Meningitidis di Neisseria Infezione di cellule endoteliali cerebrali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte

Riepilogo

Il protocollo qui descritto evidenzia i principali passaggi nella differenziazione delle cellule endoteliali cerebrali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte, nella preparazione di Neisseria meningitidis per l'infezione e nella raccolta di campioni per altre analisi molecolari.

Abstract

La meningite meningococcica è un'infezione pericolosa per la vita che si verifica quando Neisseria meningitidis (meningococco , Nm) può accedere al sistema nervoso centrale (SNC) penetrando nelle cellule endoteliali cerebrali (BEC) altamente specializzate. Poiché Nm è un patogeno specifico per l'uomo, la mancanza di solidi sistemi modello in vivo rende difficile lo studio delle interazioni ospite-patogeno tra Nm e BEC e stabilisce la necessità di un modello basato sull'uomo che imiti i BEC nativi. I BEC possiedono proprietà di barriera più strette rispetto alle cellule endoteliali periferiche caratterizzate da complesse giunzioni strette e da un'elevata resistenza elettrica trans-endoteliale (TEER). Tuttavia, molti modelli in vitro , come i BEC primari e i BEC immortalizzati, mancano o perdono rapidamente le loro proprietà di barriera dopo la rimozione dal microambiente neurale nativo. I recenti progressi nelle tecnologie delle cellule staminali umane hanno sviluppato metodi per derivare cellule endoteliali simili al cervello da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) che fenopiano meglio le BEC rispetto ad altri modelli umani in vitro . L'uso di BEC derivati da iPSC (IPSC-BEC) per modellare l'interazione Nm-BEC ha il vantaggio di utilizzare cellule umane che possiedono proprietà di barriera BEC e può essere utilizzato per esaminare la distruzione della barriera, l'attivazione immunitaria innata e l'interazione batterica. Qui dimostriamo come derivare le iPSC-BEC dalle iPSC oltre alla preparazione batterica, all'infezione e alla raccolta del campione per l'analisi.

Introduzione

La barriera emato-encefalica (BBB) e la barriera meningea sangue-liquido cerebrospinale (mBCSFB) sono barriere cellulari estremamente strette che separano la circolazione dal sistema nervoso centrale (SNC) e sono costituite principalmente da cellule endoteliali cerebrali (^{BEC) altamente specializzate1,2}. Insieme, i BEC mantengono una corretta omeostasi cerebrale regolando i nutrienti e i prodotti di scarto dentro e fuori il cervello, escludendo molte tossine, farmaci e agenti patogeni ^1,2. La meningite batterica si verifica quando i batteri trasmissibili per via ematica sono in grado di interagire e penetrare la barriera formata dai BEC e causare infiammazione. Neisseria meningitidis (Nm, meningococco) è un batterio Gram-negativo che colonizza il rinofaringe del 10-40% degli individui sani, ma in alcuni casi può causare gravi malattie sistemiche³. Negli individui affetti, Nm può ottenere l'accesso al flusso sanguigno dove può causare porpora fulminante e penetrare i BEC ottenendo l'accesso al SNC causando la meningite³. La NM è una delle principali cause di meningite batterica in tutto il mondo e, nonostante gli sforzi di vaccinazione, è ancora una delle cause primarie di meningite⁴. L'intervento medico moderno, come il trattamento antibiotico, ha reso queste condizioni sopravvissute, tuttavia le persone colpite da meningite spesso rimangono con danni neurologici permanenti ^5,6.

Studi precedenti hanno identificato i fattori batterici e la segnalazione dell'ospite che contribuiscono alle interazioni Nm-BEC 7,8,9,10,11. Le adesine e le invasine identificate, come la proteina di opacità Opc e i pili di tipo IV, così come i recettori come CD147, sono stati condotti su vari modelli BEC in vitro, tuttavia questi modelli mancano di molte proprietà di definizione della BBB 7,9,11,12. La comprensione completa delle interazioni Nm-BEC rimane elusiva a causa in parte dell'incapacità di utilizzare modelli in vivo, della protezione vaccinale incompleta e della mancanza di robusti modelli BEC umani in vitro.

La modellazione degli hBEC in vitro è stata impegnativa a causa delle proprietà uniche dei BEC. Rispetto alle cellule endoteliali periferiche, le BEC hanno una serie di fenotipi che migliorano le loro proprietà di barriera, come l'elevata resistenza elettrica trans-endoteliale (TEER) dovuta a complesse giunzioni strette¹². Una volta rimossi dal microambiente cerebrale, i BEC perdono rapidamente le loro proprietà di barriera, limitando l'utilità di modelli primari o immortalizzati in vitro che formano solo una debole barriera^12,13. La combinazione della specificità umana delle infezioni da NM, la mancanza di robusti modelli in vivo e le sfide che modellano i BEC umani in vitro crea la necessità di modelli migliori per comprendere la complessa interazione ospite-patogeno tra Nm e BAC. Recentemente, utilizzando tecnologie di cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) modello, le cellule simili a BEC sono state derivate da iPSC che imitano meglio le BEC in vivo^12,13,14,15. Le iPSC-BEC sono di origine umana, facilmente scalabili e possiedono i fenotipi BEC attesi rispetto alle loro controparti primarie o immortalizzate^12,13,14,15. Inoltre, noi e altri abbiamo dimostrato che le iPSC-BEC sono utili per modellare varie malattie del SNC come l'interazione ospite-patogeno, la malattia di Huntington e il deficit di MCT8 che causa la sindrome^di Allan-Hurndon-Dudley 16,17,18,19,20,21 . Qui, dimostriamo come derivare le iPSC-BEC da fonti rinnovabili di iPSC e l'infezione delle iPSC-BEC con Nm che porta all'attivazione della risposta immunitaria innata. Riteniamo che questo modello sia utile per interrogare l'interazione ospite-patogeno che non può essere ricapitolata in altri modelli in vitro ed è particolarmente utile quando si esaminano le interazioni con patogeni specifici per l'uomo come il Nm.

Protocollo

NOTA: Tutte le fasi di preparazione del terreno/reagente, del mantenimento delle cellule staminali e della differenziazione sono adattate da Stebbins et ^al.22.

1. Preparazione dei materiali necessari per la coltura delle iPSC e il differenziamento delle BEC.

1. Rivestimento della matrice della plastica per coltura tissutale (TC) per coltura iPSC IMR90-4
   1. Aliquote di gel di matrice di membrana basale (ad es. Matrigel) in aliquote da 2,5 mg e conservare a -20 °C.
      NOTA: Lavorare rapidamente quando si maneggia il gel della matrice e l'aliquota sul ghiaccio, poiché forma un gel al di sopra dei 4 °C e non può essere aliquotato una volta che si è solidificato.
   2. Per rivestire la plastica TC, aggiungere rapidamente un'aliquota di gel matrice a 30 mL di terreno Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 di Dulbecco in una provetta conica da 50 mL. Aggiungere 1 mL di terreno sul gel a matrice congelata, pipettare su e giù fino a quando non viene scongelato e trasferire immediatamente nella provetta conica da 50 mL con il terreno rimanente.
   3. Utilizzare 1 mL di questa soluzione di gel-coating a matrice per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e 12 mL per matraccio T75.
      NOTA: La plastica TC rivestita di gel Matrix può essere preparata fino a due settimane prima dell'uso. Tuttavia, è fondamentale evitare che la soluzione di gel della matrice si asciughi, il che potrebbe richiedere l'aggiunta occasionale di più DMEM/F12 sopra i pozzetti.
2. Preparare il terreno di mantenimento delle cellule staminali aggiungendo 50 ml di supplemento 50x a 450 mL di terreno basale di mantenimento delle cellule staminali nell'ambiente sterile di una cabina di biosicurezza.
   NOTA: Altri terreni di mantenimento con cellule staminali (mTeSR ed E8) sono stati utilizzati in altri studi 13,14,15, ^22,23,24,25.
3. Per preparare 500 mL di terreno non condizionato (UM), combinare 392,5 mL di DMEM/F12 con 100 mL di sostituzione del siero knock out (KOSR), 5 mL di aminoacidi non essenziali, L-glutammina a una concentrazione finale di 1 mM e 3,5 μL di β-mercaptoetanolo. Filtrare-sterilizzare e conservare a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
4. Per preparare 200 mL di terreno di coltura endoteliale (EC) più acido retinoico (RA) più bFGF, combinare 198 mL di terreno libero da siero endoteliale umano (hESFM), 2 mL di siero derivato da piastrine (PDS) sterilizzato con filtro e 20 ng/mL di bFGF. Filtrare, sterilizzare e conservare per un massimo di 2 settimane a 4 °C. Appena prima dell'aggiunta alle cellule, aggiungere 10 μM di AR al terreno EC.
   NOTA: Poiché PDS è stato interrotto e potrebbe quindi essere limitato, questo protocollo è stato condotto con successo utilizzando B27 al posto di PDS 15,23,26.
5. Per preparare 200 mL di terreno EC senza RA o bFGF, combinare 198 mL di hESFM e 2 mL di PDS sterilizzato con filtro e sterilizzare con filtro. Conservare fino a 4 settimane a 4 °C.

2. Mantenimento della coltura cellulare IMR90-4

NOTA: Qui usiamo la linea cellulare IMR90-4 come esempio, tuttavia altre linee di cellule staminali pluripotenti indotte come CC3, CD10, CD12, DF19-9-11T, 83iCTR, 00iCTR e CS03iCTRn2 sono state impiegate con successo per la differenziazione in BEC 13,14,15,16,17,23,27,28.

1. Coltura di iPSC a 37 °C in CO 2 al 5% e in genere si mantengono su piastre da 6 pozzetti a varie densità con₂ mL di terreno di mantenimento delle cellule staminali per pozzetto.
2. Per il mantenimento della coltura iPSC, selezionare un singolo pozzetto per il passaggio che non sia confluente e che presenti spazi aperti tra le colonie.
   1. Aspirare il terreno di coltura, aggiungere 1 mL di reagente di dissociazione cellulare non enzimatica e incubare a 37 °C per 7 min. Mentre l'incubazione è in corso, sostituire la soluzione di gel della matrice, su una nuova piastra a 6 pozzetti, con 2 ml di terreno di mantenimento fresco di cellule staminali per pozzetto.
   2. Aspirare con cautela il reagente di dissociazione cellulare non enzimatica facendo attenzione a non aspirare le cellule ancora attaccate alla piastra.
   3. Aggiungere 6 ml di terreno di mantenimento delle cellule staminali e sciacquare il fondo del pozzetto alcune volte fino a quando tutte le cellule non sono completamente staccate. Quindi, seminare la nuova piastra a 6 pozzetti con densità variabili, in genere 1:6 o 1:12 per la normale manutenzione.
      NOTA: Utilizzando i rapporti di cui sopra, le celle vengono divise circa due volte a settimana.
   4. Spostare la piastra nell'incubatrice e distribuire equamente le cellule seminate sui pozzetti scuotendo la piastra avanti e indietro e da sinistra a destra, facendo una pausa tra movimenti di agitazione alternati fino a quando il terreno non si è stabilizzato.

3. Differenziamento delle cellule endoteliali cerebrali dalle iPSC umane

1. Placcatura di iPSC per il differenziamento (giorno -3 del protocollo di differenziamento)
   1. Per il pozzetto di coltura di mantenimento IMR90-4 utilizzato per la piastra per la differenziazione, aspirare il terreno di coltura, aggiungere 1 mL di reagente enzimatico di dissociazione cellulare per pozzetto e incubare a 37 °C per 7 minuti.
   2. Inattivare il reagente enzimatico di dissociazione cellulare trasferendo 1 mL di sospensione cellulare dissociata in una provetta conica da 15 mL con almeno 2 mL di terreno fresco di mantenimento delle cellule staminali per 1 mL di cellule. Centrifugare la sospensione cellulare a 1.500 x g per 5 min.
   3. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno di mantenimento delle cellule staminali per pozzetto di cellule IMR90-4 utilizzate e contare le cellule utilizzando un emocitometro.
      NOTA: Può essere utile diluire 1:1 con blu di tripano allo 0,4% per distinguere tra cellule vive e morte durante il conteggio. A seconda della densità delle iPSC, un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti di solito produce 1\u20122 x 10⁶ cellule.
   4. Per la differenziazione in un matraccio T75, aggiungere 7,5 x 10⁵ cellule a 12 mL di terreno di mantenimento delle cellule staminali e inibitore ROCK (dicloridrato Y27632) a una concentrazione finale di 10 μM. Aspirare la soluzione di gel-coating della matrice da un matraccio T75 e trasferire la sospensione cellulare nel pallone. Distribuire equamente le cellule agitando il matraccio avanti e indietro e da sinistra a destra (vedere punto 2.2.4) e incubare a 37 °C e al 5% di CO₂ .
      NOTA: È fondamentale aggiungere l'inibitore ROCK in questa fase per migliorare la sopravvivenza delle singole cellule staminali dissociate^25,29. Le cellule devono essere distribuite uniformemente nel matraccio e nei singoletti che presentano una morfologia diffusa, simile a quella mesenchimale, dovuta al trattamento con inibitori di ROCK²².
2. Il giorno -2 e il giorno -1, cambiare il terreno con un terreno fresco di mantenimento delle cellule staminali; 12 mL per T75.
3. Il giorno 0, avviare la differenziazione modificando il supporto in messaggistica unificata; 12 mL per T75.
4. Modificare la messaggistica unificata ogni giorno (giorno 1 - giorno 5).
   NOTA: Le cellule in genere raggiungono la confluenza dopo 2 o 3 giorni in UM, che può essere osservata ad occhio nudo o attraverso un microscopio a campo chiaro invertito. Man mano che la differenziazione progredisce, i "tratti neurali" di nestina+ diventano visibili con cellule PECAM-1⁺ intermedie, come descritto in precedenza^13,14.
5. Espandere selettivamente la popolazione di cellule endoteliali passando al terreno EC con 20 ng/mL di bFGF e 10 μM di acido retinoico (RA) (giorno 6) e incubando per due giorni. Il terreno EC con bFGF può essere preparato fino a due settimane prima. L'AR viene aggiunto dal brodo congelato il giorno dell'uso (ad esempio, 1 μL di 10 mM di stock di RA per 1 mL di EC + bFGF).
   NOTA: La differenziazione di successo può essere raggiunta anche senza l'integrazione di AR nei giorni 6 e 8. L'omissione dell'AR, tuttavia, produrrà BEC con TEER^{ridotto 12,13,14}.
6. Rivestire le piastre di coltura cellulare e gli inserti di membrana (ad es. Transwell) con collagene IV e fibronectina (giorno 7), per la purificazione dei BEC e i successivi esperimenti.
   1. Per il rivestimento degli inserti a membrana, combinare 4 parti di collagene EV (1 mg/mL in 0,5 mg/mL di acido acetico), 1 parte di fibronectina (1 mg/mL) e 5 parti di acqua sterile per tessuti. La soluzione ECM può essere diluita 1:5 per il rivestimento di piastre di coltura cellulare (ad esempio, 4 parti di collagene IV, 1 parte di fibronectina, 45 parti di acqua). Incubare con soluzione di rivestimento a 37 °C per una notte.
      NOTA: Le piastre e gli inserti a membrana possono anche essere rivestiti per almeno 4 ore prima della subcoltura lo stesso giorno della fase di purificazione.
7. Purificare i BEC subcolturando le cellule differenziate su piastre o inserti di membrana rivestiti di collagene IV e fibronectina (giorno 8).
   1. Aspirare il terreno EC e aggiungere il reagente enzimatico di dissociazione cellulare (12 mL per T75). Incubare a 37 °C fino a quando il 90% delle cellule si è staccato dal pallone.
      NOTA: La dissociazione cellulare può richiedere fino a 1 ora.
   2. Durante il tempo di incubazione, rimuovere la soluzione di rivestimento di collagene IV/fibronectina dalle piastre/inserti precedentemente preparati e lasciarli asciugare in una cappa sterile. Ci vogliono circa 20 minuti perché gli inserti si asciughino.
   3. Una volta che le cellule si sono staccate, lavarle via dal matraccio con una pipetta da 10 ml. Pipettare su e giù per ottenere una sospensione a cellula singola.
      NOTA: La sospensione a cellula singola è importante per un conteggio affidabile delle cellule e per ottenere monostrati solidi.
   4. Diluire con un volume almeno uguale di hESFM fresco in una provetta conica da 50 mL e contare le cellule utilizzando un emocitometro.
   5. Pellet le cellule a 1.500 x g per 10 min.
   6. Risospendere le cellule in un volume appropriato di EC + bFGF + RA appena preparato per ottenere una sospensione di 2 x 10⁶ cellule/mL per la semina su inserti di membrana. Aggiungere 500 μL (1 x 10⁶ cellule) sopra un inserto a 12 pozzetti e 1,5 mL di terreno EC + bFGF + RA sul fondo. Per la semina su piastre da 24 e 48 pozzetti, diluire la sospensione cellulare 1:2 e aggiungere rispettivamente 500 μL (5 x 10 5 cellule) e 250 μL (2,5 x 10⁵ cellule) per pozzetto. Distribuire uniformemente le cellule nel pozzetto/inserto (vedere passaggio 2.2.4) e incubare a 37 °C con CO_{2 %} al 5%.
8. Cambiare i terreni su piastre/transpozzetti in EC senza bFGF o RA (giorno 9).
9. Condurre esperimenti di infezione, misurazione del TEER e colorazione in immunofluorescenza come descritto nelle sezioni seguenti (giorno 10).
   NOTA: I BEC differenziati e purificati con successo raggiungono in genere il picco di TEER il giorno 10 ed esprimono marcatori caratteristici delle cellule endoteliali cerebrali come PECAM-1 (CD31) e VE-caderina, il trasportatore del glucosio GLUT-1, trasportatori di efflusso come la glicoproteina p e i componenti della giunzione stretta ZO-1, Occludin e Claudin-5 13,14,16,17,19,22 . Fare riferimento a Lippmann et al., Stebbins et al. e altri per ulteriori dettagli e immagini dei tipi cellulari, delle morfologie e dell'espressione di marcatori specifici del tipo di cellula durante il processo di differenziazione 13,14,15,16,17,19,22. Immagini rappresentative delle cellule IMR90-4 in diverse fasi del processo di differenziamento BEC sono disponibili nella Figura 1 supplementare.

4. Resistenza elettrica transendoteliale (TEER) come misura della tenuta della barriera

NOTA: Il TEER viene solitamente letto sugli inserti di membrana nei giorni 9 e 10 di differenziazione per confermare l'avvenuta generazione di iPSC-BEC che formano una barriera (Figura 1A).

1. Posizionare il volt-ohmmetro epiteliale (EVOM) nell'ambiente sterile di una cappa di biosicurezza e collegare l'elettrodo all'EVOM.
2. Disinfettare l'elettrodo immergendolo in EtOH al 70% per almeno 5 min e lasciarlo asciugare completamente.
   NOTA: Se necessario, è possibile un'incubazione più lunga in EtOH al 70% o la decontaminazione dell'elettrodo con una soluzione di ipoclorito al 5%.
3. Recuperare le iPSC-BEC sugli inserti a membrana dall'incubatore e misurare il TEER.
   NOTA: È importante leggere rapidamente il TEER dopo la rimozione dall'incubatore poiché il cambiamento di temperatura può influire sulla misurazione del TEER.
4. Leggere TEER immergendo l'elettrodo nel fluido in modo che l'elettrodo più corto sia posizionato sopra l'inserto e l'elettrodo più lungo raggiunga il fluido che circonda l'inserto.
   NOTA: Assicurarsi che gli elettrodi sulle punte delle "bacchette" siano completamente coperti da liquido. Se necessario, inclinare il pozzetto per ottenere questo risultato prima di appoggiare nuovamente la piastra per la misurazione.

5. Colorazione a immunofluorescenza (IF) per convalidare il fenotipo BEC

NOTA: Per convalidare la qualità delle cellule completamente differenziate e purificate, i monostrati di iPSC-BEC vengono colorati per i marcatori caratteristici delle cellule endoteliali cerebrali il giorno 10 del processo di differenziazione come descritto in precedenza (Figura 1B\u2012G) 13,14,15,16,17,19,22.

1. Aspirare il mezzo e lavare 1 volta con PBS.
2. Fissare le celle con metanolo ghiacciato a temperatura ambiente (RT) per 15 min.
3. Lavare 3 volte con soluzione fisiologica tamponata con fosfato (PBS) e bloccare con siero fetale bovino al 10% (FBS) in PBS a RT per 1 ora.
4. Aspirare e aggiungere gli anticorpi primari diluiti in soluzione bloccante. Incubare a 4 °C per una notte.
   NOTA: Fare riferimento alla Tabella dei materiali e a Stebbins et al. per informazioni relative alla fonte e alla diluizione degli anticorpi²².
5. Lavare 3 volte con PBS prima di aggiungere l'anticorpo secondario diluito in soluzione bloccante. Incubare a RT per 1 h. Da questo momento in poi, proteggere i campioni dalla luce.
6. Lavare 2 volte con PBS. Quindi, aggiungere DAPI a una diluizione 1:5.000 in PBS e colorare a RT per 15 minuti.
7. Lavare 1 volta lasciando il PBS acceso e scattare immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza.

6. Preparazione di batteri e infezione di iPSC-BEC

1. Il giorno prima dell'esperimento di infezione (giorno 9 di differenziazione), iniziare una coltura notturna dei batteri da brodo congelato. Per l'infezione da Nm, striare i batteri sull'agar Columbia con il 5% di sangue di pecora (blood-agar). Incubare colture batteriche a 37 °C e 5% di CO₂ per una notte.
2. Il giorno successivo (giorno 10), preparare PPM+ fresco integrando il terreno peptone proteasi (PPM) con 50 μL di 2 M MgCl 2, 50 μL di₂ M NaHCO₃ e 100 μL di integratore Kellogg's per 10 mL. Inoculare 10 mL di terreno PPM+ in una provetta conica da 50 mL con Nm dalla piastra di coltura notturna utilizzando un batuffolo di cotone sterile. Incubare agitando a 200 giri/min a 37 °C per 1,5 ore (cioè fino a quando i batteri non sono in fase di crescita logaritmica).
3. Durante l'incubazione batterica, preparare le iPSC-BEC in una piastra da 24 pozzetti o su inserti di membrana per l'infezione sostituendo il vecchio terreno con 400 μL di terreno EC fresco (senza bFGF o RA) per pozzetto/parte superiore dell'inserto di membrana.
4. Centrifugare la coltura batterica a 4000 x g per 10 min e aspirare il terreno. Risospendere il pellet batterico in 250 μL di PBS.
5. In 4 mL di PBS fresco, utilizzare una porzione della sospensione cellulare batterica e regolare su un OD₆₀₀ di 0,4 (circa 1 x 10⁸ CFU/mL).
6. Quindi, diluire i batteri in terreno di coltura cellulare (terreno EC) in base alla molteplicità di infezione desiderata (MOI).
   NOTA: Ad esempio, per un MOI di 10, diluire 1:10 o 1:5 quando si infettano iPSC-BEC in una piastra a 24 pozzetti o su inserti di membrana, rispettivamente (1 x 10^{5 cellule} per monostrato in una piastra a 24 pozzetti). L'aggiunta di siero umano non è inclusa nella preparazione di Nm per l'infezione, come è stato descritto in altri manoscritti, in quanto è stato osservato che ha un impatto deleterio sul fenotipo di barriera iPSC-BEC misurato da TEER (dati non mostrati)^30,31. Tuttavia, l'interazione tra Nm e iPSC-BEC non è influenzata con o senza siero umano (dati non mostrati).
7. Infettare le iPSC-BEC in ciascun pozzetto con 100 μL di sospensione batterica preparata e incubare per il tempo desiderato di infezione.
   NOTA: L'espressione di un certo numero di citochine e chemochine proinfiammatorie è elevata nelle iPSC-BEC quando infettate da Nm, in modo più evidente dopo 8 ore di infezione, come descritto in precedenza da Martins-Gomes et al (Figura 2)¹⁹.

7. Attivazione immunitaria innata mediante PCR quantitativa

NOTA: Utilizzando un protocollo preferito per l'isolamento dell'RNA, la sintesi del cDNA e la qPCR, raccogliere campioni ed eseguire la qPCR su citochine selezionate.

1. 7.1. Raccogliere l'RNA dai campioni BEC dopo l'infezione il giorno 10 del protocollo di differenziazione, utilizzando i reagenti di un kit di isolamento dell'RNA disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali).
   NOTA: Evitare la contaminazione da nucleasi dei campioni lavorando con attenzione in un ambiente pulito e sterilizzato.
   1. Preparare il tampone di lisi e aggiungere 350 μL a ciascun pozzetto/monostrato di iPSC-BEC.
   2. Raccogliere i campioni pipettando su e giù numerose volte (ad es. 20x) e trasferendo la sospensione in una provetta sterile per microcentrifuga.
      NOTA: I campioni possono essere conservati a -80 °C fino a quando non sono pronti per l'isolamento dell'RNA.
   3. Seguire il protocollo fornito con il kit di isolamento dell'RNA per la purificazione dell'RNA da cellule e tessuti in coltura.
   4. Dopo l'eluizione in acqua priva di nucleasi, conservare i campioni di RNA su ghiaccio per ridurre al minimo qualsiasi potenziale attività della RNasi.
   5. Stimare le concentrazioni di RNA su uno spettrofotometro (ad esempio, Nanodrop).
2. Generare una libreria di cDNA dall'RNA raccolto utilizzando un kit di sintesi di cDNA (vedi Tabella dei materiali).
   1. Impostare reazioni costituite da una miscela master di sintesi di cDNA, almeno 200 ng (idealmente 500 ng) di RNA campione e acqua priva di nucleasi in un volume di reazione totale definito, come descritto nel protocollo del kit di sintesi del cDNA.
   2. Su un termociclatore standard, eseguire un programma appropriato per i reagenti del kit di sintesi del cDNA utilizzato. Ad esempio: 25 °C per 2 min, 55 °C per 10 min, 95 °C per 1 min.
   3. Dopo la sintesi, diluire il cDNA fino a 1:10 in acqua priva di nucleasi e spostare i campioni a 4 °C per la conservazione a breve termine o a -20 °C per la conservazione a lungo termine.
      NOTA: Una diluizione inferiore può essere necessaria se la concentrazione di RNA è bassa (ad esempio, inferiore a 50 ng). Il cDNA diluito può essere conservato a -20 °C per un massimo di un anno.
3. Eseguire la qPCR sui campioni di cDNA mirando alle trascrizioni dei geni della risposta immunitaria innata come citochine e chemochine con primer accuratamente progettati e convalidati.
   NOTA: Poiché il design del primer è molto importante per la qualità dei risultati della qPCR, l'efficienza del primer deve essere testata conducendo una serie di diluizioni e l'assenza di più prodotti deve essere confermata su un gel di DNA.
   1. Per una reazione da 25 μL, utilizzare un primer diretto da 0,5 μL e un primer inverso da 0,5 μL (10 mM in acqua priva di nucleasi), 1 μL di cDNA, 10,5 μL di H₂O privo di nucleasi e 12,5 μL di miscela master qPCR.
   2. Eseguire la reazione su una macchina qPCR utilizzando il seguente protocollo cycler: (a) 4 °C per 2 min; b) 95 °C per 15 min; c) 95 °C per 15 s; d) 60 °C per 1 min; scorrere (c) e (d) 45 volte; e) curva di fusione opzionale: 30\u201299 °C con incrementi di 1 °C; 25 °C per 5 min.
   3. Per l'analisi dei dati, utilizzare il calcolo ΔΔCT per confrontare i livelli di espressione di citochine e chemochine con un gene housekeeping di riferimento come 18S o GAPDH.

Risultati

Il protocollo qui descritto è adattato da Stebbins et al. ed evidenzia il processo per differenziare le iPSC in cellule endoteliali simili al cervello che possiedono proprietà BBB e come utilizzare questo modello per gli studi di infezione utilizzando iPSC-BEC con Nm^19,22. Le iPSC-BEC, se differenziate correttamente, mostrano proprietà di barriera strette misurate da TEER che sono spesso superiori a 2000 Ω·cm² ed esprimono marcatori endoteliali co...

Discussione

La modellazione dei BEC e della BBB ha avuto delle sfide, poiché i BEC umani primari e immortalizzati, in vitro, tendono a mancare di fenotipi di barriera robusti. L'avvento delle tecnologie delle cellule staminali umane ha permesso la generazione di cellule BEC derivate da iPSC che mantengono i fenotipi tipici della BBB come i marcatori endoteliali, l'espressione della giunzione stretta, le proprietà di barriera, la risposta ad altri tipi di cellule del SNC e i trasportatori funzionali dell'efflusso 12,13,14,...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase (1x)	Sigma	A6964	Enzymatic cell dissociation reagent
Acetic acid	Sigma	A6283
All-trans retinoic acid (RA)	Sigma	R2625
Anti-CD31 (PECAM-1)	Thermo Scientific (Labvision)	RB-10333
Anti-Claudin-5	Invitrogen	4C3C2
Anti-Glut-1	Thermo Scientific (Labvision)	SPM498 (MA5-11315)
Anti-Occludin	Invitrogen	33-1500
Anti-VE-cadherin	Santa Cruz	sc-52751
Anti-ZO-1	Invitrogen	33-9100
Bacto Proteose Peptone	BD	211684
b-Mercaptoethanol	Merck (Sigma-Aldrich)	805740
Cell culture plates and flasks	Sarstedt
Centrifuge (Heraeus Megafuge 1.0R)	Thermo Scientific
Class II biosafety cabinet	Nuaire	NU-437-400E
CO2 Incubator (DHD Autoflow CO2 Air-Jacketed Incubator)	Nuaire
Collagen IV	Sigma	C5533
Columbia ager + 5 % sheep blood	Biomerieux	43049
Costar Transwell polyester filters (12- or 24-well)	Corning	3460, 3470
D(+)-Glucose	Merck (Sigma-Aldrich)	G8270
DAPI	Invitrogen	D1306
DMEM/F12	Gibco	31330-038
DMSO	ROTH	A994.1
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Gibco	21600-069
Epithelial Volt-Ohm Meter (Millicell ERS-2) with STX electrode	Merck (Millipore)	MERS00002
Fe(NO3)3	ROTH	5632.1
Fibronectin	Sigma	F1141
Fluoresence microscope (Eclipse Ti)	Nikon
Hemacytometer (Neubauer)	A. Hartenstein	ZK06
Human basic fibroblast growth factor (bFGF)	PeproTech	100-18B
Human Endothelial Serum Free Medium (hESFM)	Gibco	11111-044
Inverted microscope (Wilovert)	Hund (Will Wetzlar)
iPS(IMR90)-4 cells	WiCell
Kellogg's supplement			To prepare 110 ml of Kellogg's supplement, prepare 100 ml of 4 g/ml glucose, 0.1 g/ml glutamine, and 0.2 mg/ml thiamine pyrophosphate and 10 ml of 5 mg/ml Fe(NO3)3 and combine the solutions. Filter sterilize and store aliquoted at -20 °C.
Knockout serum replacement (KOSR)	Gibco	10828-028
L-glutamine (GlutaMAX)	Invitrogen	35050-038
LunaScript RT SuperMix Kit	NEB	E3010L	cDNA synthesis kit
Matrigel Matrix	Corning	354230
Methanol	ROTH	4627.5
MgCl2	ROTH	KK36.1
Micropipettes (Research Plus)	Eppendorf
NaHCO3	ROTH	6329
Nonessential amino acids (NEAA)	Gibco	11140-035
NucleoSpin RNA isolation kit	Machery-Nagel	740955	RNA isolation kit
Pipette boy (Accu-Jet Pro)	Brand
Platelet poor plasma-derived serum, bovine (PDS)	Fisher	50-443-029
PowerUp SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	A25742	qPCR master mix
qPCR film (MicroAmp Optical Adhesive Film)	Applied Biosystems	4211971
qPCR plates (MicroAmp Fast 96-well)	Applied Biosystems	4346907
ROCK inhibitor, Y27632 dihydrochloride	Tocris	1254
RT-PCR thermo cycler (StepOnePlus)	Applied Biosystems	4376600
Serological pipettes	Sarstedt
StemFlex basal medium + 50x StemFlex supplement	Gibco	A3349401	Stem-cell maintenance medium
Swinging Bucket Rotor (Heraeus #2704)	Thermo Scientific
Thiamine pyrophosphate	Sigma	C8754-5G
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061
Versene	Gibco	15040-033	Non-enzymatic cell dissociation reagent (EDTA)