Neisseria meningitidis İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Beyin Endotel Hücrelerinin Enfeksiyonu

Özet

Burada açıklanan protokol, indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı beyin benzeri endotel hücrelerinin ayırt edilmesinde, enfeksiyon için Neisseria meningitidis'in hazırlanmasında ve diğer moleküler analizler için numune toplanmasında ana adımları vurgulamaktadır.

Özet

Meningokok menenjiti, Neisseria meningitidis (meningokok , Nm) son derece özelleşmiş beyin endotel hücrelerine (BEC'ler) nüfuz ederek merkezi sinir sistemine (CNS) erişebildiğinde ortaya çıkan hayatı tehdit eden bir enfeksiyondur. Nm insana özgü bir patojen olduğundan, sağlam in vivo model sistemlerinin olmaması, Nm ve BEC'ler arasındaki konak-patojen etkileşimlerinin incelenmesini zorlaştırmakta ve doğal BEC'leri taklit eden insan tabanlı bir modele ihtiyaç duyulmasını sağlamaktadır. BEC'ler, karmaşık sıkı bağlantılar ve yüksek trans-endotelyal elektrik direnci (TEER) ile karakterize periferik endotel hücrelerine kıyasla daha sıkı bariyer özelliklerine sahiptir. Bununla birlikte, birincil BEC'ler ve ölümsüzleştirilmiş BEC'ler gibi birçok in vitro model, doğal nöral mikroçevreden çıkarıldıktan sonra bariyer özelliklerinden yoksundur veya hızla kaybeder. İnsan kök hücre teknolojilerindeki son gelişmeler, diğer in vitro insan modellerine kıyasla fenoskopi BEC'lerini daha iyi hale getiren indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) beyin benzeri endotel hücreleri türetmek için yöntemler geliştirmiştir. Nm-BEC etkileşimini modellemek için iPSC'den türetilen BEC'lerin (iPSC-BEC'ler) kullanılması, BEC bariyer özelliklerine sahip insan hücrelerini kullanma avantajına sahiptir ve bariyer yıkımını, doğuştan gelen bağışıklık aktivasyonunu ve bakteri etkileşimini incelemek için kullanılabilir. Burada, bakteri preparasyonu, enfeksiyon ve analiz için numune toplamaya ek olarak iPSC'lerden iPSC-BEC'lerin nasıl türetileceğini gösteriyoruz.

Giriş

Kan-beyin bariyeri (BBB) ve meningeal kan-BOS bariyeri (mBCSFB), dolaşımı merkezi sinir sisteminden (CNS) ayıran ve esas olarak oldukça özelleşmiş beyin endotel hücrelerinden (BEC'ler) oluşan son derece sıkı hücresel ^{bariyerlerdir1,2}. Birlikte, BEC'ler birçok toksin, ilaç ve patojeni hariç tutarken, beynin içindeki ve dışındaki besinleri ve atık ürünleri düzenleyerek uygun beyin homeostazını korur ^1,2. Bakteriyel menenjit, kan yoluyla bulaşan bakteriler BEC'lerle etkileşime girebildiğinde ve BEC'ler tarafından oluşturulan bariyere nüfuz edebildiğinde ve iltihaplanmaya neden olduğunda ortaya çıkar. Neisseria meningitidis (Nm, meningokok), sağlıklı bireylerin %10\u201240'ında nazofarenksi kolonize eden Gram negatif bir bakteridir, ancak bazı durumlarda ciddi sistemik hastalığa neden olabilir³. Etkilenen bireylerde Nm, purpura fulminans'a neden olabileceği kan dolaşımına erişebilir ve ayrıca menenjite neden olan CNS'ye erişim sağlayan BEC'lere nüfuz edebilir³. Nm, dünya çapında bakteriyel menenjitin önde gelen bir nedenidir ve aşılama çabalarına rağmen hala menenjitin birincil nedenidir⁴. Antibiyotik tedavisi gibi modern tıbbi müdahaleler bu koşulları hayatta kalmayı mümkün kılmıştır, ancak menenjitten etkilenenler genellikle kalıcı nörolojik hasarla kalmaktadır ^5,6.

Önceki çalışmalar, Nm-BEC etkileşimlerine^katkıda bulunan bakteriyel faktörleri ve konakçı sinyallerini tanımlamıştır 7,8,9,10,11. Opaklık proteini Opc ve tip-IV pili gibi tanımlanan adhezinler ve invazinlerin yanı sıra CD147 gibi reseptörler, in vitro olarak çeşitli BEC modellerinde gerçekleştirilmiştir, ancak bu modeller birçok tanımlayıcı BBB özelliğinden yoksundur 7,9,11,12. Nm-BEC etkileşimlerinin tam olarak anlaşılması, kısmen in vivo modellerin kullanılamaması, eksik aşı koruması ve in vitro sağlam insan BEC modellerinin olmaması nedeniyle zor olmaya devam etmektedir.

