Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Method Article
Burada açıklanan protokol, indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı beyin benzeri endotel hücrelerinin ayırt edilmesinde, enfeksiyon için Neisseria meningitidis'in hazırlanmasında ve diğer moleküler analizler için numune toplanmasında ana adımları vurgulamaktadır.
Meningokok menenjiti, Neisseria meningitidis (meningokok , Nm) son derece özelleşmiş beyin endotel hücrelerine (BEC'ler) nüfuz ederek merkezi sinir sistemine (CNS) erişebildiğinde ortaya çıkan hayatı tehdit eden bir enfeksiyondur. Nm insana özgü bir patojen olduğundan, sağlam in vivo model sistemlerinin olmaması, Nm ve BEC'ler arasındaki konak-patojen etkileşimlerinin incelenmesini zorlaştırmakta ve doğal BEC'leri taklit eden insan tabanlı bir modele ihtiyaç duyulmasını sağlamaktadır. BEC'ler, karmaşık sıkı bağlantılar ve yüksek trans-endotelyal elektrik direnci (TEER) ile karakterize periferik endotel hücrelerine kıyasla daha sıkı bariyer özelliklerine sahiptir. Bununla birlikte, birincil BEC'ler ve ölümsüzleştirilmiş BEC'ler gibi birçok in vitro model, doğal nöral mikroçevreden çıkarıldıktan sonra bariyer özelliklerinden yoksundur veya hızla kaybeder. İnsan kök hücre teknolojilerindeki son gelişmeler, diğer in vitro insan modellerine kıyasla fenoskopi BEC'lerini daha iyi hale getiren indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) beyin benzeri endotel hücreleri türetmek için yöntemler geliştirmiştir. Nm-BEC etkileşimini modellemek için iPSC'den türetilen BEC'lerin (iPSC-BEC'ler) kullanılması, BEC bariyer özelliklerine sahip insan hücrelerini kullanma avantajına sahiptir ve bariyer yıkımını, doğuştan gelen bağışıklık aktivasyonunu ve bakteri etkileşimini incelemek için kullanılabilir. Burada, bakteri preparasyonu, enfeksiyon ve analiz için numune toplamaya ek olarak iPSC'lerden iPSC-BEC'lerin nasıl türetileceğini gösteriyoruz.
Kan-beyin bariyeri (BBB) ve meningeal kan-BOS bariyeri (mBCSFB), dolaşımı merkezi sinir sisteminden (CNS) ayıran ve esas olarak oldukça özelleşmiş beyin endotel hücrelerinden (BEC'ler) oluşan son derece sıkı hücresel bariyerlerdir1,2. Birlikte, BEC'ler birçok toksin, ilaç ve patojeni hariç tutarken, beynin içindeki ve dışındaki besinleri ve atık ürünleri düzenleyerek uygun beyin homeostazını korur 1,2. Bakteriyel menenjit, kan yoluyla bulaşan bakteriler BEC'lerle etkileşime girebildiğinde ve BEC'ler tarafından oluşturulan bariyere nüfuz edebildiğinde ve iltihaplanmaya neden olduğunda ortaya çıkar. Neisseria meningitidis (Nm, meningokok), sağlıklı bireylerin %10\u201240'ında nazofarenksi kolonize eden Gram negatif bir bakteridir, ancak bazı durumlarda ciddi sistemik hastalığa neden olabilir3. Etkilenen bireylerde Nm, purpura fulminans'a neden olabileceği kan dolaşımına erişebilir ve ayrıca menenjite neden olan CNS'ye erişim sağlayan BEC'lere nüfuz edebilir3. Nm, dünya çapında bakteriyel menenjitin önde gelen bir nedenidir ve aşılama çabalarına rağmen hala menenjitin birincil nedenidir4. Antibiyotik tedavisi gibi modern tıbbi müdahaleler bu koşulları hayatta kalmayı mümkün kılmıştır, ancak menenjitten etkilenenler genellikle kalıcı nörolojik hasarla kalmaktadır 5,6.
