et al. ומדגיש את התהליך להתמיין iPSCs לתאי אנדותל דמויי מוח בעלי תכונות BBB, וכיצד להשתמש במודל זה למחקרי זיהום באמצעות iPSC-BECs עם Nm19,22. iPSC-BECs, כאשר הם מובחנים כראוי, מציגים תכונות מחסום הדוק שנמדדו על-ידי TEER שלעתים קרובות גדולות ...

Discussion

מידול BECs ו- BBB נתקל באתגרים, שכן BECs אנושיים ראשוניים ומונצחים, במבחנה, נוטים להיות חסרי פנוטיפים מחסום חזקים. הופעתן של טכנולוגיות תאי גזע אנושיים אפשרה יצירת תאים דמויי BEC שמקורם ב- iPSC השומרים על פנוטיפים BBB בולטים צפויים כגון סמני אנדותל, ביטוי צומת הדוק, תכונות מחסום, תגובה לסוגי תאי CN...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

L.M.E. נתמך על ידי תוכנית ההכשרה למחקר DFG GRK2157 שכותרתה "מודלים תלת-ממדיים של רקמות לחקר זיהומים מיקרוביאליים על ידי פתוגנים אנושיים" שהוענקה ל- A. S-U. B.J.K. נתמך על ידי מלגת פוסט-דוקטורט של קרן אלכסנדר פון הומבולדט. בנוסף, אנו מודים ללנה וולטר על עזרתה הטכנית ביצירת iPSC-BECs בתרבות.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Accutase (1x)SigmaA6964Enzymatic cell dissociation reagent
Acetic acidSigmaA6283
All-trans retinoic acid (RA)SigmaR2625
Anti-CD31 (PECAM-1)Thermo Scientific (Labvision)RB-10333
Anti-Claudin-5Invitrogen4C3C2
Anti-Glut-1Thermo Scientific (Labvision)SPM498 (MA5-11315)
Anti-OccludinInvitrogen33-1500
Anti-VE-cadherinSanta Cruzsc-52751
Anti-ZO-1Invitrogen33-9100
Bacto Proteose PeptoneBD211684
b-MercaptoethanolMerck (Sigma-Aldrich)805740
Cell culture plates and flasksSarstedt
Centrifuge (Heraeus Megafuge 1.0R)Thermo Scientific
Class II biosafety cabinetNuaireNU-437-400E
CO2 Incubator (DHD Autoflow CO2 Air-Jacketed Incubator)Nuaire
Collagen IVSigmaC5533
Columbia ager + 5 % sheep bloodBiomerieux43049
Costar Transwell polyester filters (12- or 24-well)Corning3460, 3470
D(+)-GlucoseMerck (Sigma-Aldrich)G8270
DAPIInvitrogenD1306
DMEM/F12Gibco31330-038
DMSOROTHA994.1
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)Gibco21600-069
Epithelial Volt-Ohm Meter (Millicell ERS-2) with STX electrodeMerck (Millipore)MERS00002
Fe(NO3)3ROTH5632.1
FibronectinSigmaF1141
Fluoresence microscope (Eclipse Ti)Nikon
Hemacytometer (Neubauer)A. HartensteinZK06
Human basic fibroblast growth factor (bFGF)PeproTech100-18B
Human Endothelial Serum Free Medium (hESFM)Gibco11111-044
Inverted microscope (Wilovert)Hund (Will Wetzlar)
iPS(IMR90)-4 cellsWiCell
Kellogg's supplementTo prepare 110 ml of Kellogg's supplement, prepare 100 ml of 4 g/ml glucose, 0.1 g/ml glutamine, and 0.2 mg/ml thiamine pyrophosphate and 10 ml of 5 mg/ml Fe(NO3)3 and combine the solutions. Filter sterilize and store aliquoted at -20 °C.
Knockout serum replacement (KOSR)Gibco10828-028
L-glutamine (GlutaMAX)Invitrogen35050-038
LunaScript RT SuperMix KitNEBE3010LcDNA synthesis kit
Matrigel MatrixCorning354230
MethanolROTH4627.5
MgCl2ROTHKK36.1
Micropipettes (Research Plus)Eppendorf
NaHCO3ROTH6329
Nonessential amino acids (NEAA)Gibco11140-035
NucleoSpin RNA isolation kitMachery-Nagel740955RNA isolation kit
Pipette boy (Accu-Jet Pro)Brand
Platelet poor plasma-derived serum, bovine (PDS)Fisher50-443-029
PowerUp SYBR Green Master MixApplied BiosystemsA25742qPCR master mix
qPCR film (MicroAmp Optical Adhesive Film)Applied Biosystems4211971
qPCR plates (MicroAmp Fast 96-well)Applied Biosystems4346907
ROCK inhibitor, Y27632 dihydrochlorideTocris1254
RT-PCR thermo cycler (StepOnePlus)Applied Biosystems4376600
Serological pipettesSarstedt
StemFlex basal medium + 50x StemFlex supplementGibcoA3349401Stem-cell maintenance medium
Swinging Bucket Rotor (Heraeus #2704)Thermo Scientific
Thiamine pyrophosphateSigmaC8754-5G
Trypan Blue Solution, 0.4%Gibco15250061
VerseneGibco15040-033Non-enzymatic cell dissociation reagent (EDTA)

