脑膜炎奈瑟菌 诱导多能干细胞来源的脑内皮细胞的感染

摘要

这里描述的方案强调了分化诱导多能干细胞衍生的脑样内皮细胞、用于感染的 脑膜炎奈瑟菌 的制备以及用于其他分子分析的样本收集的主要步骤。

摘要

脑膜炎球菌性脑膜炎是一种危及生命的感染，当脑膜炎 奈瑟菌（脑膜炎球菌 ，Nm）可以通过穿透高度特化的脑内皮细胞 （BEC） 进入中枢神经系统 （CNS） 时发生。由于 Nm 是一种人类特异性病原体，由于缺乏强大的 体内 模型系统，因此对 Nm 和 BEC 之间的宿主-病原体相互作用的研究具有挑战性，并需要一种模拟天然 BEC 的基于人类的模型。与外周内皮细胞相比，BEC 具有更紧密的屏障特性，其特征是复杂的紧密连接和升高的跨内皮电阻 （TEER）。然而，许多 体外 模型，如原发性BEC和永生化BECs，在从天然神经微环境中移除后，要么缺乏或迅速失去其屏障特性。人类干细胞技术的最新进展已经开发出从诱导多能干细胞 （iPSC） 中提取类脑内皮细胞的方法，与其他体 外 人类模型相比，该方法具有更好的表型 BEC。使用 iPSC 衍生的 BEC （iPSC-BEC） 对 Nm-BEC 相互作用进行建模具有使用具有 BEC 屏障特性的人类细胞的好处，可用于检查屏障破坏、先天免疫激活和细菌相互作用。在这里，我们演示了除了细菌制备、感染和样本采集分析外，还如何从 iPSC 中衍生 iPSC-BEC。

引言

血脑屏障 （BBB） 和脑膜血脑脊液屏障 （mBCSFB） 是将循环与中枢神经系统 （CNS） 分开的极其紧密的细胞屏障，主要由高度特化的脑内皮细胞 （^{BEC） 组成1,2}。BECs通过调节大脑内外的营养物质和废物来维持适当的大脑稳态，同时排除许多毒素、药物和病原体^1,2。当血源性细菌能够与BECs相互作用并穿透BECs形成的屏障并引起炎症时，就会发生细菌性脑膜炎。脑膜炎奈瑟菌（Nm，脑膜炎球菌）是一种革兰氏阴性细菌，定植于10-40%健康个体的鼻咽部，但在某些情况下可引起严重的全身性疾病³。在受影响的个体中，Nm 可以进入血流，在那里它可以引起暴发性紫癜，并穿透 BEC 进入中枢神经系统，从而引起脑膜炎³。Nm 是全球细菌性脑膜炎的主要原因，尽管接种了疫苗，但仍是脑膜炎^{的主要原因 4}.现代医疗干预，如抗生素治疗，使这些疾病得以生存，但那些患有脑膜炎的人往往会留下永久性的神经损伤^5,6。

先前的研究已经确定了有助于 Nm-BEC 相互作用的细菌因子和宿主信号转导 7,8,9,10,11。已鉴定的粘附蛋白和侵入蛋白，如混浊蛋白Opc和IV型菌毛，以及受体如CD147，已经在体外对各种BEC模型进行了研究，但这些模型缺乏许多定义的BBB特性7,9,11,12。对 Nm-BEC 相互作用的完全理解仍然难以捉摸，部分原因是无法利用体内模型、不完全的疫苗接种保护以及体外缺乏强大的人类 BEC 模型。

由于 BEC 的独特特性，在体外模拟 hBEC 一直具有挑战性。与外周内皮细胞相比，BEC 具有许多增强其屏障特性的表型，例如由于复杂的紧密连接而导致的高跨内皮电阻 （TEER）¹²。一旦从大脑微环境中移除，BECs就会迅速失去其屏障特性，从而限制了仅形成弱屏障的原代或永生化体外模型的有用性^12,13。Nm 感染的人类特异性、缺乏稳健的体内模型以及体外模拟人类 BEC 的挑战相结合，需要更好的模型来理解 Nm 和 BEC 之间复杂的宿主-病原体相互作用。最近，使用模型人诱导多能干细胞 （iPSC） 技术，BEC 样细胞来源于 iPSC，可在体内更好地模拟 BEC ¹²、^13、14、15。iPSC-BECs是人类来源的，易于扩展，并且与原代或永生化对应物相比具有预期的BEC表型^12,13,14,15。此外，我们和其他人已经证明 iPSC-BEC 可用于模拟中枢神经系统的各种疾病，例如宿主-病原体相互作用、亨廷顿舞蹈症和导致 Allan-Hurndon-Dudley 综合征的 MCT8 缺乏症 16,17,18,19,20,21.在这里，我们展示了如何从可再生的 iPSC 来源获得 iPSC-BEC，以及用 Nm 感染 iPSC-BEC 导致先天免疫反应的激活。我们认为，该模型可用于研究宿主-病原体相互作用，这在其他体外模型中无法概括，并且在检查与人类特定病原体（如Nm）的相互作用时特别有用。

研究方案

注:所有培养基/试剂制备、干细胞维护和分化步骤均改编自 Stebbins 等人 ²²。

1.制备iPSC培养和BEC分化所需的材料。

1. 用于 IMR90-4 iPSC 培养的组织培养 （TC） 塑料基质包被
   1. 将基底膜基质凝胶（例如基质胶）等分成2.5mg等分试样，并储存在-20°C。
      注意:在冰上处理基质凝胶和等分试样时，请快速工作，因为它在4°C以上形成凝胶，一旦凝固就不能分装。
   2. 对于涂覆 TC 塑料，在 50 mL 锥形管中快速将一等分的基质凝胶加入 30 mL Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM）/F12 培养基中。将 1 mL 培养基加入冷冻基质凝胶上，上下移液直至解冻，然后立即将剩余培养基转移到 50 mL 锥形管中。
   3. 在 6 孔板的每孔中使用 1 mL 的基质凝胶包被溶液，每个 T75 培养瓶使用 12 mL。
      注意:基质凝胶涂层的 TC 塑料可在使用前两周制备。然而，避免基质凝胶溶液变干至关重要，这可能需要偶尔在孔顶部添加更多的 DMEM/F12。
2. 在生物安全柜的无菌环境中，将 50 mL 50x 补充剂加入 450 mL 干细胞维持基础培养基中，制备干细胞维持培养基。
   注:其他干细胞维持培养基（mTeSR 和 E8）已用于其他研究 13,14,15,22,23,24,25。
3. 要制备 500 mL 未调节培养基 （UM），将 392.5 mL DMEM/F12 与 100 mL 敲除血清替代物 （KOSR）、5 mL 非必需氨基酸、终浓度为 1 mM 的 L-谷氨酰胺和 3.5 μL β-巯基乙醇混合。过滤灭菌并在4°C下储存长达2周。
4. 要制备 200 mL 内皮细胞 （EC） 培养基加视黄酸 （RA） 加 bFGF，请混合 198 mL 人内皮血清游离培养基 （hESFM）、2 mL 过滤灭菌的贫血小板衍生血清 （PDS） 和 20 ng/mL bFGF。过滤灭菌并在4°C下储存长达2周。 在添加到细胞之前，向 EC 培养基中加入 10 μM RA。
   注意:由于PDS已停产，因此可能受到限制，因此该协议已使用B27代替PDS 15,23,26成功进行。
5. 要制备不含 RA 或 bFGF 的 200 mL EC 培养基，请合并 198 mL hESFM 和 2 mL 过滤灭菌的 PDS 并过滤灭菌。在4°C下储存长达4周。

2. 维持IMR90-4细胞培养

注:这里我们以IMR90-4细胞系为例，但其他诱导多能干细胞系如CC3、CD10、CD12、DF19-9-11T、83iCTR、00iCTR和CS03iCTRn2已成功用于分化为BECs13,14,15,16,17,23,27,28。

1. 在37°C的5%CO₂ 中培养iPSC，通常以不同的密度在6孔板上维持，每孔2mL干细胞维持培养基。
2. 为了维持 iPSC 培养物，选择一个不汇合且菌落之间有开放空间的通道。
   1. 吸出培养基，加入1mL非酶促细胞解离试剂，并在37°C下孵育7分钟。在孵育过程中，用每孔 2 mL 新鲜干细胞维持培养基替换新的 6 孔板上的基质凝胶溶液。
   2. 小心地吸出非酶促细胞解离试剂，注意不要吸出仍附着在平板上的细胞。
   3. 加入 6 mL 干细胞维持培养基，冲洗孔底几次，直至所有细胞完全分离。然后，接种具有不同密度的新 6 孔板，通常为 1:6 或 1:12 以进行正常维护。
      注意:使用上述比例，细胞大约每周分裂两次。
   4. 将板移至培养箱中，通过来回和从左到右摇动板，在交替摇动之间暂停直到培养基沉淀，将接种的细胞均匀地分布在孔中。

3. 脑内皮细胞与人iPSC的分化

1. 用于分化的 iPSC 铺板（分化方案的第 -3 天 ）
   1. 每个IMR90-4维持培养孔用于分化，吸出培养基，每孔加入1mL酶促细胞解离试剂，并在37°C下孵育7分钟。
   2. 通过将 1 mL 解离的细胞悬液转移到 15 mL 锥形管中，每 1 mL 细胞至少含有 2 mL 新鲜干细胞维持培养基，使酶促细胞解离试剂失活。将细胞悬液以1,500× g 旋转5分钟。
   3. 将细胞沉淀重悬于每孔使用的 IMR90-4 细胞的 1 mL 干细胞维持培养基中，并使用血细胞计数器对细胞进行计数。
      注意:在计数时，用 0.4% 台盼蓝以 1:1 稀释以区分活细胞和死细胞可能会有所帮助。根据 iPSC 的密度，6 孔板的一个孔通常产生 1-10 个⁶ 个细胞。
   4. 为了在 T75 烧瓶中分化，将 7.5 x 10⁵ 个细胞加入 12 mL 干细胞维持培养基和 ROCK 抑制剂（Y27632 二盐酸盐）中，终浓度为 10 μM。 从 T75 烧瓶中吸出基质凝胶包被溶液并将细胞悬浮液转移到烧瓶中。通过来回和从左到右摇动烧瓶（参见步骤2.2.4）均匀分布细胞，并在37°C和5%CO₂下孵育。
      注意:在此步骤中添加ROCK抑制剂以增强解离的单个干细胞的存活率至关重要^25,29。细胞应均匀分布在烧瓶中，并且由于 ROCK 抑制剂处理而表现出扩散的间充质样形态的单体中²²。
2. 在第 -2 天 和第 -1 天，将培养基更换为新鲜的干细胞维持培养基;每 T75 12 mL。
3. 在第 0 天，通过将培养基更改为 UM 开始分化;每 T75 12 mL。
4. 每天更改 UM（第 1 天 - 第 5 天）。
   注意:细胞通常在 UM 中 2 至 3 天后达到汇合，可以用肉眼或通过倒置明场显微镜观察。随着分化的进展，巢蛋白⁺"神经束"变得可见，中间有PECAM-1⁺细胞，如前所述^13,14。
5. 通过切换到含有 20 ng/mL bFGF 和 10 μM 视黄酸 （RA）（第 6 天）的 EC 培养基并孵育两天，选择性地扩增内皮细胞群。含 bFGF 的 EC 培养基可在两周前制备。RA在使用当天从冷冻原液中添加（例如，每1mL EC + bFGF加入1μL 10 mM RA原液）。
   注意:在第 6 天和第 8 天无需补充 RA 也可以实现成功分化。然而，省略 RA 将产生 TEER^{降低 12}、^13、14 的 BEC。
6. 用胶原 IV 和纤连蛋白（第 7 天）包被细胞培养板和膜插入物（例如 Transwell），用于纯化 BEC 和后续实验。
   1. 对于膜插入物的包被，将 4 份 IV 型胶原蛋白（1 mg/mL 溶于 0.5 mg/mL 乙酸中）、1 份纤连蛋白 （1 mg/mL） 和 5 份无菌组织级水混合。ECM 溶液可以按 1:5 的比例稀释用于包被细胞培养板（即 4 份 IV 份胶原蛋白、1 份纤连蛋白、45 份水）。与包衣溶液在37°C孵育过夜。
      注:在纯化步骤的同一天，在传代培养之前，也可以在传代培养前包被板和膜插入物至少4小时。
7. 通过在胶原 IV 和纤连蛋白包被的平板或膜插入物上传代培养分化的细胞来纯化 BEC（第 8 天）。
   1. 吸出 EC 培养基并加入酶促细胞解离试剂（每 T75 12 mL）。在37°C孵育，直到90%的细胞从烧瓶中分离出来。
      注意:细胞解离可能需要长达1小时。
   2. 在孵育期间，从先前制备的板/插入物中取出胶原蛋白IV /纤连蛋白涂层溶液，并在无菌罩中干燥。插入物干燥大约需要 20 分钟。
   3. 细胞分离后，使用 10 mL 移液管将它们从烧瓶中洗掉。上下移液器以实现单细胞悬浮液。
      注:单细胞悬浮液对于可靠的细胞计数和实现固体单层非常重要。
   4. 在 50 mL 锥形管中用至少等体积的新鲜 hESFM 稀释，并使用血细胞计数器计数细胞。
   5. 将细胞以1,500×g沉淀10分钟。
   6. 将细胞重悬于适当体积的新鲜制备的 EC + bFGF + RA 中，以达到 2 x 10⁶ 个细胞/mL 的悬浮液，用于接种在膜插入物上。在 12 孔插入物顶部加入 500 μL（1 x 10⁶ 个细胞），在底部加入 1.5 mL EC + bFGF + RA 培养基。对于接种在 24 和 48 孔板上，以 1:2 稀释细胞悬液，每孔分别加入 500 μL（5 x 10 5 个细胞）和 250 μL（2.5 x 10⁵ 个细胞）。将细胞均匀分布在孔/插入物上（参见步骤2.2.4），并在37°C下在5%CO₂下孵育。
8. 将平板/转孔上的培养基更换为 不含 bFGF 或 RA 的 EC（第 9 天）。
9. 进行感染实验、TEER 测量和免疫荧光染色，如以下各节所述（第 10 天）。
   注:成功分化和纯化的 BEC 通常在第 10 天达到峰值 TEER，并表达脑内皮细胞的特征标志物，例如 PECAM-1 （CD31） 和 VE-cadherin、葡萄糖转运蛋白 GLUT-1、外排转运蛋白（如 p-糖蛋白）和紧密连接成分 ZO-1、Occludin 和 Claudin-5 ^{13,14,16,17,19,22} .有关分化过程中细胞类型、形态和细胞类型特异性标志物表达的更多详细信息和图像，请参阅 Lippmann 等人、Stebbins 等人¹³、14、15、16、¹⁷、^19、22。IMR90-4细胞在BEC分化过程不同阶段的代表性图像可以在补充图1中找到。

4. 跨内皮电阻 （TEER） 作为屏障密封性的量度

注:通常在分化第 9 天和第 10 天在膜插入物上读取 TEER，以确认成功产生形成屏障的 iPSC-BEC（图 1A）。

1. 将上皮伏欧表 （EVOM） 置于生物安全罩的无菌环境中，并将电极连接到 EVOM。
2. 将电极浸入 70% EtOH 中至少 5 分钟，然后使其完全干燥，从而对电极进行消毒。
   注意:如果需要，可以在 70% EtOH 中孵育更长时间或使用 5% 次氯酸盐溶液对电极进行去污。
3. 从培养箱中取出膜插入物上的iPSC-BEC并测量TEER。
   注意: 从培养箱中取出后快速读取 TEER 很重要，因为温度变化可能会影响 TEER 测量。
4. 通过将电极浸入介质中来读取 TEER，以便将较短的电极放置在插入物的顶部，而较长的电极伸入插入插入物周围的介质中。
   注意: 确保"筷子"尖端的电极完全被液体覆盖。如果需要，在再次放下板进行测量之前，倾斜孔以达到此目的。

5. 免疫荧光 （IF） 染色以验证 BEC 表型

注:为了验证完全分化和纯化细胞的质量，如前所述，在分化过程的第10天对iPSC-BEC单层的脑内皮细胞特征标志物进行染色（图1B - G）13,14,15,16,17,19,22。

1. 吸出培养基并用PBS洗涤1x。
2. 在室温（RT）下用冰冷的甲醇固定细胞15分钟。
3. 用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤3次，并在室温下用10%胎牛血清（FBS）在PBS中封闭1小时。
4. 吸出并加入在封闭液中稀释的一抗。在4°C孵育过夜。
   注:有关抗体的来源和稀释度的信息，请参阅 材料表 和Stebbins等人²²。
5. 用 PBS 洗涤 3 次，然后加入在封闭液中稀释的二抗。在室温下孵育1小时。从现在开始保护样品免受光线照射。
6. 用 PBS 洗涤 2 次。然后，在PBS中以1:5,000稀释度加入DAPI，并在室温下染色15分钟。
7. 洗涤 1 次，保持 PBS 开启状态，并使用荧光显微镜拍摄图像。

6. 细菌的制备和iPSC-BECs的感染

1. 在感染实验的前一天（分化的第9天 ），开始从冷冻原液中培养细菌过夜。对于Nm感染，用5%绵羊血（血琼脂）将细菌条纹到哥伦比亚琼脂上。将细菌培养物在37°C和5%CO₂ 下孵育过夜。
2. 第二天（第 10 天），通过每 10 mL 补充 50 μL 2 M MgCl 2、50 μL₂ M NaHCO₃ 和 100 μL 凯洛氏补充剂来制备新鲜的 PPM+。使用无菌棉签将 10 mL PPM + 培养基接种在 50 mL 锥形管中，其中含有来自过夜培养板的 Nm。在37°C下以200rpm振荡孵育1.5小时（即，直到细菌处于对数生长阶段）。
3. 在细菌孵育期间，通过用每孔/膜插入物顶部用 400 μL 新鲜 EC 培养基（不含 bFGF 或 RA）替换旧培养基，在 24 孔板或膜插入物上制备用于感染的 iPSC-BEC。
4. 将细菌培养物以4000× g 离心10分钟并吸出培养基。将细菌沉淀重悬于 250 μL PBS 中。
5. 在 4 mL 新鲜 PBS 中，使用一部分细菌细胞悬液并调节至 OD₆₀₀ 为 0.4（约 1 x 10⁸ CFU/mL）。
6. 然后，根据所需的感染多重性（MOI）稀释细胞培养基（EC培养基）中的细菌。
   注:例如，对于 MOI 为 10，在 24 孔板或膜插入物中感染 iPSC-BEC 时，分别稀释 1:10 或 1:5（24 孔板中每单层 1 x 10⁵ 个细胞）。正如其他手稿中所描述的那样，添加人血清不包括在感染的 Nm 的制备中，因为它被观察到对 TEER 测量的 iPSC-BEC 屏障表型有有害影响（数据未显示）^30,31。然而，无论是否使用人血清，Nm 和 iPSC-BEC 的相互作用都不会受到影响（数据未显示）。
7. 用 100 μL 制备的细菌悬浮液感染每个孔中的 iPSC-BEC，并孵育所需的感染时间。
   注:当感染 Nm 时，iPSC-BEC 中许多促炎细胞因子和趋化因子的表达升高，最突出的是感染 8 小时后，如 Martins-Gomes 等人先前描述的那样（图 2）¹⁹。

7. 通过定量PCR激活先天免疫

注:使用优选的RNA分离、cDNA合成和qPCR方案，收集样品并对选定的细胞因子进行qPCR。

1. 7.1. 在分化方案的第 10 天 感染后，使用市售 RNA 分离试剂盒中的试剂从 BEC 样品中收集 RNA（参见 材料表）。
   注意: 避免核酸酶污染 样品 在清洁和消毒的环境中小心工作。
   1. 制备裂解缓冲液，并向每个孔/单层 iPSC-BEC 中加入 350 μL。
   2. 通过上下移液多次（例如，20x）并将悬浮液转移到无菌微量离心管中来收集样品。
      注:样品可以储存在-80°C，直到准备进行RNA分离。
   3. 按照 RNA 分离试剂盒提供的方案从培养的细胞和组织中纯化 RNA。
   4. 在无核酸酶的水中洗脱后，将RNA样品保持在冰上，以尽量减少任何潜在的RNase活性。
   5. 在分光光度计（例如，Nanodrop）上估计RNA浓度。
2. 使用cDNA合成试剂盒从收集的RNA生成cDNA文库（参见 材料表）。
   1. 按照cDNA合成试剂盒的方案所述，在规定的总反应体积中建立由cDNA合成预混液、至少200 ng（理想情况下为500 ng）样品RNA和无核酸酶水组成的反应。
   2. 在标准热循环仪上，运行适用于所用cDNA合成试剂盒试剂的程序。例如:25°C下2分钟，55°C下10分钟，95°C下1分钟。
   3. 合成后，在无核酸酶的水中将cDNA稀释至1:10，并将样品移至4°C进行短期或-20°C进行长期储存。
      注:如果RNA浓度低（例如，低于50ng），则可能需要较低的稀释度。稀释的cDNA可以在-20°C下储存长达一年。
3. 使用精心设计和验证的引物，对靶向先天免疫应答基因（如细胞因子和趋化因子）转录本的 cDNA 样品进行 qPCR。
   注:由于引物设计对qPCR结果的质量非常重要，因此应进行稀释系列测试引物效率，并应在DNA凝胶上确认不存在多种产物。
   1. 每 25 μL 反应，使用 0.5 μL 正向和 0.5 μL 反向引物（10 mM 无核酸酶水中）、1 μL cDNA、10.5 μL 无核酸酶 H₂O 和 12.5 μL qPCR 预混液。
   2. 使用以下循环仪方案在qPCR机器上进行反应:（a）4°C2分钟;（b） 95°C下15分钟;（c） 95 °C下15 s;（d） 60°C下1分钟;循环 （c） 和 （d） 45 次;（e） 可选熔体曲线:30-99 °C，增量为 1 °C;25°C5分钟。
   3. 对于数据分析，使用 ΔΔCT 计算将细胞因子和趋化因子表达水平与参考管家基因（如 18S 或 GAPDH）进行比较。

结果

这里描述的方案改编自Stebbins等人，并强调了将iPSC分化为具有BBB特性的脑样内皮细胞的过程，以及如何利用该模型进行使用具有Nm^19,22的iPSC-BEC的感染研究。当分化得当时，iPSC-BEC表现出通过TEER测量的紧密屏障特性，通常大于2000 Ω·^{cm 2}，并表达内皮标志物，如VE-钙粘蛋白和CD31（PECAM）（图1A\u2012C）。此外，它们...

讨论

BECs和BBB的建模遇到了挑战，因为在体外，原发性和永生化的人BEC往往缺乏强大的屏障表型。人类干细胞技术的出现允许产生 iPSC 衍生的 BEC 样细胞，这些细胞保留了预期的标志性 BBB 表型，例如内皮标志物、紧密连接表达、屏障特性、对其他 CNS 细胞类型的反应和功能性外排转运蛋白 12、¹³、14、¹⁵、22、²⁴

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase (1x)	Sigma	A6964	Enzymatic cell dissociation reagent
Acetic acid	Sigma	A6283
All-trans retinoic acid (RA)	Sigma	R2625
Anti-CD31 (PECAM-1)	Thermo Scientific (Labvision)	RB-10333
Anti-Claudin-5	Invitrogen	4C3C2
Anti-Glut-1	Thermo Scientific (Labvision)	SPM498 (MA5-11315)
Anti-Occludin	Invitrogen	33-1500
Anti-VE-cadherin	Santa Cruz	sc-52751
Anti-ZO-1	Invitrogen	33-9100
Bacto Proteose Peptone	BD	211684
b-Mercaptoethanol	Merck (Sigma-Aldrich)	805740
Cell culture plates and flasks	Sarstedt
Centrifuge (Heraeus Megafuge 1.0R)	Thermo Scientific
Class II biosafety cabinet	Nuaire	NU-437-400E
CO2 Incubator (DHD Autoflow CO2 Air-Jacketed Incubator)	Nuaire
Collagen IV	Sigma	C5533
Columbia ager + 5 % sheep blood	Biomerieux	43049
Costar Transwell polyester filters (12- or 24-well)	Corning	3460, 3470
D(+)-Glucose	Merck (Sigma-Aldrich)	G8270
DAPI	Invitrogen	D1306
DMEM/F12	Gibco	31330-038
DMSO	ROTH	A994.1
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Gibco	21600-069
Epithelial Volt-Ohm Meter (Millicell ERS-2) with STX electrode	Merck (Millipore)	MERS00002
Fe(NO3)3	ROTH	5632.1
Fibronectin	Sigma	F1141
Fluoresence microscope (Eclipse Ti)	Nikon
Hemacytometer (Neubauer)	A. Hartenstein	ZK06
Human basic fibroblast growth factor (bFGF)	PeproTech	100-18B
Human Endothelial Serum Free Medium (hESFM)	Gibco	11111-044
Inverted microscope (Wilovert)	Hund (Will Wetzlar)
iPS(IMR90)-4 cells	WiCell
Kellogg's supplement			To prepare 110 ml of Kellogg's supplement, prepare 100 ml of 4 g/ml glucose, 0.1 g/ml glutamine, and 0.2 mg/ml thiamine pyrophosphate and 10 ml of 5 mg/ml Fe(NO3)3 and combine the solutions. Filter sterilize and store aliquoted at -20 °C.
Knockout serum replacement (KOSR)	Gibco	10828-028
L-glutamine (GlutaMAX)	Invitrogen	35050-038
LunaScript RT SuperMix Kit	NEB	E3010L	cDNA synthesis kit
Matrigel Matrix	Corning	354230
Methanol	ROTH	4627.5
MgCl2	ROTH	KK36.1
Micropipettes (Research Plus)	Eppendorf
NaHCO3	ROTH	6329
Nonessential amino acids (NEAA)	Gibco	11140-035
NucleoSpin RNA isolation kit	Machery-Nagel	740955	RNA isolation kit
Pipette boy (Accu-Jet Pro)	Brand
Platelet poor plasma-derived serum, bovine (PDS)	Fisher	50-443-029
PowerUp SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	A25742	qPCR master mix
qPCR film (MicroAmp Optical Adhesive Film)	Applied Biosystems	4211971
qPCR plates (MicroAmp Fast 96-well)	Applied Biosystems	4346907
ROCK inhibitor, Y27632 dihydrochloride	Tocris	1254
RT-PCR thermo cycler (StepOnePlus)	Applied Biosystems	4376600
Serological pipettes	Sarstedt
StemFlex basal medium + 50x StemFlex supplement	Gibco	A3349401	Stem-cell maintenance medium
Swinging Bucket Rotor (Heraeus #2704)	Thermo Scientific
Thiamine pyrophosphate	Sigma	C8754-5G
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061
Versene	Gibco	15040-033	Non-enzymatic cell dissociation reagent (EDTA)