HCEC'lerin in vitro modellenmesi, BEC'lerin benzersiz özellikleri nedeniyle zor olmuştur. Periferik endotel hücreleri ile karşılaştırıldığında, BEC'ler, karmaşık sıkı bağlantılar nedeniyle yüksek trans-endotelyal elektrik direnci (TEER) gibi bariyer özelliklerini artıran bir dizi fenotipe sahiptir¹². Beyin mikroçevresinden çıkarıldıktan sonra, BEC'ler, yalnızca zayıf bir bariyer oluşturan birincil veya ölümsüzleştirilmiş in vitro modellerin kullanışlılığını sınırlayan bariyer özelliklerini hızla kaybeder^12,13. Nm enfeksiyonlarının insan özgüllüğü, sağlam in vivo modellerin eksikliği ve insan BEC'lerinin in vitro modellenmesindeki zorlukların birleşimi, Nm ve BEC'ler arasındaki karmaşık konakçı-patojen etkileşimini anlamak için daha iyi modellere ihtiyaç yaratır. Son zamanlarda, model insan kaynaklı pluripotent kök hücre (iPSC) teknolojileri kullanılarak, BEC benzeri hücreler, in vivo BEC'leri daha iyi taklit eden iPSC'lerden türetilmiştir ^12,13,14,15. iPSC-BEC'ler insan kökenlidir, kolayca ölçeklenebilir ve birincil veya ölümsüzleştirilmiş muadillerine kıyasla beklenen BEC fenotiplerine sahiptir^12,13,14,15. Ek olarak, biz ve diğerleri, iPSC-BEC'lerin konak-patojen etkileşimi, Huntington hastalığı ve Allan-Hurndon-Dudley sendromuna neden olan MCT8 eksikliği gibi CNS'nin çeşitli hastalıklarını modellemek için yararlı olduğunu gösterdik 16,17,18,19,20,21. Burada, yenilenebilir iPSC kaynaklarından iPSC-BEC'lerin nasıl türetileceğini ve doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin aktivasyonuna yol açan iPSC-BEC'lerin Nm ile enfeksiyonunun nasıl türetileceğini gösteriyoruz. Bu modelin, diğer in vitro modellerde özetlenemeyen konakçı-patojen etkileşimini sorgulamak için yararlı olduğuna ve özellikle Nm gibi insana özgü patojenlerle etkileşimleri incelerken yararlı olduğuna inanıyoruz.

Protokol

NOT: Tüm besiyeri / reaktif hazırlama, kök hücre bakımı ve farklılaşma adımları Stebbins ve ^ark.22'den uyarlanmıştır.

1. iPSC kültürü ve BEC farklılaşması için gerekli malzemelerin hazırlanması.

1. IMR90-4 iPSC kültürü için doku kültürü (TC) plastiğinin matris kaplaması
   1. Aliquot bazal membran matris jeli (örn., Matrigel) 2.5 mg alikotlar halinde ve -20 ° C'de saklayın.
      NOT: 4 °C'nin üzerinde bir jel oluşturduğundan ve katılaştıktan sonra alıntılanamayacağından, matris jeli ve alikotu buz üzerinde tutarken hızlı çalışın.
   2. TC plastiği kaplamak için, 50 mL'lik konik bir tüpte 30 mL Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM)/F12 ortamına hızlı bir şekilde bir matris jeli alikuotu ekleyin. Donmuş matris jeli üzerine 1 mL ortam ekleyin, çözülene kadar yukarı ve aşağı pipetleyin ve kalan ortamla birlikte hemen 50 mL konik tüpe aktarın.
   3. 6 oyuklu bir plakanın oyuğu başına bu matris jel kaplama çözeltisinden 1 mL ve T75 şişesi başına 12 mL kullanın.
      NOT: Matris jel kaplı TC plastik, kullanılmadan iki hafta öncesine kadar hazırlanabilir. Bununla birlikte, matris jel çözeltisinin kurumasını önlemek çok önemlidir, bu da kuyucukların üzerine ara sıra daha fazla DMEM / F12 eklenmesini gerektirebilir.
2. Bir biyogüvenlik kabininin steril ortamında 450 mL kök hücre bakım bazal ortamına 50 mL 50x takviyesi ekleyerek kök hücre idame besiyerini hazırlayın.
   NOT: Diğer kök hücre idame ortamları (mTeSR ve E8) diğer çalışmalarda kullanılmıştır 13,14,15, ^22,23,24,25.
3. 500 mL koşulsuz ortam (UM) hazırlamak için, 392.5 mL DMEM / F12'yi 100 mL nakavt serum replasmanı (KOSR), 5 mL esansiyel olmayan amino asitler, 1 mM nihai konsantrasyonda L-glutamin ve 3.5 μL β-merkaptoetanol ile birleştirin. Filtreyle sterilize edin ve 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.
4. 200 mL endotel hücresi (EC) ortamı artı retinoik asit (RA) artı bFGF hazırlamak için, 198 mL insan endotel serumu serbest ortamı (hESFM), 2 mL filtreyle sterilize edilmiş trombositten fakir türetilmiş serum (PDS) ve 20 ng / mL bFGF'yi birleştirin. Filtre, sterilize edin ve 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın. Hücrelere eklemeden hemen önce, EC ortamına 10 μM RA ekleyin.
   NOT: PDS kullanımdan kaldırıldığından ve bu nedenle sınırlı olabileceğinden, bu protokol PDS^15,23,26 yerine ^B27 kullanılarak başarıyla gerçekleştirilmiştir.
5. RA veya bFGF içermeyen 200 mL EC ortamı hazırlamak için 198 mL hESFM ve 2 mL filtre ile sterilize edilmiş PDS'yi birleştirin ve filtre sterilize edin. 4 °C'de 4 haftaya kadar saklayın.

2. Bakım IMR90-4 hücre kültürü

NOT: Burada örnek olarak IMR90-4 hücre hattını kullanıyoruz, ancak CC3, CD10, CD12, DF19-9-11T, 83iCTR, 00iCTR ve CS03iCTRn2 gibi diğer indüklenmiş pluripotent kök hücre hatları, BEC'ler 13,14,15,16,17,23,27,28'e farklılaşmak için başarıyla kullanılmıştır.

1. Kültür iPSC'leri 37 ° C'de% 5 CO 2 içinde ve tipik olarak oyuk başına₂ mL kök hücre bakım ortamı ile çeşitli yoğunluklarda 6 oyuklu plakalarda muhafaza edilir.
2. iPSC kültürünün bakımı için, geçiş için birleşim yeri olmayan ve koloniler arasında açık alanları olan tek bir kuyu seçin.
   1. Kültür ortamını aspire edin, 1 mL enzimatik olmayan hücre ayrışma reaktifi ekleyin ve 37 ° C'de 7 dakika inkübe edin. İnkübasyon devam ederken, matris jel solüsyonunu, 6 oyuklu yeni bir plaka üzerinde, oyuk başına 2 mL taze kök hücre bakım ortamı ile değiştirin.
   2. Enzimatik olmayan hücre ayrışma reaktifini, hala plakaya bağlı hücreleri aspire etmemeye dikkat ederek dikkatlice aspire edin.
   3. 6 mL kök hücre bakım ortamı ekleyin ve tüm hücreler tamamen ayrılana kadar kuyu tabanını birkaç kez durulayın. Ardından, yeni 6 oyuklu plakayı normal bakım için tipik olarak 1:6 veya 1:12 olmak üzere değişen yoğunluklarda tohumlayın.
      NOT: Yukarıda belirtilen oranlar kullanılarak, hücreler haftada yaklaşık iki kez bölünür.
   4. Plakayı inkübatöre taşıyın ve plakayı ileri geri ve soldan sağa sallayarak, ortam yerleşene kadar alternatif sallama hareketleri arasında duraklayarak tohumlanmış hücreleri kuyucuklara eşit olarak dağıtın.

3. Beyin endotel hücrelerinin insan iPSC'lerinden farklılaşması

1. Farklılaşma için iPSC'lerin kaplanması (farklılaşma protokolünün -3. günü )
   1. IMR90-4 bakım kültürüne göre, farklılaşma için plakalamak, kültür ortamını aspire etmek, oyuk başına 1 mL enzimatik hücre ayrışma reaktifi eklemek ve 37 ° C'de 7 dakika inkübe etmek için iyi kullanılır.
   2. 1 mL ayrışmış hücre süspansiyonunu, 1 mL hücre başına en az 2 mL taze kök hücre bakım ortamı içeren 15 mL'lik konik bir tüpe aktararak enzimatik hücre ayrışma reaktifini inaktive edin. Hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 1.500 x g'da döndürün.
   3. Hücre peletini, kullanılan IMR90-4 hücrelerinin kuyusu başına 1 mL kök hücre bakım ortamında yeniden süspanse edin ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
      NOT: Sayarken canlı ve ölü hücreleri ayırt etmek için 1:1'i %0.4 tripan mavisi ile seyreltmek faydalı olabilir. iPSC'lerin yoğunluğuna bağlı olarak, 6 oyuklu bir plakanın bir oyuğu genellikle 1\u20122 x 10⁶ hücre verir.
   4. Bir T75 şişesinde farklılaşma için, 10 μM'lik bir son konsantrasyonda 12 mL kök hücre bakım ortamına ve ROCK inhibitörüne (Y27632 dihidroklorür) 7.5 x^{10 5} hücre ekleyin. Bir T75 şişesinden matris jel kaplama çözeltisini aspire edin ve hücre süspansiyonunu şişeye aktarın. Şişeyi ileri geri ve soldan sağa sallayarak hücreleri eşit olarak dağıtın (bkz. adım 2.2.4) ve 37 °C ve% 5 CO_2'de inkübe edin.
      NOT: Ayrışmış tek kök hücrelerin sağkalımını artırmak için bu adımda ROCK inhibitörü eklemek^{çok önemlidir 25,29}. Hücreler, şişe boyunca ve ROCK inhibitörü tedavisine bağlı olarak yayılımlı, mezenkimal benzeri bir morfoloji sergileyen tekiller halinde eşit olarak dağıtılmalıdır²².
2. -2. gün ve -1. günlerde, ortamı taze kök hücre bakım ortamına değiştirin; T75 başına 12 mL.
3. 0. günde, medyayı UM olarak değiştirerek farklılaştırmaya başlayın; T75 başına 12 mL.
4. UM'yi günlük olarak değiştirin (1. gün – 5. gün).
   NOT: Hücreler tipik olarak UM'de 2 ila 3 gün sonra birleşir, bu da çıplak gözle veya ters çevrilmiş parlak alan mikroskobu ile gözlemlenebilir. Farklılaşma ilerledikçe, nestin+ "nöral yollar", daha önce tarif edildiği gibi PECAM-1⁺ hücreleri ile görünür hale gelir ^13,14.
5. 20 ng/mL bFGF ve 10 μM retinoik asit (RA) (6. gün) ile EC ortamına geçerek ve iki gün inkübe ederek endotel hücre popülasyonunu seçici olarak genişletin. bFGF'li EC besiyeri iki hafta öncesine kadar hazırlanabilir. RA, kullanım gününde donmuş stoktan eklenir (örneğin, 1 mL EC + bFGF başına 1 μL 10 mM RA stoğu).
   NOT: Başarılı farklılaşma, 6. ve 8. günlerde RA takviyesi olmadan da elde edilebilir. Bununla birlikte, RA'nın ihmal edilmesi, TEER^12,13,14'ü azaltılmış BEC'ler verecektir.
6. BEC'lerin saflaştırılması ve deneylerin ardından hücre kültürü plakalarını ve membran eklerini (örneğin, Transwell) kollajen IV ve fibronektin (7. gün) ile kaplayın.
   1. Membran eklerinin kaplanması için 4 kısım kollajen IV (0.5 mg/mL asetik asit içinde 1 mg/mL), 1 kısım fibronektin (1 mg/mL) ve 5 kısım steril doku dereceli suyu birleştirin. ECM çözeltisi, hücre kültürü plakalarını kaplamak için 1:5 oranında seyreltilebilir (yani, 4 kısım kollajen IV, 1 kısım fibronektin, 45 kısım su). Gece boyunca 37 °C'de kaplama solüsyonu ile inkübe edin.
      NOT: Plakalar ve membran ekleri, saflaştırma adımının aynı gününde alt kültürlemeden önce en az 4 saat boyunca kaplanabilir.
7. Farklılaşmış hücreleri kollajen IV ve fibronektin kaplı plakalar veya membran ekleri üzerinde alt kültüre alarak BEC'leri saflaştırın (8. gün).
   1. EC ortamını aspire edin ve enzimatik hücre ayrışma reaktifi ekleyin (T75 başına 12 mL). Hücrelerin %90'ı şişeden ayrılana kadar 37 °C'de inkübe edin.
      NOT: Hücre ayrışması 1 saate kadar sürebilir.
   2. İnkübasyon süresi boyunca, kollajen IV / fibronektin kaplama solüsyonunu önceden hazırlanmış plakalardan / eklerden çıkarın ve steril bir başlıkta kurumaya bırakın. Eklerin kuruması yaklaşık 20 dakika sürer.
   3. Hücreler ayrıldıktan sonra, 10 mL'lik bir pipet kullanarak şişeden yıkayın. Tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için yukarı ve aşağı pipetleyin.
      NOT: Tek hücreli süspansiyon, güvenilir hücre sayımı ve katı tek katmanlar elde etmek için önemlidir.
   4. 50 mL'lik konik bir tüpte en az eşit hacimde taze hESFM ile seyreltin ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
   5. Hücreleri 10 dakika boyunca 1.500 x g'da pelet haline getirin.
   6. Membran eklerine tohumlama için 2 x 10⁶ hücre/mL'lik bir süspansiyon elde etmek için hücreleri uygun hacimde taze hazırlanmış EC + bFGF + RA'da yeniden süspanse edin. 12 oyuklu bir ek parçanın üstüne 500 μL (1 x 10⁶ hücre) ve altına 1,5 mL EC + bFGF + RA ortamı ekleyin. 24 ve 48 oyuklu plakalara tohumlama için, hücre süspansiyonunu 1:2 oranında seyreltin ve oyuk başına sırasıyla 500 μL (5 x 10 5 hücre) ve 250 μL (2.5 x 10⁵ hücre) ekleyin. Hücreleri kuyucuk / ek boyunca eşit olarak dağıtın (bkz. adım 2.2.4) ve 37 ° C'de% 5 CO₂ altında inkübe edin.
8. Plakalardaki/transwell'lerdeki ortamı bFGF veya RA olmadan EC'ye değiştirin (9. gün).
9. Aşağıdaki bölümlerde (10. gün) açıklandığı gibi enfeksiyon deneyleri, TEER ölçümü ve immünofloresan boyama yapın.
   NOT: Başarılı bir şekilde farklılaştırılmış ve saflaştırılmış BEC'ler tipik olarak 10. günde en yüksek TEER'e ulaşır ve PECAM-1 (CD31) ve VE-kaderin, glikoz taşıyıcı GLUT-1, p-glikoprotein gibi akış taşıyıcıları ve sıkı bağlantı bileşenleri ZO-1, Occludin ve Claudin-5 ^gibi beyin endotel hücrelerinin karakteristik belirteçlerini eksprese eder 13,14,16,17,19,22 . Lippmann ve ark., Stebbins ve ark. ve diğerleri farklılaşma işlemi sırasında hücre tipleri, morfolojileri ve hücre tipine özgü belirteçlerin ekspresyonu hakkında daha fazla ayrıntı ve görüntü için 13,14,15,16,17,19,22. BEC farklılaşma sürecinin farklı aşamalarındaki IMR90-4 hücrelerinin temsili görüntüleri Ek Şekil 1'de bulunabilir.

4. Bariyer sızdırmazlığının bir ölçüsü olarak transendotelyal elektrik direnci (TEER)

NOT: TEER, bariyer oluşturan iPSC-BEC'lerin başarılı bir şekilde oluşturulduğunu doğrulamak için genellikle farklılaşmanın 9. ve 10. günlerinde membran eklerinde okunur (Şekil 1A).

1. Epitelyal volt-ohm ölçeri (EVOM) bir biyogüvenlik başlığının steril ortamına yerleştirin ve elektrodu EVOM'a bağlayın.
2. Elektrodu en az 5 dakika boyunca %70 EtOH'ye batırarak dezenfekte edin ve tamamen kurumasını bekleyin.
   NOT: Gerekirse% 70 EtOH'de daha uzun inkübasyon veya% 5 hipoklorit çözeltisi kullanılarak elektrotun dekontaminasyonu mümkündür.
3. Membran eklerindeki iPSC-BEC'leri inkübatörden alın ve TEER'i ölçün.
   NOT: Sıcaklık değişimi TEER ölçümünü etkileyebileceğinden, inkübatörden çıkarıldıktan sonra TEER'i hızlı bir şekilde okumak önemlidir.
4. Elektrodu ortama daldırarak TEER'i okuyun, böylece daha kısa elektrot ek parçanın üstüne yerleştirilir ve daha uzun elektrot ek parçayı çevreleyen ortama ulaşır.
   NOT: "Yemek çubuklarının" uçlarındaki elektrotların tamamen sıvıyla kaplı olduğundan emin olun. Gerekirse, plakayı ölçüm için tekrar yere koymadan önce bunu başarmak için kuyuyu eğin.

5. BEC fenotipini doğrulamak için immünofloresan (IF) boyama

NOT: Tamamen farklılaşmış ve saflaştırılmış hücrelerin kalitesini doğrulamak için, iPSC-BEC tek katmanları, daha önce tarif edildiği gibi farklılaşma sürecinin 10. gününde beyin endotel hücrelerinin karakteristik belirteçleri için boyanır (Şekil 1B\u2012G) 13,14,15,16,17,19,22.

1. Ortamı aspire edin ve 1x'i PBS ile yıkayın.
2. Hücreleri buz gibi soğuk metanol ile oda sıcaklığında (RT) 15 dakika sabitleyin.
3. 3x'i fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve 1 saat boyunca RT'de PBS'de% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile bloke edin.
4. Bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş primer antikorları aspire edin ve ekleyin. Gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
   NOT: Antikorların kaynağı ve seyreltilmesi ile ilgili bilgi için Malzeme Tablosu ve Stebbins ve ark.²².
5. Bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş ikincil antikor eklemeden önce 3x'i PBS ile yıkayın. RT'de 1 saat inkübe edin. Numuneleri bu noktadan itibaren ışıktan koruyun.
6. PBS ile 2 kez yıkayın. Ardından, PBS'de 1: 5.000 seyreltmede DAPI ekleyin ve RT'de 15 dakika boyayın.
7. PBS'yi açık bırakarak 1 kez yıkayın ve bir floresan mikroskobu kullanarak görüntü alın.

6. Bakterilerin hazırlanması ve iPSC-BEC'lerin enfeksiyonu

1. Enfeksiyon deneyinden önceki gün (farklılaşmanın 9. günü ), donmuş stoktan bir gece bakteri kültürü başlatın. Nm enfeksiyonu için,% 5 koyun kanı (kan-agar) ile Columbia agar'a bakteri sürün. Bakteri kültürlerini gece boyunca 37 °C ve% 5 CO_2'de inkübe edin.
2. Ertesi gün (10. gün), Proteaz pepton ortamını (PPM) 10 mL'de 50 μL 2 M MgCl 2, 50 μL₂ M NaHCO₃ ve 100 μL Kellogg takviyesi ile destekleyerek taze PPM+ hazırlayın. Steril bir pamuklu çubuk kullanarak gece kültür plakasından Nm ile 50 mL'lik konik bir tüpte 10 mL PPM+ ortamı aşılayın. 200 rpm'de 37 °C'de 1,5 saat çalkalayın (yani, bakteriler logaritmik büyüme aşamasına gelene kadar).
3. Bakteriyel inkübasyon sırasında, iPSC-BEC'leri 24 oyuklu bir plakada veya membran eklerinde eski besiyerini 400 μL taze EC besiyeri (bFGF veya RA olmadan) ile değiştirerek membran eklerinin kuyucuğu / üstü başına hazırlayın.
4. Bakteri kültürünü 4000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin ve ortamı aspire edin. Bakteri peletini 250 μL PBS'de yeniden süspanse edin.
5. 4 mL taze PBS'de, bakteri hücresi süspansiyonunun bir kısmını kullanın ve 0.4'lük bir OD 600'e ayarlayın (yaklaşık 1 x₁₀ ⁸ CFU / mL).
6. Daha sonra, bakterileri hücre kültürü ortamında (EC ortamı) istenen enfeksiyon çokluğuna (MOI) göre seyreltin.
   NOT: Örneğin, 10'luk bir MOI için, iPSC-BEC'leri 24 oyuklu bir plakada veya membran eklerinde enfekte ederken sırasıyla 1:10 veya 1:5 seyreltin (24 oyuklu bir plakada tek tabaka başına 1 x 10⁵ hücre). TEER (veriler gösterilmemiştir) ^30,31 ile ölçüldüğü gibi iPSC-BEC bariyer fenotipi üzerinde zararlı bir etkiye sahip olduğu gözlemlendiğinden^, diğer el yazmalarında açıklandığı gibi enfeksiyon için Nm hazırlanmasına insan serumu ilavesi dahil edilmemiştir. Bununla birlikte, Nm ve iPSC-BEC'lerin etkileşimi, insan serumu ile veya insan serumu olmadan etkilenmez (veriler gösterilmemiştir).
7. Her bir kuyucuktaki iPSC-BEC'leri 100 μL hazırlanan bakteri süspansiyonu ile enfekte edin ve istenen enfeksiyon süresi boyunca inkübe edin.
   NOT: Bir dizi proinflamatuar sitokin ve kemokinin ekspresyonu, Nm ile enfekte olduğunda, daha önce Martins-Gomes ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi 8 saatlik enfeksiyondan sonra en belirgin şekilde iPSC-BEC'lerde yükselir (Şekil 2)¹⁹.

7. Kantitatif PCR ile doğuştan gelen bağışıklık aktivasyonu

NOT: Tercih edilen bir RNA izolasyonu, cDNA sentezi ve qPCR protokolü kullanarak numuneler toplayın ve seçilen sitokinler üzerinde qPCR çalıştırın.

1. 7.1. Farklılaşma protokolünün 10. gününde enfeksiyondan sonra BEC örneklerinden RNA'yı, piyasada bulunan bir RNA izolasyon kiti oluşturan reaktifleri kullanarak toplayın (bkz. Malzeme Tablosu).
   NOT: Temizlenmiş ve sterilize edilmiş bir ortamda dikkatli bir şekilde çalışarak numunelerin nükleaz kontaminasyonunu önleyin.
   1. Lizis tamponu hazırlayın ve iPSC-BEC'lerin her bir kuyucuğuna/tek katmanına 350 μL ekleyin.
   2. Numuneleri birçok kez yukarı ve aşağı pipetleyerek (örn. 20x) ve süspansiyonu steril bir mikrosantrifüj tüpüne aktararak toplayın.
      NOT: Numuneler, RNA izolasyonu için hazır olana kadar -80 °C'de saklanabilir.
   3. Kültürlenmiş hücrelerden ve dokudan RNA saflaştırması için RNA izolasyon kiti ile sağlanan protokolü izleyin.
   4. Nükleaz içermeyen suda elüsyondan sonra, olası RNaz aktivitesini en aza indirmek için RNA örneklerini buz üzerinde tutun.
   5. Bir spektrofotometrede (örneğin, Nanodrop) RNA konsantrasyonlarını tahmin edin.
2. Bir cDNA sentez kiti kullanarak toplanan RNA'dan bir cDNA kütüphanesi oluşturun (bkz.
   1. cDNA sentez kitinin protokolünde açıklandığı gibi tanımlanmış bir toplam reaksiyon hacminde cDNA sentezi ana karışımı, en az 200 ng (ideal olarak 500 ng) numune RNA ve nükleaz içermeyen sudan oluşan reaksiyonlar oluşturun.
   2. Standart bir termo döngüleyicide, kullanılan cDNA sentez kitinin reaktifleri için uygun bir program çalıştırın. Örneğin: 25 °C 2 dakika, 55 °C 10 dakika, 95 °C 1 dakika.
   3. Sentezden sonra, cDNA'yı nükleaz içermeyen suda 1:10'a kadar seyreltin ve numuneleri kısa süreli depolama için 4 °C'ye veya uzun süreli depolama için -20 °C'ye taşıyın.
      NOT: RNA konsantrasyonu düşükse daha düşük seyreltme gerekli olabilir (ör., 50 ng'nin altında). Seyreltilmiş cDNA, -20 °C'de bir yıla kadar saklanabilir.
3. Dikkatle tasarlanmış ve doğrulanmış primerlerle sitokinler ve kemokinler gibi doğuştan gelen bağışıklık yanıtı genlerinin transkriptlerini hedefleyen cDNA örnekleri üzerinde qPCR gerçekleştirin.
   NOT: Primer tasarımı qPCR sonuçlarının kalitesi için çok önemli olduğundan, primer etkinliği bir seyreltme serisi ile test edilmeli ve bir DNA jeli üzerinde birden fazla ürünün bulunmadığı doğrulanmalıdır.
   1. 25 μL reaksiyon başına, 0,5 μL ileri ve 0,5 μL ters astar (nükleaz içermeyen suda 10 mM), 1 μL cDNA, 10,5 μL nükleaz içermeyen_H2Ove 12,5 μL qPCR ana karışımı kullanın.
   2. Aşağıdaki döngüleyici protokolünü kullanarak reaksiyonu bir qPCR makinesinde gerçekleştirin: (a) 4 dakika boyunca 2 °C; (b) 15 dakika boyunca 95 °C; (c) 15 saniye boyunca 95 °C; (d) 1 dakika boyunca 60 °C; (c) ve (d) arasında 45 kez geçiş yapın; (e) isteğe bağlı erime eğrisi: 1 °C'lik artışlarla 30\u201299 °C; 25 °C'de 5 dk.
   3. Veri analizi için, sitokin ve kemokin ekspresyon seviyelerini 18S veya GAPDH gibi bir referans temizlik geni ile karşılaştırmak için ΔΔCT hesaplamasını kullanın.

Sonuçlar

Burada açıklanan protokol Stebbins ve ark. ve iPSC'leri BBB özelliklerine sahip beyin benzeri endotel hücrelerine ayırma sürecini ve bu modelin Nm^19,22 ile iPSC-BEC'leri kullanan enfeksiyon çalışmaları için nasıl kullanılacağını vurgulamaktadır. iPSC-BEC'ler, uygun şekilde farklılaştırıldığında, TEER tarafından ölçülen ve genellikle 2000 Ω·^cm2'den büyük olan sıkı bariyer özellikleri sergiler ve VE-kaderin ve CD31 (PE...