References

  1. Rua, R., McGavern, D. B. Advances in Meningeal Immunity. Trends in Molecular Medicine. 24 (6), 542-559 (2018).
  2. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  3. Rouphael, N. G., Stephens, D. S. Neisseria meningitidis: Biology, microbiology, and epidemiology. Methods in Molecular Biology. , (2012).
  4. Stephens, D. S., Greenwood, B., Brandtzaeg, P. Epidemic meningitis, meningococcaemia, and Neisseria meningitidis. Lancet. 369 (9580), 2196-2210 (2007).
  5. Le Guennec, L., Coureuil, M., Nassif, X., Bourdoulous, S. Strategies used by bacterial pathogens to cross the blood-brain barrier. Cellular Microbiology. , (2020).
  6. Doran, K. S., et al. Host-pathogen interactions in bacterial meningitis. Acta Neuropathologica. 131 (2), 185-209 (2016).
  7. Cunha, C. S. E., Griffiths, N. J., Virji, M. Neisseria meningitidis opc invasin binds to the sulphated tyrosines of activated vitronectin to attach to and invade human brain endothelial cells. PLoS Pathogens. , (2010).
  8. Coureuil, M., et al. Meningococcus hijacks a β2-adrenoceptor/β-arrestin pathway to cross brain microvasculature endothelium. Cell. 143 (7), 1149-1160 (2010).
  9. Bernard, S. C., et al. Pathogenic Neisseria meningitidis utilizes CD147 for vascular colonization. Nature Medicine. 20 (7), 725-731 (2014).
  10. Slanina, H., Hebling, S., Hauck, C. R., Schubert-Unkmeir, A. Cell invasion by neisseria meningitidis requires a functional interplay between the focal adhesion kinase, Src and cortactin. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
  11. Unkmeir, A., et al. Fibronectin mediates Opc-dependent internalization of Neisseria meningitidis in human brain microvascular endothelial cells. Molecular Microbiology. 46 (4), 933-946 (2002).
  12. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2015).
  13. Lippmann, E. S., et al. Derivation of Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).
  14. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2014).
  15. Hollmann, E. K., Bailey, A. K., Potharazu, A. V., Neely, M. D., Bowman, A. B., Lippmann, E. S. Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. , (2017).
  16. Kim, B. J., et al. Modeling Group B Streptococcus and Blood-Brain Barrier Interaction by Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells. mSphere. , (2017).
  17. Kim, B. J., et al. Streptococcus agalactiae disrupts P-glycoprotein function in brain endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 26 (2019).
  18. Kim, B. J., Shusta, E. V., Doran, K. S. Past and Current Perspectives in Modeling Bacteria and Blood–Brain Barrier Interactions. Frontiers in Microbiology. , (2019).
  19. Martins Gomes, S. F., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells as a Cellular Model to Study Neisseria meningitidis Infection. Frontiers in Microbiology. , (2019).
  20. Vatine, G. D., et al. Modeling Psychomotor Retardation using iPSCs from MCT8-Deficient Patients Indicates a Prominent Role for the Blood-Brain Barrier. Cell Stem Cell. , (2016).
  21. Lim, R. G., et al. Huntington's Disease iPSC-Derived Brain Microvascular Endothelial Cells Reveal WNT-Mediated Angiogenic and Blood-Brain Barrier Deficits. Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).
  22. Stebbins, M. J., Wilson, H. K., Canfield, S. G., Qian, T., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells. Methods. 101, 93-102 (2016).
  23. Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).
  24. Wilson, H. K., Canfield, S. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Exploring the effects of cell seeding density on the differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. , (2015).
  25. Wilson, H. K., Faubion, M. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Cryopreservation of brain endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells is enhanced by rho-associated coiled coil-containing kinase inhibition. Tissue Engineering - Part C: Methods. , (2016).
  26. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. , (2017).
  27. Sances, S., et al. Human iPSC-Derived Endothelial Cells and Microengineered Organ-Chip Enhance Neuronal Development. Stem Cell Reports. , (2018).
  28. Canfield, S. G., et al. An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Journal of Neurochemistry. , (2017).
  29. Kurosawa, H. Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. , (2012).
  30. Schubert-Unkmeir, A., Sokolova, O., Panzner, U., Eigenthaler, M., Frosch, M. Gene expression pattern in human brain endothelial cells in response to Neisseria meningitidis. Infection and Immunity. 75 (2), 899-914 (2007).
  31. Sokolova, O., et al. Interaction of Neisseria meningitidis with human brain microvascular endothelial cells: Role of MAP- and tyrosine kinases in invasion and inflammatory cytokine release. Cellular Microbiology. 6 (12), 1153-1166 (2004).
  32. Alimonti, J. B., et al. Zika virus crosses an in vitro human blood brain barrier model. Fluids and Barriers of the CNS. , (2018).
  33. Kim, B. J., Schubert-unkmeir, A. In vitro Models for Studying the Interaction of Neisseria meningitidis with Human Brain Endothelial Cells. Neisseria meningitidis: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. 1969, 135-148 (2019).
  34. Kim, B. J., et al. Bacterial induction of Snail1 contributes to blood-brain barrier disruption. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2473-2483 (2015).

Erratum


Formal Correction: Erratum: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells
Posted by JoVE Editors on 10/12/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells Larvae. The Authors section was updated from:

Leo M. Endres1
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama

to:

Leo M. Endres1
Sarah F. Hathcock2
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Neisseria meningitidisin vivoTEERBECsBECsiPSCsBECs IPSC iPSC BECs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved