في تسجيل داخل الخلايا في الجسم من نوع تحديد الفئران موتونيورونات العمود الفقري خلال عبر العمود الفقري التحفيز المباشر للتيار

Summary

يصف هذا البروتوكول في التسجيل داخل الخلايا الجسمية للورذان القطنية مع التحفيز المباشر المباشر عبر العمود الفقري المتزامن. الطريقة تمكننا من قياس خصائص الغشاء وتسجيل اطلاق إيقاعي من ال motoneurons قبل وأثناء وبعد الاستقطاب anodal أو cathodal من الحبل الشوكي.

Abstract

التسجيل داخل الخلايا من موتونيورونات العمود الفقري في الجسم الحي يوفر "معيار الذهب" لتحديد الخصائص الكهربائية للخلايا في شبكة العمود الفقري سليمة ويحمل مزايا كبيرة بالنسبة لتقنيات التسجيل الكلاسيكية في المختبر أو خارج الخلية. ميزة في التسجيلات داخل الخلايا الحية هو أن هذه الطريقة يمكن أن تؤدي على الحيوانات البالغة مع نظام عصبي ناضجة تماما، وبالتالي يمكن ترجمة العديد من الآليات الفسيولوجية الملاحظة إلى تطبيقات عملية. في هذه الورقة المنهجية، نحن وصف هذا الإجراء جنبا إلى جنب مع التحفيز المستمر التيار المطبق خارجيا، والذي يحاكي عمليات الاستقطاب التي تحدث داخل شبكات الخلايا العصبية الشوكية. التحفيز المباشر للتيار عبر العمود الفقري (tsDCS) هو طريقة مبتكرة تستخدم بشكل متزايد كتدخل عصبي في إعادة التأهيل بعد الإصابات العصبية المختلفة وكذلك في الرياضة. لا يزال تأثير tsDCS على الجهاز العصبي غير مفهوم بشكل جيد والآليات الفسيولوجية وراء أفعاله غير معروفة إلى حد كبير. تطبيق tsDCS في وقت واحد مع التسجيلات داخل الخلايا تمكننا من مراقبة مباشرة التغيرات في خصائص غشاء موتونيورون وخصائص اطلاق الايقاع ردا على استقطاب شبكة الخلايا العصبية الشوكية، وهو أمر بالغ الأهمية لفهم الإجراءات tsDCS. وعلاوة على ذلك، عندما يتضمن البروتوكول المقدم تحديد التورون فيما يتعلق بالعضلات المُعَدَّة ووظيفتها (المرن مقابل التمدد) وكذلك النوع الفسيولوجي (سريع مقابل بطيء) فإنه يتيح فرصة للتحقيق بشكل انتقائي في تأثير tsDCS على مكونات محددة من دوائر العمود الفقري، والتي يبدو أنها تتأثر بشكل مختلف باستقطاب. ويركز الإجراء المقدم على الإعداد الجراحي للتسجيلات داخل الخلايا والتحفيز مع التركيز على الخطوات الضرورية لتحقيق استقرار الإعداد وقابلية تكرار النتائج. وتناقش تفاصيل منهجية تطبيق أنودال أو الكاثdal tsDCS مع إيلاء الاهتمام للقضايا العملية والسلامة.

Introduction

عبر العمود الفقري التحفيز الحالي المباشر (tsDCS) تكتسب الاعتراف كوسيلة قوية لتعديل استثارة الدائرة الشوكية في الصحة والمرض^1,2,3. في هذه التقنية، يتم تمرير تيار ثابت بين القطب النشط الموجود فوق شرائح العمود الفقري المحددة، مع قطب مرجعي يقع إما ventrally أو أكثر من^4. وقد أكدت العديد من الدراسات بالفعل أنه يمكن استخدام tsDCS في إدارة بعض الحالات المرضية، مثل الألم العصبي⁵، التشنج⁶، إصابة الحبل الشوكي⁷ أو لتسهيل إعادة التأهيل⁸. يقترح الباحثون أن tsDCS يثير التعديلات في التوزيع الأيوني بين الفضاء داخل الخلايا وخارج الخلية عبر غشاء الخلية ، وهذا يمكن أن يسهل أو يمنع نشاط الخلايا العصبية اعتمادا على التوجه الحالي^9،10،11. ومع ذلك ، حتى وقت قريب ، كان هناك نقص في تأكيد مباشر لهذا التأثير على الـ motoneurons.