Tartışmalar

BEC'lerin ve BBB'nin modellenmesi, birincil ve ölümsüzleştirilmiş insan BEC'leri, in vitro olarak, sağlam bariyer fenotiplerinden yoksun olma eğiliminde olduğundan, zorluklar yaşamıştır. İnsan kök hücre teknolojilerinin ortaya çıkışı, endotelyal belirteçler, sıkı bağlantı ekspresyonu, bariyer özellikleri, diğer CNS hücre tiplerine yanıt ve fonksiyonel akış taşıyıcıları gibi beklenen ayırt edici BBB fenotiplerini koruyan iPSC'den türetilmiş BEC benzeri hücrelerin üretilmes...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase (1x)	Sigma	A6964	Enzymatic cell dissociation reagent
Acetic acid	Sigma	A6283
All-trans retinoic acid (RA)	Sigma	R2625
Anti-CD31 (PECAM-1)	Thermo Scientific (Labvision)	RB-10333
Anti-Claudin-5	Invitrogen	4C3C2
Anti-Glut-1	Thermo Scientific (Labvision)	SPM498 (MA5-11315)
Anti-Occludin	Invitrogen	33-1500
Anti-VE-cadherin	Santa Cruz	sc-52751
Anti-ZO-1	Invitrogen	33-9100
Bacto Proteose Peptone	BD	211684
b-Mercaptoethanol	Merck (Sigma-Aldrich)	805740
Cell culture plates and flasks	Sarstedt
Centrifuge (Heraeus Megafuge 1.0R)	Thermo Scientific
Class II biosafety cabinet	Nuaire	NU-437-400E
CO2 Incubator (DHD Autoflow CO2 Air-Jacketed Incubator)	Nuaire
Collagen IV	Sigma	C5533
Columbia ager + 5 % sheep blood	Biomerieux	43049
Costar Transwell polyester filters (12- or 24-well)	Corning	3460, 3470
D(+)-Glucose	Merck (Sigma-Aldrich)	G8270
DAPI	Invitrogen	D1306
DMEM/F12	Gibco	31330-038
DMSO	ROTH	A994.1
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Gibco	21600-069
Epithelial Volt-Ohm Meter (Millicell ERS-2) with STX electrode	Merck (Millipore)	MERS00002
Fe(NO3)3	ROTH	5632.1
Fibronectin	Sigma	F1141
Fluoresence microscope (Eclipse Ti)	Nikon
Hemacytometer (Neubauer)	A. Hartenstein	ZK06
Human basic fibroblast growth factor (bFGF)	PeproTech	100-18B
Human Endothelial Serum Free Medium (hESFM)	Gibco	11111-044
Inverted microscope (Wilovert)	Hund (Will Wetzlar)
iPS(IMR90)-4 cells	WiCell
Kellogg's supplement			To prepare 110 ml of Kellogg's supplement, prepare 100 ml of 4 g/ml glucose, 0.1 g/ml glutamine, and 0.2 mg/ml thiamine pyrophosphate and 10 ml of 5 mg/ml Fe(NO3)3 and combine the solutions. Filter sterilize and store aliquoted at -20 °C.
Knockout serum replacement (KOSR)	Gibco	10828-028
L-glutamine (GlutaMAX)	Invitrogen	35050-038
LunaScript RT SuperMix Kit	NEB	E3010L	cDNA synthesis kit
Matrigel Matrix	Corning	354230
Methanol	ROTH	4627.5
MgCl2	ROTH	KK36.1
Micropipettes (Research Plus)	Eppendorf
NaHCO3	ROTH	6329
Nonessential amino acids (NEAA)	Gibco	11140-035
NucleoSpin RNA isolation kit	Machery-Nagel	740955	RNA isolation kit
Pipette boy (Accu-Jet Pro)	Brand
Platelet poor plasma-derived serum, bovine (PDS)	Fisher	50-443-029
PowerUp SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	A25742	qPCR master mix
qPCR film (MicroAmp Optical Adhesive Film)	Applied Biosystems	4211971
qPCR plates (MicroAmp Fast 96-well)	Applied Biosystems	4346907
ROCK inhibitor, Y27632 dihydrochloride	Tocris	1254
RT-PCR thermo cycler (StepOnePlus)	Applied Biosystems	4376600
Serological pipettes	Sarstedt
StemFlex basal medium + 50x StemFlex supplement	Gibco	A3349401	Stem-cell maintenance medium
Swinging Bucket Rotor (Heraeus #2704)	Thermo Scientific
Thiamine pyrophosphate	Sigma	C8754-5G
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061
Versene	Gibco	15040-033	Non-enzymatic cell dissociation reagent (EDTA)