Önceki çalışmalar, Nm-BEC etkileşimlerinekatkıda bulunan bakteriyel faktörleri ve konakçı sinyallerini tanımlamıştır 7,8,9,10,11. Opaklık proteini Opc ve tip-IV pili gibi tanımlanan adhezinler ve invazinlerin yanı sıra CD147 gibi reseptörler, in vitro olarak çeşitli BEC modellerinde gerçekleştirilmiştir, ancak bu modeller birçok tanımlayıcı BBB özelliğinden yoksundur 7,9,11,12. Nm-BEC etkileşimlerinin tam olarak anlaşılması, kısmen in vivo modellerin kullanılamaması, eksik aşı koruması ve in vitro sağlam insan BEC modellerinin olmaması nedeniyle zor olmaya devam etmektedir.
HCEC'lerin in vitro modellenmesi, BEC'lerin benzersiz özellikleri nedeniyle zor olmuştur. Periferik endotel hücreleri ile karşılaştırıldığında, BEC'ler, karmaşık sıkı bağlantılar nedeniyle yüksek trans-endotelyal elektrik direnci (TEER) gibi bariyer özelliklerini artıran bir dizi fenotipe sahiptir12. Beyin mikroçevresinden çıkarıldıktan sonra, BEC'ler, yalnızca zayıf bir bariyer oluşturan birincil veya ölümsüzleştirilmiş in vitro modellerin kullanışlılığını sınırlayan bariyer özelliklerini hızla kaybeder12,13. Nm enfeksiyonlarının insan özgüllüğü, sağlam in vivo modellerin eksikliği ve insan BEC'lerinin in vitro modellenmesindeki zorlukların birleşimi, Nm ve BEC'ler arasındaki karmaşık konakçı-patojen etkileşimini anlamak için daha iyi modellere ihtiyaç yaratır. Son zamanlarda, model insan kaynaklı pluripotent kök hücre (iPSC) teknolojileri kullanılarak, BEC benzeri hücreler, in vivo BEC'leri daha iyi taklit eden iPSC'lerden türetilmiştir 12,13,14,15. iPSC-BEC'ler insan kökenlidir, kolayca ölçeklenebilir ve birincil veya ölümsüzleştirilmiş muadillerine kıyasla beklenen BEC fenotiplerine sahiptir12,13,14,15. Ek olarak, biz ve diğerleri, iPSC-BEC'lerin konak-patojen etkileşimi, Huntington hastalığı ve Allan-Hurndon-Dudley sendromuna neden olan MCT8 eksikliği gibi CNS'nin çeşitli hastalıklarını modellemek için yararlı olduğunu gösterdik 16,17,18,19,20,21. Burada, yenilenebilir iPSC kaynaklarından iPSC-BEC'lerin nasıl türetileceğini ve doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin aktivasyonuna yol açan iPSC-BEC'lerin Nm ile enfeksiyonunun nasıl türetileceğini gösteriyoruz. Bu modelin, diğer in vitro modellerde özetlenemeyen konakçı-patojen etkileşimini sorgulamak için yararlı olduğuna ve özellikle Nm gibi insana özgü patojenlerle etkileşimleri incelerken yararlı olduğuna inanıyoruz.
NOT: Tüm besiyeri / reaktif hazırlama, kök hücre bakımı ve farklılaşma adımları Stebbins ve ark.22'den uyarlanmıştır.
1. iPSC kültürü ve BEC farklılaşması için gerekli malzemelerin hazırlanması.
2. Bakım IMR90-4 hücre kültürü
NOT: Burada örnek olarak IMR90-4 hücre hattını kullanıyoruz, ancak CC3, CD10, CD12, DF19-9-11T, 83iCTR, 00iCTR ve CS03iCTRn2 gibi diğer indüklenmiş pluripotent kök hücre hatları, BEC'ler 13,14,15,16,17,23,27,28'e farklılaşmak için başarıyla kullanılmıştır.
3. Beyin endotel hücrelerinin insan iPSC'lerinden farklılaşması
4. Bariyer sızdırmazlığının bir ölçüsü olarak transendotelyal elektrik direnci (TEER)
NOT: TEER, bariyer oluşturan iPSC-BEC'lerin başarılı bir şekilde oluşturulduğunu doğrulamak için genellikle farklılaşmanın 9. ve 10. günlerinde membran eklerinde okunur (Şekil 1A).
5. BEC fenotipini doğrulamak için immünofloresan (IF) boyama
NOT: Tamamen farklılaşmış ve saflaştırılmış hücrelerin kalitesini doğrulamak için, iPSC-BEC tek katmanları, daha önce tarif edildiği gibi farklılaşma sürecinin 10. gününde beyin endotel hücrelerinin karakteristik belirteçleri için boyanır (Şekil 1B\u2012G) 13,14,15,16,17,19,22.
6. Bakterilerin hazırlanması ve iPSC-BEC'lerin enfeksiyonu
7. Kantitatif PCR ile doğuştan gelen bağışıklık aktivasyonu
NOT: Tercih edilen bir RNA izolasyonu, cDNA sentezi ve qPCR protokolü kullanarak numuneler toplayın ve seçilen sitokinler üzerinde qPCR çalıştırın.
Burada açıklanan protokol Stebbins ve ark. ve iPSC'leri BBB özelliklerine sahip beyin benzeri endotel hücrelerine ayırma sürecini ve bu modelin Nm19,22 ile iPSC-BEC'leri kullanan enfeksiyon çalışmaları için nasıl kullanılacağını vurgulamaktadır. iPSC-BEC'ler, uygun şekilde farklılaştırıldığında, TEER tarafından ölçülen ve genellikle 2000 Ω·cm2'den büyük olan sıkı bariyer özellikleri sergiler ve VE-kaderin ve CD31 (PE...
BEC'lerin ve BBB'nin modellenmesi, birincil ve ölümsüzleştirilmiş insan BEC'leri, in vitro olarak, sağlam bariyer fenotiplerinden yoksun olma eğiliminde olduğundan, zorluklar yaşamıştır. İnsan kök hücre teknolojilerinin ortaya çıkışı, endotelyal belirteçler, sıkı bağlantı ekspresyonu, bariyer özellikleri, diğer CNS hücre tiplerine yanıt ve fonksiyonel akış taşıyıcıları gibi beklenen ayırt edici BBB fenotiplerini koruyan iPSC'den türetilmiş BEC benzeri hücrelerin üretilmes...
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
L.M.E., A. S-U'ya verilen "İnsan Patojenleri Tarafından Mikrobiyal Enfeksiyonların İncelenmesi için 3D Doku Modelleri" başlıklı GRK2157 DFG araştırma eğitim programı tarafından desteklenmektedir. B.J.K., Alexander von Humboldt Vakfı tarafından doktora sonrası bursu ile desteklenmektedir. Ek olarak, kültürde iPSC-BEC'lerin oluşturulmasındaki teknik yardımı için Lena Wolter'a teşekkür ederiz.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Accutase (1x) | Sigma | A6964 | Enzymatic cell dissociation reagent |
Acetic acid | Sigma | A6283 | |
All-trans retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | |
Anti-CD31 (PECAM-1) | Thermo Scientific (Labvision) | RB-10333 | |
Anti-Claudin-5 | Invitrogen | 4C3C2 | |
Anti-Glut-1 | Thermo Scientific (Labvision) | SPM498 (MA5-11315) | |
Anti-Occludin | Invitrogen | 33-1500 | |
Anti-VE-cadherin | Santa Cruz | sc-52751 | |
Anti-ZO-1 | Invitrogen | 33-9100 | |
Bacto Proteose Peptone | BD | 211684 | |
b-Mercaptoethanol | Merck (Sigma-Aldrich) | 805740 | |
Cell culture plates and flasks | Sarstedt | ||
Centrifuge (Heraeus Megafuge 1.0R) | Thermo Scientific | ||
Class II biosafety cabinet | Nuaire | NU-437-400E | |