هنا، ونحن وصف بروتوكول مفصل لإجراء في تسجيل داخل الخلايا الجسمية من الإمكانات الكهربائية من اللوبيرونات القطنية في الفئران المصبعر مع تطبيق متزامن من tsDCS، من أجل مراقبة التغيرات في غشاء موتونيورون وإطلاق خصائص استجابة لالانتحال الأنودال أو cathodal من شبكة الخلايا العصبية الشوكية. التسجيلات داخل الخلية فتح عدة مجالات للتحقيق في خصائص الخلايا العصبية, غير متوفرة لتقنيات خارج الخلية المستخدمة سابقا^9,12. على سبيل المثال، من الممكن قياس استجابة الجهد الغشاء ال motoneuron بدقة إلى التدفق الحالي المباشر الناجم عن tsDCS، للإشارة إلى عتبة الجهد لتوليد ارتفاع، أو لتحليل المعلمات المحتملة العمل. وعلاوة على ذلك، هذه التقنية تسمح لنا لتحديد خصائص الغشاء الخامل موتونورون، مثل المقاومة المدخلات، ومراقبة العلاقة بين تيار التحفيز داخل الخلايا وتواتر اطلاق الإيقاعي من موتونيورونات. تحديد مضاد للmotoneuron المسجلة، استنادا إلى تحفيز الأعصاب التي تم تحديدها وظيفيا (أي الأعصاب التي توفر الإفراسات إلى المرنات أو extensors) يسمح لنا بالإضافة إلى ذلك لتحديد أنواع من وحدات المحركات إيندفيديد (سريع مقابل بطيء)، مما يعطي فرصة لاختبار ما إذا كان الاستقطاب يؤثر بشكل مختلف العناصر الفردية من نظام العمود الفقري ناضجة. بسبب عملية جراحية واسعة النطاق تسبق التسجيل والمتطلبات العالية على استقرار وموثوقية التسجيلات ، هذه التقنية صعبة للغاية ولكنها تسمح بتقييم مباشر وطويل الأجل للخصائص الفسيولوجية الكهربائية ل motoneuron واحد: قبل وأثناء وبعد تطبيق tsDCS ، وهو أمر حاسم لتحديد كل من إجراءاتها الحادة والتأثيرات المستمرة¹³. كما motoneuron ينشط مباشرة ألياف العضلات خارج¹⁴ ويشارك في السيطرة على ردود الفعل من تقلص العضلات وتطوير قوة^15،16 أي تأثير لوحظ من tsDCS على وحدة المحرك أو خصائص العضلات قد تكون مرتبطة بالتعديلات من الإثارة motoneuron أو إطلاق الخصائص.

Protocol

وقد قبلت السلطات المختصة (مثل لجنة الأخلاقيات المحلية) جميع الإجراءات المتصلة بهذا البروتوكول، وهي تتبع القواعد الوطنية والدولية بشأن رعاية الحيوانات وإدارتها.

ملاحظة: يجب أن يكون كل مشارك مشارك في العملية مدربًا بشكل صحيح على العمليات الجراحية الأساسية ويجب أن يكون لديه ترخيص صالح لإجراء التجارب الحيوانية.

1. التخدير والتطبيب عن سبق

1. تخدير جرذ مع الحقن داخل الصفتون من بينتوبربيتال الصوديوم (جرعة أولية من 60 ملغ ·كغ^-1 لفئران ويستار الذكور 6 أشهر وزنها 400\u2012550g).
   ملاحظة: لا يقتصر هذا البروتوكول على السلالة المشار إليها أو جنس أو عمر الفئران. أيضا، يمكن استخدام التخدير البديل مثل مزيج الكيتامين-زيلازين، ألفا-كلورالوس أو الفنتانيل + ميدازولام + medetomidine إذا كان أكثر ملاءمة لأهداف البحث المختلفة أو عندما يطلب من لجنة الأخلاقيات.
2. بعد حوالي 5 دقائق ، تحقق من عمق التخدير عن طريق قرص إصبع قدمه الفئران الخلفية مع ملقط حادة. تابع الخطوات التالية من البروتوكول فقط عندما يتم ملاحظة أي إجراء منعكس.
3. حقن 0.05 مل من الأتروبين تحت الجلد من أجل الحد من إنتاج المخاط بعد النوب.
4. حقن تحت الجلد 5 مل من الفوسفات العازلة التي تحتوي على 4% محلول جلوكوز, NaHCO₃ (1 %) والجيلاتين (14%). وسيتم امتصاص هذا العازلة من قبل السفن الجلدية في جميع أنحاء التجربة، وسوف تساعد على الحفاظ على توازن السوائل.
5. طوال الجراحة، والتحقق من الحيوان دوريا عن الإجراءات المنعكة والملحق التخدير إذا لزم الأمر (10 ملغم · كجم^{-1 1}ح^-1من الصوديوم pentobarbital).

2. الجراحة

1. إعداد الحيوان للعلاج الجراحي عن طريق حلق الفراء على الجزء الظهري من الظهر الأيسر، من الكاحل إلى الورك، والخلف، من الذيل إلى شرائح الصدر عالية، والجانب الأيسر من الصدر، والجانب البطني من منطقة الرقبة فوق القص
2. وضع الخط الوريدي
   1. ضع الجرذ على ظهره على وسادة تدفئة مغلقة (وآمن به مع تثبيتات الأطراف).
   2. باستخدام شفرة 21، جعل قطع طولية من خلال الجلد من القص إلى الذقن.
   3. أمسك الجلد بالملبس وافصله عن الأنسجة الأساسية.
   4. باستخدام تقنيات التشريح الحادة تكشف الوريد الوداجي الأيمن. تشريح بعناية الوريد من الأنسجة المحيطة بها.
   5. حدد موقع جزء من الوريد دون نقاط التفريع، زلة اثنين من 4-0 الأربطة تحته.
   6. جعل عقدة واحدة فضفاضة على الطرف القريب من الجزء المحدد سابقا غير المتفرعة من الوريد وعقدة واحدة فضفاضة على نهاية هات من هذا الجزء من الوريد. المشبك الوريد القريب إلى القلب، ومن ثم ligate الجزء من الوريد.
   7. باستخدام مقص القزحية، قم بعمل شق بين المشبك والأربطة البعيدة. عقد رفرف من الوريد، وإدخال قسطرة مملوءة مسبقا إلى النقطة حيث يتم حظره من قبل المشبك.
   8. أثناء حمل الوريد والقسطرة مع ملقط، قم بإزالة المشبك ودفع القسطرة عدة ملليمترات في الوريد. تأمين طرفي القسطرة إلى الوريد، وإضافة نقطة تثبيت إضافية إلى الجلد.
3. مقدمة أنبوب القصبة الهوائية
   1. باستخدام ملقط حادة فصل الغدد الماندية اثنين تغطي عضلات sternohyoid. فصل عضلات sternohyoid في خط الوسط لفضح القصبة الهوائية.
   2. زلة ثلاثة 4-0 أربطة تحت القصبة الهوائية، ثم جعل عقدتين تحت نقطة إدخال أنبوب القصبة الهوائية وعقدة واحدة أعلاه.
   3. حدد مكان الغضروف cricoid من الحنجرة وجعل شق تحت الغضروف الثالث القصبي.
   4. أدخل أنبوب القصبة الهوائية أسفل القصبة الهوائية وقم بتأمين الأنبوب في مكانه باستخدام أربطة معدة مسبقًا، ثم أضف ربطة عنق إضافية إلى الجلد.
   5. ضع قطعة صغيرة من الصوف القطني فوق العضلات المنفصلة، وخياطة الجلد فوق المنطقة التي يتم تشغيلها.
4. تشريح أعصاب الأطراف الخلفية
   1. باستخدام 21 شفرة، وجعل قطع طولية على الجانب الخلفي من الطرف الخلفي الخلفي، من وتر أخيل إلى الورك.
   2. الاستيلاء على الجلد مع ملقط، واستخدام تقنيات تشريح حادة فصل الجلد من العضلات الكامنة على جانبي الشق.
   3. تحديد موقع الفوسا البوبليتال في الجزء الخلفي من مفصل الركبة, التي تغطيها العضلة ذات الرأسين في عضلة femoris, وباستخدام مقص جعل قطع بين الجزء الأمامي والخلفي من هذه العضلة.
   4. تتحرك صعودا قطع اثنين من رؤساء femoris العضلة ذات الرأسين على طول الطريق إلى الورك لفضح العصب الوركي. الكي حسب الحاجة لمنع النزيف.
   5. تحديد فروع الزّرّيّة، التيبّية والوعّادة في العصب الوركي.
   6. باستخدام مقص، وفصل الجانبي من الرأس الوسيط من العضلات gastrocnemius لفضح العصب التيبالي وفروعه.
   7. باستخدام 55 ملقط انتزاع نهاية بعيدة من العصب sural، وقطع ذلك distally وتشريح قدر الإمكان.
   8. كرر الإجراء مع العصب البيروني المشترك.
   9. باستخدام قضيب زجاجي حاد يفصل العصب الدنيبي عن الأنسجة المحيطة ، مع الحرص على عدم تلف الأوعية الدموية ، وقطعه بشكل distally.
   10. تحديد الجهاز الهضمي الوسيط (MG) والعصابات معتدية الجانبي soleus (LGS).
   11. باستخدام 55 ملقط, تشريح بعناية الأعصاب MG وLGS, فصلها من الأنسجة المحيطة, ولكن الحفاظ على اتصالها إلى العضلات المعنية.
   12. ضع قطعة من الصوف القطني المنقوعة بالملوحة تحت الأعصاب المكشوفة.
   13. أغلق الجلد فوق المنطقة التي يتم تشغيلها.
5. استئصال لامينكومي
   1. باستخدام شفرة 21 جعل شق طولي من العجز حتى الفقرات الصدرية.
   2. افصل الجلد عن العضلات الكامنة.
   3. قطع العضلات longissimus على كلا الجانبين من العمليات الزناة الصدرية والقطنية.
   4. باستخدام مشرط ذو حدين حاد سحب العضلات من العمود الفقري لفضح العمليات العرضية لكل فقرة.
   5. باستخدام مقص تلميح حادة قطع الأوتار من العضلات المتصلة العمليات العرضية على طول العمود الفقري المكشوفة. تطبيق وكلاء hemostatic إذا لزم الأمر.
   6. تحديد فقرة Th13 كأدنى جزء الصدر مع إدراج الضلع واستخدام rongeurs غرامة إزالة العمليات العرضية والرقي من Th13 إلى L2 الفقرات لفضح شرائح القطنية من الحبل الشوكي. تذكر عدم إلحاق الضرر بعملية L3 العرضية التي سيتم استخدامها كنقطة تثبيت لتثبيت العمود الفقري.
   7. إزالة العملية Th12 spinous وسلس سطح الظهر الفقرات قدر الإمكان.
   8. باستخدام تقنيات تشريح حادة فصل العضلات من فقرة Th11 لخلق نقاط الإدراج حامل.
   9. ضع الصوف القطني المنقوع بالملوحة الرقيقة فوق شرائح الحبل الشوكي المكشوفة.
   10. نقل الفئران إلى العرف الإطار المعدني مع اثنين من القضبان المتوازية واثنين من الأسلحة قابل للتعديل مع المشابك لدعم واستقرار العمود الفقري.

3. التحضير للتسجيل والتحفيز

1. تثبيت العمود الفقري وترتيب العصب
   1. ضع الجرذ في الإطار المصنوع حسب الطلب على وسادة التدفئة، متصلة بنظام التدفئة حلقة مغلقة للحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان في 37 ± 1 درجة مئوية.
   2. أدخل أقطاب ECG تحت الجلد واربط بمكبر للصوت لمراقبة معدل ضربات القلب.
   3. باستخدام اللوحات الجلدية، تشكل بركة عميقة فوق الحبل الشوكي المكشوف.
   4. باستخدام المشابك المعدنية، وإصلاح العمود الفقري عن طريق وضع المشابك تحت العمليات العرضية Th12 وفي عملية الانسة L3.
   5. تأكد من أن العمود الفقري مؤمنة ومرتبة أفقيا، ومن ثم تطبيق الضغط دورسو فينتيال على جانبي العمود لسحب العضلات.
   6. ملء حمام السباحة مع الزيوت المعدنية الدافئة (37 درجة مئوية) والحفاظ عليه في هذه الدرجة.
   7. الخيط 4-0 رباط من خلال وتر أخيل, رفع وتمتد الطرف الخلفي الأيسر تعمل بحيث يتم تسوية الكاحل مع الورك.
   8. باستخدام اللوحات الجلدية جعل بركة عميقة على البيبية المكشوفة، MG وLGS الأعصاب.
   9. املأ المسبح بالزيت المعدني الدافئ (37 درجة مئوية).
   10. ضع الأعصاب MG وLGS على أقطاب كهربية الأسلاك الفضية الثنائية الأقطاب المحفزة وتوصيلها بمحفز نبض مربع. استخدم قنوات تحفيز منفصلة لكل عصب.
2. موضع القطب السطحي
   1. ضع قطب الكرة الفضية على الجانب السدالي الأيسر من الحبل الشوكي المكشوف ، مع إدخال قطب مرجعي في عضلات الظهر ، وتوصيل كل من الأقطاب الكهربائية بمكبر الصوت التفاضلي DC. سيتم استخدام قطب الكرة السطح لتسجيل وابل من الاعصاب.
   2. باستخدام محفز ثابت التيار، وتحفيز الأعصاب MG وLGS مع نبضات مربعة من 0.1 مللي ثانية، تتكرر على تردد 3 هرتز، ومراقبة وابل afferent.
   3. تحديد عتبة (T) لتنشيط العصب، وتحفيز كل عصب في حوالي 3· T كثافة، والسعة القياسية من الطائرة afferent لكل عصب.
   4. حرك القطب السطحي وكرر الإجراء لتحديد شرائح العمود الفقري التي تكون فيها السعات من الكرات هي الأعلى لكل عصب. بعد تحديد موقع الطائرة القصوى، حرّك القطب السطحي إلى مسافة آمنة من الحبل الشوكي.
3. شلل العضلات وتشكيل اِصِرَة الصدر من أجل تقليل حركات الجهاز التنفسي
   1. شلل الفئران عن طريق الوريد مع مانع عصبي عضلي وربط أنبوب القصبة الهوائية إلى جهاز التنفس الصناعي الخارجي تمشيا مع كابينوتر متوافق مع القوارض (بروميد بانكورونيوم, بجرعة أولية من 0.4 ملغ ·كغم^-1, تستكمل كل 30 دقيقة في جرعات من 0.2 ملغ ·كغ^-1)
   2. مراقبة تركيز ثاني أكسيد الكربون₂ في نهاية المد والجزر والحفاظ عليه عند حوالي 3\u20124% عن طريق ضبط المعلمات التهوية (التردد وضغط الهواء وحجم التدفق).
   3. إجراء شق طولي في الجلد بين الضلع الخامس والسادس على جانب من التسجيل.
   4. باستخدام مقص تلميح حادة قطع العضلات فوق لتصور الفضاء الوربي بين الأضلاع.
   5. باستخدام مقص حاد صغير، وجعل شق صغير في العضلات الوربية وفي الجنب، ثم إدراج طرف من ملقط حافة حادة في الفتحة، مع الحرص على عدم الضغط على الرئتين.
   6. السماح للملباب لتوسيع أو إدراج أنبوب صغير للحفاظ على اِسِرَح الصدر مفتوح طوال التجربة.
   7. بعد الكتلة العصبية العضلية، مراقبة عمق التخدير عن طريق التحقق من تردد ECG، وتكملة عامل التخدير إذا كان معدل ضربات القلب يتجاوز 400 bpm. شلل العضلات وتشكيل اِهضة الصدر من أجل تقليل حركات الجهاز التنفسي، مما سيحسن من ثبات التسجيل
4. فتح دورا وبيا ماتر
   1. باستخدام #55 ملقط، رفع بلطف ماطر دورا، وقطع عليه caudally من الجزء L5، rostrally تصل إلى الجزء L4.
   2. باستخدام زوج من رقيقة جدا 5SF ملقط جعل رقعة صغيرة في بيا تغطي العمود الظهري، بين الأوعية الدموية، بالضبط على مستوى الطائرة afferent القصوى من MG أو العصب LGS.
   3. استخدام قطع صغيرة من رغوة هلام المالحة المنقوعة والمجففة لمنع النزيف إذا لزم الأمر.
5. موضع قطب كهربائي tsDCS
   1. إجراء شق صغير في الجلد على الجانب البطني من بطن الفئران على مستوى روسترو- الكودال المقابلة لموقع شرائح العمود الفقري L4-L5.
   2. الاستيلاء على رفرف الجلد المكشوفة مع مقطع معدني الذي سيكون بمثابة القطب المرجعي.
   3. ضع إسفنجة مبللة بالملوحة على الجانب الظهري من فقرة Th12. تأكد من أن حجم الإسفنج يساوي حجم قطب tsDCS النشط (لوحة من الفولاذ المقاوم للصدأ على شكل دائرة قطرها 5 مم).
   4. باستخدام المتلاعب غرامة، اضغط على الاسفنج مع القطب tsDCS النشطة حتى العظم وتأكد من أن يتم الضغط على سطح القطب بأكمله على قدم المساواة.
   5. قم بتوصيل كل من الأقطاب الكهربائية المرجعية والناشطة tsDCS بوحدة محفزة ثابتة، قادرة على تقديم تدفق مستمر للتيار المباشر.
6. إعداد micropipettes
   1. باستخدام سحب microelectrode، وإعداد microelectrode.
      ملاحظة: يمكن استخدام كل من الخيوط والأقطاب غير الخيطية، ومع ذلك، تذكر أن ساق القطب يجب أن تكون طويلة بما يكفي للوصول إلى القرن البطني في حين يجري رقيقة بما يكفي لا ضغط الحبل الشوكي أثناء الهبوط.
      1. ضبط الإعداد puller بحيث ساق دخول الحبل الشوكي هو ما يقرب من 3 مم طويلة، في حين أن غيض من القطب هو ما يزيد عن 1\u20122 μm في القطر وmicroelectrode المقاومة بين 10 و 20 MΩ.
   2. ملء microelectrodes مع 2M البوتاسيوم- سترات المنحل بالكهرباء.
   3. جبل microelectrode على micromanipulator السماح 1\u20122 μm حركة الدوس والمعايرة stereotaxic.
   4. قم بتوصيل المايكروليكترورود بمكبر الصوت داخل الخلايا مع القطب المرجعي الموضوع في عضلات الظهر.
7. بعد الكتلة العصبية العضلية، مراقبة عمق التخدير عن طريق التحقق من تردد ECG، وتكملة عامل التخدير بحيث لا يتجاوز معدل ضربات القلب الفئران 400 bpm.

4. موتونيورون تتبع والاختراق

1. ضع قطب تسجيل الكرة الطائرة على سطح الظهر في الحبل الشوكي، بشكل دائري إلى موقع التسجيل، على مستوى الجزء L6.
2. تحفيز الأعصاب MG وLGS مع البقول الكهربائية 0.1 مللي ثانية في تردد 3 هرتز، وكثافة 3T، لتنشيط جميع محاور من ألفا موتونيورونات داخل العصب المحدد.
3. محرك micropipette في التصحيح المحدد في بيا مع زاوية ميديو الجانبي من 15\u201220 ° (مع تلميح الموجهة بشكل جزئي).
4. بعد نزول أسفل السطح، معايرة microelectrode وتعويض عن السعة والجهد تعويض، ومواصلة اختراق الحبل الشوكي عندما تكون جميع المعلمات مستقرة. حقل مضاد للاندرامي المحتملة من بركة موتونيورون ستكون مرئية في تتبع الجهد microelectrode في حين تقترب من نواة محرك مخصص أثناء تحفيز العصب كل منها.
5. المضي قدما في الاختراق مع microelectrode في 1\u20122 μm الخطوات، واستخدام دوريا وظيفة الطنانة من مكبر للصوت داخل الخلايا لمسح طرف القطب من أي بقايا.
6. مراقبة تغلغل موتونيورون التي سوف تتميز فرط القطبية المفاجئة من تتبع الجهد المسجل ومظهر من احتمالية المسامير المضادة للاندرومو.

5. تسجيل غشاء موتونيورون وممتلكاتهم إطلاق النار

1. في وضع جسر من مكبر للصوت داخل الخلايا، وتحديد موتونيورون على أساس ظهور "كل شيء أو لا شيء" من إمكانات العمل المضادة للاندرومية من خلال تحفيز فروع العصب المعنية. سجل 20 آثار لاحقة لمتوسط لاحق.
2. تنفيذ معيار إدراج صارم لضمان بيانات عالية الجودة: غشاء غشاء احتمالية لا تقل عن -50 mV في السعة؛ العمل السعة المحتملة أكبر من 50 mV، مع تجاوز إيجابي؛ غشاء مستقرة محتملة لمدة 5 دقائق على الأقل قبل التسجيل.
3. في وضع المشبك الحالي غير المتجاور (وضع معدل التبديل الحالي 4-8 كيلو هرتز) من مكبر الصوت داخل الخلايا، استحضار إمكانية عمل تقويم العظام في موتونيورون باستخدام نبضات تيارية 0.5 مللي ثانية. كرر 20 مرة على الأقل للمتوسط غير متصل.
4. تحفيز موتونيورون مع 40 نبضة قصيرة (100 مللي ثانية) من التيار فرط القطبية (1 ن أ) من أجل حساب مقاومة مدخلات الخلية.
5. تحفيز موتونيورون مع 50 مللي ثانية نبضات موجة مربعة في زيادة السعة لتحديد قيمة rheobase كحد أدنى من السعة الحالية depolarizing المطلوبة لاثارة ارتفاع واحد.
6. حقن 500 مللي ثانية نبضات موجة مربعة من التيار الزخرف، في زيادة السعة في خطوات 0.1-2 ن أ لاستحضار التفريغ الإيقاعي من موتونيورونات.

6. عبر العمود الفقري التحفيز الحالي المباشر (tsDCS)

1. مع الحفاظ على اختراق مستقر للmotoneuron ، ابدأ إجراء الاستقطاب عن طريق تطبيق عبر العمود الفقري للتيار المباشر. ضبط شدة الحالية ووقت التطبيق لتصميم التجربة (على سبيل المثال، 0.1 م أ لمدة 15 دقيقة).
2. مباشرة بعد التبديل على العاصمة، لاحظ احتمال غشاء موتونيورون. الاستقطاب الأندود (القطب النشط مثل القطب) ينبغي أن يؤدي إلى إزالة الاستقطاب من الغشاء المحتملة، في حين أن الاستقطاب الكوثودي (القطب النشط ككاثود) ينبغي أن تثير تأثير عكسي. مراقبة ما إذا كان هناك تغيير في إمكانية الغشاء يستريح استجابة لتحفيز التيار المستمر، مما يضمن أن كثافة المجال الكهربائي لا تتأثر.
3. أثناء التطبيق الحالي المستمر، كرر الخطوات 5.3\u20125.6 في فواصل زمنية 5 دقائق.
4. قم بإيقاف تشغيل DC ثم متابعة تكرار الخطوات 5.3\u20125.6 في فواصل زمنية 5 دقائق حتى تصبح التسجيلات غير مستقرة أو يتم اختراق معايير التضمين.
5. إنهاء التجربة والقتل الرحيم الحيوان باستخدام إعطاء الوريد من جرعة قاتلة من الصوديوم pentobarbital (180 ملغ ·كغم^-1).

النتائج

يمكن حساب بارامترات إمكانات العمل وخصائص الغشاء المتعددة على أساس التسجيلات داخل الخلايا عندما يتم ضمان استقرار ظروف اختراق الخلايا. الشكل 1A يقدم إمكانية عمل تقويم العظام النموذجية التي أثارها التحفيز داخل الخلايا، والتي تلبي جميع المعايير لإدراج البيانات (إمكانية الغش...

Discussion

إذا تم تنفيذها بشكل صحيح، يجب إكمال الجزء الجراحي من البروتوكول الموصوف في غضون ثلاث ساعات تقريبًا. وينبغي للمرء أن يأخذ عناية خاصة في الحفاظ على ظروف فسيولوجية مستقرة من أثناء الجراحة، ولا سيما درجة حرارة الجسم وعمق التخدير. وبصرف النظر عن الاعتبارات الأخلاقية الواضحة، يمكن أن يؤدي عدم ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Durgs and solutions	-	-	-
Atropinum sulfuricum	Polfa Warszawa	-	-
Glucose	Merck	346351	-
NaHCO3	Merck	106329	-
Pancuronium Jelfa	PharmaSwiss/Valeant	-	Neuromuscular blocker
Pentobarbital sodium	Biowet Pu?awy Sp. z o.o	-	Main anesthetic agent
Pottasium citrate	Chempur	6100-05-06	-
Tetraspan	Braun	-	HES solution
Surgical equipment	-	-	-
21 Blade	FST	10021-00	Scalpel blade
Cauterizer	FST	18010-00	-
Chest Tubes	Mila	CT1215	-
Dumont #4 Forceps	FST	11241-30	Muscle forceps
Dumont #5 Forceps	FST	11254-20	Dura forceps
Dumont #5F Forceps	FST	11255-20	Nerve forceps
Dumont #5SF Forceps	FST	11252-00	Pia forceps
Forceps	FST	11008-13	Blunt forceps
Forceps	FST	11053-10	Skin forceps
Hemostat	FST	13013-14	-
Rongeur	FST	16021-14	For laminectomy
Scissors	FST	15000-08	Vein scissors
Scissors	FST	15002-08	Dura scissors
Scissors	FST	14184-09	For trachea cut
Scissors	FST	104075-11	Muscle scissors
Scissors	FST	14002-13	Skin scissors
Tracheal tube	-	-	Custom made
Vein catheter	Vygon	1261.201	-
Vessel cannulation forceps	FST	18403-11	-
Vessel clamp	FST	18320-11	For vein clamping
Vessel Dilating Probe	FST	10160-13	For vein dissection
Sugrgical materials	-	-	-
Gel foam	Pfizer	GTIN 00300090315085	Hemostatic agent
Silk suture 4.0	FST	18020-40	-
Silk suture 6.0	FST	18020-60	-
Equipment	-	-	-
Axoclamp 2B	Molecular devices	discontinued	Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A
CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor	CWE	11-10000	Gas analyzer
Grass S-88	A-M Systems	discontinued	Constant current stimulator
Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe	Harvard Apparatus	507222F	Heating system
ISO-DAM8A	WPI	74020	Extracellular amplifier
Microdrive	-	-	Custom made/replacement IVM/Scientifica
P-1000 Microelectrode puller	Sutter Instruments	P-1000	Microelectrode puller
SAR-830/AP Small Animal Ventilator	CWE	12-02100	Respirator
Support frame	-	-	Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting
Spinal clamps	-	-	Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting
TP-1 DC stimulator	WiNUE	-	tsDCS stimulator
Miscellaneous	-	-	-
1B150-4 glass capillaries	WPI	1B150-4	For microelectrodes production
Cotton wool	-	-	-
flexible tubing	-	-	For respirator and CO2 analyzer connection
MicroFil	WPI	MF28G67-5	For filling micropipettes
Silver wire	-	-	For nerve electrodes