CO2 Incubator (DHD Autoflow CO2 Air-Jacketed Incubator) | Nuaire | ||
Collagen IV | Sigma | C5533 | |
Columbia ager + 5 % sheep blood | Biomerieux | 43049 | |
Costar Transwell polyester filters (12- or 24-well) | Corning | 3460, 3470 | |
D(+)-Glucose | Merck (Sigma-Aldrich) | G8270 | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
DMEM/F12 | Gibco | 31330-038 | |
DMSO | ROTH | A994.1 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21600-069 | |
Epithelial Volt-Ohm Meter (Millicell ERS-2) with STX electrode | Merck (Millipore) | MERS00002 | |
Fe(NO3)3 | ROTH | 5632.1 | |
Fibronectin | Sigma | F1141 | |
Fluoresence microscope (Eclipse Ti) | Nikon | ||
Hemacytometer (Neubauer) | A. Hartenstein | ZK06 | |
Human basic fibroblast growth factor (bFGF) | PeproTech | 100-18B | |
Human Endothelial Serum Free Medium (hESFM) | Gibco | 11111-044 | |
Inverted microscope (Wilovert) | Hund (Will Wetzlar) | ||
iPS(IMR90)-4 cells | WiCell | ||
Kellogg's supplement | To prepare 110 ml of Kellogg's supplement, prepare 100 ml of 4 g/ml glucose, 0.1 g/ml glutamine, and 0.2 mg/ml thiamine pyrophosphate and 10 ml of 5 mg/ml Fe(NO3)3 and combine the solutions. Filter sterilize and store aliquoted at -20 °C. | ||
Knockout serum replacement (KOSR) | Gibco | 10828-028 | |
L-glutamine (GlutaMAX) | Invitrogen | 35050-038 | |
LunaScript RT SuperMix Kit | NEB | E3010L | cDNA synthesis kit |
Matrigel Matrix | Corning | 354230 | |
Methanol | ROTH | 4627.5 | |
MgCl2 | ROTH | KK36.1 | |
Micropipettes (Research Plus) | Eppendorf | ||
NaHCO3 | ROTH | 6329 | |
Nonessential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
NucleoSpin RNA isolation kit | Machery-Nagel | 740955 | RNA isolation kit |
Pipette boy (Accu-Jet Pro) | Brand | ||
Platelet poor plasma-derived serum, bovine (PDS) | Fisher | 50-443-029 | |
PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | A25742 | qPCR master mix |
qPCR film (MicroAmp Optical Adhesive Film) | Applied Biosystems | 4211971 | |
qPCR plates (MicroAmp Fast 96-well) | Applied Biosystems | 4346907 | |
ROCK inhibitor, Y27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
RT-PCR thermo cycler (StepOnePlus) | Applied Biosystems | 4376600 | |
Serological pipettes | Sarstedt | ||
StemFlex basal medium + 50x StemFlex supplement | Gibco | A3349401 | Stem-cell maintenance medium |
Swinging Bucket Rotor (Heraeus #2704) | Thermo Scientific | ||
Thiamine pyrophosphate | Sigma | C8754-5G | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
Versene | Gibco | 15040-033 | Non-enzymatic cell dissociation reagent (EDTA) |
An erratum was issued for: Neisseria meningitidis Infection of Induced Pluripotent Stem-Cell Derived Brain Endothelial Cells Larvae. The Authors section was updated from:
Leo M. Endres1
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama
to:
Leo M. Endres1
Sarah F. Hathcock2
Alexandra Schubert-Unkmeir1
Brandon J. Kim1,2
1Institute for Hygiene and Microbiology, University of Würzburg
2Department of Biological Sciences, University of Alabama
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır