Trans-Spinal Doğrudan Akım Stimülasyonu Sırasında Tip-Tanımlanmış Sıçan Spinal Motoneurons In Vivo Hücre İçi Kayıt

Özet

Bu protokol, eşzamanlı trans-spinal doğru akım stimülasyonu ile sıçan lomber motoneurons in vivo hücre içi kayıt açıklar. Bu yöntem, omuriliğin anodal veya kahodal polarizasyonuöncesinde, sırasında ve sonrasında motononların ritmik ateşlemesini kaydetmemizi sağlar.

Özet

In vivo spinal motoneurons hücre içi kayıt bozulmamış spinal ağ hücrelerin elektrofizyolojik özelliklerini belirlemek için bir "altın standart" sağlar ve klasik in vitro veya hücre dışı kayıt teknikleri göre önemli avantajlar alametleri vardır. In vivo hücre içi kayıtların bir avantajı, bu yöntemin tamamen olgun bir sinir sistemine sahip yetişkin hayvanlar üzerinde yapIlebilmektedir ve bu nedenle gözlenen birçok fizyolojik mekanizma pratik uygulamalara çevrilebilir. Bu metodolojik yazıda, spinal nöronal ağlarda meydana gelen polarizasyon süreçlerini taklit eden dışa uygulanan sürekli akım stimülasyonu ile birlikte bu prosedürü açıklıyoruz. Trans-spinal doğru akım stimülasyonu (tsDCS) giderek çeşitli nörolojik yaralanmalar dan sonra rehabilitasyon da nöromodülatör bir müdahale olarak kullanılan yenilikçi bir yöntemdir yanı sıra spor. TSDCS'nin sinir sistemi üzerindeki etkisi tam olarak anlaşılamamıştır ve eylemlerinin arkasındaki fizyolojik mekanizmalar büyük ölçüde bilinmemektedir. TSDCS'nin hücre içi kayıtlarla eş zamanlı olarak uygulanması, tsDCS eylemlerinin anlaşılması için çok önemli olan spinal nöronal ağın polarizasyonuna yanıt olarak motonöron membran özelliklerinin ve ritmik ateşleme özelliklerinin değişimini doğrudan gözlemlememizi sağlar. Ayrıca, sunulan protokol bir innerve kas ve fonksiyonu (fleksör karşı ekstansör) yanı sıra fizyolojik türü (hızlı karşı yavaş) açısından motoneuron belirlenmesi ni içerdiğinde seçici olarak spinal devre, farklı kutuplaşma etkilenmiş gibi görünüyor spinal devre nin tanımlanmış bileşenleri üzerinde tsDCS etkisini araştırmak için bir fırsat sağlar. Sunulan prosedür, hazırlık stabilitesi ve sonuçların tekrarlanabilirliğini sağlamak için gerekli olan adımlarüzerinde durularak hücre içi kayıtlar ve stimülasyon için cerrahi hazırlık üzerine odaklanmaktadır. Pratik ve güvenlik konularına dikkat edilirken anodal veya katodal tsDCS uygulamasının metodolojisinin ayrıntıları tartışılır.

Giriş

Trans-spinal doğru akım stimülasyonu (tsDCS) sağlık ve hastalık¹spinal devre uyarılabilirlik değiştirmek için güçlü bir yöntem olarak tanıma kazanıyor¹,^2,3. Bu teknikte, seçilen spinal segmentlerin üzerinde bulunan aktif bir elektrot arasında sabit bir akım geçirilir, ventrally veya daha^rostrally4 bulunan bir referans elektrot ile. Çeşitli çalışmalar zaten tsDCS bazı patolojik koşulların yönetiminde kullanılabilir doğruladı, nöropatik ağrı gibi⁵, spastisite⁶, omurilik yaralanması⁷ veya rehabilitasyon kolaylaştırmak için⁸. Araştırmacılar tsDCS hücre içi ve hücre zarı boyunca hücre içi ve hücre dışı uzay arasındaki iyon dağılımıdeğişiklikleri çağrıştırıyor öneririz, ve⁹bu ya kolaylaştırmak veya mevcut oryantasyon abağlı olarak nöronal aktiviteyi inhibe 9^,10,11. Ancak, yakın zamana kadar, motoneurons üzerinde bu etkiyi doğrudan bir onay eksikti.

Burada, tsDCS eşzamanlı uygulama ile anestezili sıçan lomber spinal motoneurons elektrik selülozlarının in vivo hücre içi kayıt yapmak için ayrıntılı bir protokol açıklar, spinal nöronal ağın anodal veya kahodal polarizasyon yanıt olarak motonöron membran değişiklikleri gözlemlemek ve ateşleme özellikleri. Hücre içi kayıtlar nöron özellikleri nin araştırılması çeşitli alanlarda açık, daha önce kullanılan hücre dışı teknikler için kullanılamaz^9,12. Örneğin, tsDCS tarafından indüklenen doğru akım akışına motoneuron membran gerilim tepkisini tam olarak ölçmek, ani üretim için gerilim eşiğini belirtmek veya eylem potansiyeli parametrelerini analiz etmek mümkündür. Ayrıca, bu teknik bize girdap direnci gibi motoneuron pasif membran özelliklerini belirlemek için izin verir, ve intrahücresel stimülasyon akımı ve motoneurons ritmik ateş sıklığı arasındaki ilişkiyi gözlemlemek için. Kayıtlı motoneuron antidromik tanımlama, fonksiyonel olarak tanımlanmış sinirlerin uyarılmasıdayalı (yani, fleksörveya ekstansörler efferents sağlayan sinirler) bize ekselvaya motor birimlerinin türlerini belirlemenize olanak sağlar (hızlı karşı yavaş), polarizasyon farklı olgun spinal nöronal sistemin bireysel unsurları etkiler olup olmadığını test etmek için bir fırsat verir. Kayıt tan önce kapsamlı bir ameliyat ve kayıtların stabilite ve güvenilirlik yüksek gereksinimleri nedeniyle, bu teknik son derece zor ama bir motoneuron elektrofizyolojik özellikleridoğrudan ve uzun vadeli değerlendirilmesi sağlar: önce, sırasında ve tsDCS uygulamadan sonra, hangi akut eylemleri ve kalıcı etkileri belirlemek için çok önemlidir¹³. Bir motoneuron doğrudan ekstrafusal kas lifleri aktive olarak¹⁴ ve bir kas kasılması geribildirim kontrolünde yer alır ve geliştirilen kuvvet^15,16 motor ünitesi veya kas kontraktil özellikleri üzerinde tsDCS herhangi bir gözlenen etkisi motoneuron uyarılabilirlik veya ateş özellikleri modülasyonları ile bağlantılı olabilir.

Protokol

Bu protokole bağlı tüm prosedürler ilgili makamlar (örneğin, Yerel Etik Komitesi) tarafından kabul edilmiş ve hayvan refahı ve yönetimi ile ilgili ulusal ve uluslararası kurallara uyulması.

NOT: Prosedüre katılan her katılımcının temel cerrahi işlemler konusunda doğru şekilde eğitilmesi ve hayvan deneyleri yapmak için geçerli bir lisansa sahip olması gerekir.

1. Anestezi ve premedication

1. Sodyum pentobarbital intraperitoneal enjeksiyonları ile bir sıçan anestezik (6 aylık erkek Wistar sıçanlar için başlangıç dozu 60 mg·kg^-1 400\u2012550g).
   NOT: Bu protokol belirtilen suşu, cinsiyeti veya sıçan yaşı ile sınırlı değildir. Ayrıca, ketamin-ksilazin karışımı, alfa-kloralose veya fentanil+midazolam+medetomidin gibi alternatif anestezi, farklı araştırma hedefleri için daha uygun sayılsa veya etik kurul tarafından gerekli olduğunda kullanılabilir.
2. Yaklaşık 5 dakika sonra, künt forceps ile sıçan arka ekstremite parmak çimdikleme tarafından anestezi derinliğini kontrol edin. Yalnızca refleks eylemi gözlenmediğinde protokolün sonraki adımlarını uygulayın.
3. Entübasyon sonrası mukus üretimini azaltmak için 0.05 mL atropin ienjekte edin.
4. %4 glukoz çözeltisi içeren 5 mL fosfat tamponu enjekte etmek, NaHCO₃ (%1) ve jelatin (%14). Bu tampon bir deney boyunca kutanöz damarlar tarafından emilir ve sıvı dengesini korumaya yardımcı olacaktır.
5. Ameliyat boyunca, periyodik olarak refleks eylemleri için hayvan kontrol edin ve gerekirse anestezi takviyesi (10 mg·kg^-1·h^-1sodyum pentobarbital).

2. Cerrahi

1. Sol arka ekstremitenin sırt kısmı üzerinde kürk tıraş ederek cerrahi tedavi için hayvan hazırlayın, kalça ayak bileği, arka, kuyruk yüksek torasik segmentleri için, göğüs sol tarafında, ve sternum üzerinde boyun bölgesinin ventral tarafı
2. İntravenöz hattın yerleştirilmesi
   1. Fareyi kapalı halkalı bir ısıtma yastığına sırtına yerleştirin (ve ekstremite fiksasyonlarıyla sabitle).
   2. 21 bıçak kullanarak, göğüs kafesinden çeneye kadar deriyi boylamsal bir şekilde kesin.
   3. Pratisyen hekimler ile deri tutun ve altta yatan doku dan ayırın.
   4. Künt diseksiyon teknikleri kullanarak sağ juguler ven ortaya çıkarmak. Dikkatlice çevre dokulardan damar incelemek.
   5. Dallanma noktaları olmadan ven parçası bulmak, altında iki 4-0 ligatures kayma.
   6. Ven daha önce tanımlanmış olmayan dallanma segmentinin proksimal ucunda bir gevşek düğüm ve ven bu segmentin distal ucunda bir gevşek düğüm olun. Kalbe damar proksimal kelepçe, ve sonra ven distal kısmını ligate.
   7. Iris makas kullanarak, kelepçe ve uzak ligature arasında bir kesi yapmak. Ven bir flep tutun ve kelepçe tarafından bloke noktaya önceden doldurulmuş bir kateter tanıtmak.
   8. Ven ve kateteri forceps ile birlikte tutarken, kelepçeyi çıkarın ve kateteri birkaç milimetre lik bir damara doğru itin. Kateterin her iki ucunu da damara sabitle ve cilde ek bir sabitleme noktası ekleyin.
3. Trakeal tüpün tanıtımı
   1. Künt forceps kullanarak sternohyoid kasları kapsayan iki mandibular bezleri ayırın. Trakeayı ortaya çıkarmak için orta hattasternohioid kasları ayırın.
   2. Nefes borusu altında üç 4-0 ligatürler slip, sonra trakeal tüp ekleme noktası altında iki düğüm yapmak ve yukarıda bir düğüm.
   3. Gırtlak krikoid kıkırdak bulmak ve üçüncü trakeal kıkırdak altında bir kesi yapmak.
   4. Trakeaaşağı bir trakeal tüp yerleştirin ve önceden hazırlanmış ligatürler ile yerine tüp güvenli, sonra cilde ek bir ligatür ekleyin.
   5. Ayrılmış kasların üzerine küçük bir pamuk parçası yerleştirin ve cildi işletilen alanın üzerine dikin.
4. Arka ekstremite sinirlerinin diseksiyonu
   1. 21 bıçak kullanarak, sol arka ekstremitenin arka tarafında uzunlamasına bir kesik yapın, Aşil tendonundan kalçaya kadar.
   2. Forseps ile deri kapmak, ve künt diseksiyon teknikleri kullanarak kesi her iki tarafında altta yatan kaslardan cildi ayırmak.
   3. Diz ekleminin arkasında popliteal fossa bulun, hangi pazı femoris kas ile kaplıdır, ve makas kullanarak bu kas ın ön ve arka kısmı arasında bir kesim yapmak.
   4. Yukarı doğru hareket siyatik sinir ortaya çıkarmak için kalça ya da iki baş pazı femoris tüm yol kesti. Kanamayı önlemek için gerektiği gibi cauterize.
   5. Siyatik sinirin sural, tibial ve yaygın peroneal dalları tanımlayın.
   6. Makas kullanarak, tibial sinir ve dalları ortaya çıkarmak için gastroknemius kas Medial başkanı lateral ayırın.
   7. 55 forceps kullanarak sural sinirdistal ucunu kapmak, distal kesip ve mümkün olduğunca incelemek.
   8. Ortak peroneal sinir ile prosedürü tekrarlayın.
   9. Künt bir cam çubuk kullanarak kaval siniri çevre dokulardan ayırın, kan damarlarına zarar vermemeye özen, ve distal kesti.
   10. Medial gastroknemius (MG) ve lateral gastroknemius ve soleus (LGS) sinirleri tanımlayın.
   11. 55 forceps kullanarak, dikkatle MG ve LGS sinirleri incelemek, çevre dokulardan onları keserek, ama ilgili kaslarla bağlantılarını korumak.
   12. Maruz kalan sinirlerin altına tuzlu batırılmış bir pamuk parçası yerleştirin.
   13. Cildi işletilen alanın üzerinde kapatın.
5. Laminektomi
   1. 21 bıçak kullanarak sakrum dan torasik vertebra kadar uzunlamasına bir kesi yapmak.
   2. Altta yatan kaslardan cildi ayırın.
   3. Torasik ve lomber spinous süreçlerin her iki tarafında longissimus kas kesin.
   4. Künt kenarlı neşter kullanarak her vertebra enine süreçleri ortaya çıkarmak için omurilik kasları geri çekmek.
   5. Künt uç makası kullanarak maruz spinal kolon boyunca enine süreçlere bağlı kasların tendonu kesti. Gerekirse hemostatik ajanlar uygulayın.
   6. Kaburga takılması ile en düşük torasik segment olarak Th13 vertebra tanımlayın ve ince rongeurs kullanarak spinous süreçleri kaldırmak ve Omuriliğin lomber segmentleri ortaya çıkarmak için Th13 L2 vertebra. Omurga stabilizasyonu için bir fiksasyon noktası olarak kullanılacak L3 spinous süreci zarar vermemeyi unutmayın.
   7. Th12 spinous işlemini çıkarın ve vertebra sırt yüzeyini mümkün olduğunca pürüzsüz leştirin.
   8. Künt diseksiyon teknikleri kullanarak tutucu ekleme noktaları oluşturmak için Th11 vertebra kasları ayırın.
   9. Maruz kalan omurilik segmentleri üzerinde ince tuzlu batırılmış pamuk yerleştirin.
   10. Fareyi, omurgayı desteklemek ve stabilize etmek için iki paralel çubuk ve kelepçeli iki ayarlanabilir kolla özel yapılmış metal çerçeveye taşıyın.

3. Kayıt ve uyarılma için hazırlık

1. Vertebral kolon fiksasyonu ve sinir düzeni
   1. 37 ± 1 ° C hayvan vücut sıcaklığını korumak için kapalı döngü ısıtma sistemine bağlı bir ısıtma yastığı üzerinde özel yapım çerçeve içinde sıçan yerleştirin.
   2. EKG elektrotlarını derinin altına yerleştirin ve kalp atış hızı takibi için bir amplifikatöre bağlanın.
   3. Deri flepleri kullanarak, maruz kalan omurilik üzerinde derin bir havuz oluşturur.
   4. Metal kelepçeler kullanarak, Th12 enine proseslerin altına ve L3 spinous prosese kelepçeler koyarak vertebral kolon düzeltmek.
   5. Vertebral kolon güvenli ve yatay olarak düzenlenmiş olduğundan emin olun, ve sonra kasları geri çekmek için sütunun her iki tarafına dorso-ventral basınç uygulayın.
   6. Havuzu Sıcak (37 °C) mineral yağ ile doldurun ve bu sıcaklıkta muhafaza edin.
   7. İplik aşil tendonu ile 4-0 ligature, asansör ve ayak bileği kalça ile tesviye böylece işletilen sol arka ekstremite germek.
   8. Deri kapakları kullanarak maruz kaval üzerinde derin bir havuz yapmak, MG ve LGS sinirler.
   9. Havuzu sıcak (37 °C) mineral yağ ile doldurun.
   10. MG ve LGS sinirlerini bipolar gümüş telli uyarıcı elektrotlara yerleştirin ve kare darbe uyarıcısına bağlayın. Her sinir için ayrı stimülasyon kanalları kullanın.
2. Yüzey elektrot yerleşimi
   1. Arka kaslara yerleştirilen referans elektrotla açık omuriliğin sol kaudal tarafına gümüş bir top elektrot yerleştirin ve her iki elektrotu da diferansiyel DC amplifikatöre bağlayın. Yüzey topu elektrot sinirlerden afferent vole kaydetmek için kullanılacaktır.
   2. Sabit akım uyarıcı kullanarak, 0.1 ms süresi kare darbeler ile MG ve LGS sinirleri uyarmak, 3 Hz bir frekansta tekrarlanan, ve afferent volegözlem.
   3. Sinir aktivasyonu için eşiğin (T) belirlenmesi, her siniri yaklaşık 3· T yoğunluğu ve her sinir için afferent vole rekor genliği.
   4. Yüzey elektrot rostral taşıyın ve vole genlikleri her sinir için en yüksek olduğu spinal segmentleri belirlemek için prosedürü tekrarlayın. Maksimum vole yerini belirledikten sonra, yüzey elektrodu omurilikten güvenli bir mesafeye taşıyın.
3. Kas felci ve solunum hareketlerini azaltmak için bir pnömotoraks oluşturan
   1. Bir nöromüsküler bloker ile intravenöz sıçan felç ve bir kemirgen uyumlu kapnometre doğrultusunda bir dış ventilatör trakeal tüp bağlayın (Pankuronyum bromür, bir başlangıç dozu 0.4 mg·kg^-1, 0.2 mg·kg dozlarda her 30 dakika takviye^-1)
   2. Son gelgit CO₂ konsantrasyonu izlemek ve havalandırma parametreleri (frekans, hava basıncı ve akış hacimleri) ayarlayarak yaklaşık 3\u20124% olarak korumak.
   3. Kaydın bir tarafında 5 ve 6 kaburga arasında deride uzunlamasına bir kesi yapın.
   4. Künt uç makası kullanarak kaburgalar arasında interkostal boşluk görselleştirmek için örten kasları kesti.
   5. Küçük keskin makas kullanarak, interkostal kaslarda ve plevra küçük bir kesi yapmak, sonra açılış içine künt bir kenar forceps bir ucu eklemek, akciğerlere basın dikkat.
   6. Pnömotoraks'ı deney boyunca açık tutmak için forceps'lerin küçük bir tüpü genişletmesine veya takmasına izin verin.
   7. Nöromüsküler blok sonra, EKG sıklığını kontrol ederek anestezi derinliğini izlemek, ve kalp hızı aşarsa anestezik ajan tamam 400 bpm. Kas felci ve solunum hareketlerini azaltmak için bir pnömotoraks oluşturan, hangi kayıt istikrarı nı artıracak
4. Dura ve pia mater açılması
   1. #55 forseps kullanarak, yavaşça dura mater kaldırın ve L5 segmentinden caudally kesilmiş, L4 segmentine kadar rostrally.
   2. Ultra ince 5SF forceps bir çift kullanarak dorsal sütun kapsayan pia küçük bir yama yapmak, kan damarları arasında, MG veya LGS sinir maksimum afferent vole düzeyinde tam olarak.
   3. Gerekirse kanamayı engellemek için tuzlu ve kurutulmuş jel köpük küçük parçalar kullanın.
5. tsDCS elektrot yerleştirme
   1. L4-L5 spinal segmentlerin konumuna karşılık gelen rostro-kaudal düzeyde bir sıçan karın ventral tarafında deride küçük bir kesi olun.
   2. Bir referans elektrot olarak hizmet verecek bir metal klip ile maruz cilt kapağı kapmak.
   3. Th12 omurunun sırt tarafına tuzlu bir sünger yerleştirin. Sünger boyutunun aktif bir tsDCS elektroduna (5 mm çapında daire şeklinde paslanmaz çelik plaka) eşit olduğundan emin olun.
   4. İnce bir manipülatör kullanarak, süngeri aktif bir tsDCS elektrotla kemiğe bastırın ve elektrotun tüm yüzeyine eşit şekilde basıldığından emin olun.
   5. Hem referans ı hem de aktif tsDCS elektrotlarını sürekli doğru akım akışı sağlayabilen sabit akımlı bir uyarıcı ünitesine bağlayın.
6. Mikropipetlerin hazırlanması
   1. Bir mikroelektrot çekmecekullanarak, bir mikroelektrot hazırlayın.
      NOT: Hem filament hem de filament olmayan elektrotlar kullanılabilir, ancak, elektrot un sapı iniş sırasında omurilik sıkıştırmak için yeterince ince iken ventral boynuz ulaşmak için yeterince uzun olması gerektiğini unutmayın.
      1. Çekmece ayarını, omuriliğe giren sapın yaklaşık 3 mm uzunluğunda, elektrotun ucu çapı 1\u20122 μm'den fazla olmayacak, mikroelektrot direnci ise 10 ile 20 MΩ arasında olacak şekilde ayarlayın.
   2. Mikroelektrotları 2M potasyum sitrat elektroliti ile doldurun.
   3. Hazırlanan mikroelektrotı mikromanipülatöre monte edin ve 1\u20122 μm adımlama hareketi ve stereotaksik kalibrasyon sağlar.
   4. Mikro elektromu arka kaslara yerleştirilen referans elektrotla hücre içi amplifikatöre bağlayın.
7. Nöromüsküler blok sonra, EKG sıklığını kontrol ederek anestezi derinliğini izlemek, ve sıçan kalp hızı aşmaması için anestezik ajan tamamlamak 400 bpm.

4. Motoneuron izleme ve penetrasyon

1. Afferent vole kayıt elektrodu geri omurilik sırt yüzeyine yerleştirin, caudally kayıt alanının konumuna, L6 segmenti düzeyinde.
2. Seçilen bir sinir içinde alfa-motoneurons tüm aksonları etkinleştirmek için, 3 Hz ve 3T yoğunluğu bir frekansta elektrik 0.1 ms darbeleri ile MG ve LGS sinirleri teşvik.
3. Mikropipeti pia'da 15\u201220° medio-lateral açıyla (yanal olarak yönlendirilmiş bir uçla) seçili bir yama halinde sürükleyin.
4. Yüzeyin altına indikten sonra, mikroelektrot kalibre ve kapasitans ve voltaj ofset telafi, ve tüm parametreler kararlı olduğunda omurilik penetrasyon devam. Motonöron havuzunun antidromik alan potansiyeli, ilgili sinirin uyarılması sırasında özel bir motor çekirdeğine yaklaşırken mikroelektrot gerilim izlerine görünür olacaktır.
5. 1\u20122 μm adımda mikroelektrot ile delinmeye devam edin ve elektrot ucunu herhangi bir kalıntıdan temizlemek için hücre içi amplifikatörün vızıltı fonksiyonunu periyodik olarak kullanın.
6. Kaydedilen voltaj iz ve bir antidromik başak potansiyeli görünümünü ani hiperpolarizasyon ile karakterize olacak motoneuron penetrasyon gözlemleyin.

5. Motonöron membranının ve ateşleme özelliklerinin kaydedilmesi

1. Hücre içi amplifikatör bir köprü modunda, ilgili sinir dalları uyararak antidromik eylem potansiyelinin "all-or-nothing" görünümünü temelinde motoneuron tanımlayın. Daha sonraki ortalamalar için sonraki 20 izlemeyi kaydedin.
2. Yüksek kaliteli veri sağlamak için katı bir dahil etme kriteri uygulayın: genlikte en az -50 mV'lik dinlenme membranı potansiyeli; pozitif bir overshoot ile, 50 mV'den büyük eylem potansiyeli genlikleri; kayıttan önce en az 5 dk membran potansiyel stabildir.
3. Hücre içi amplifikatörün kesintisiz akım kelepçe modunda (akım anahtar hızı modu 4-8 kHz), 0,5 ms hücre içi depolarize akım darbeleri kullanarak bir motoneuron bir orthodromic eylem potansiyeli uyandırmak. Çevrimdışı ortalama için en az 20 kez tekrarlayın.
4. Hücre giriş direncini hesaplamak için 40 kısa darbe (100 ms) hiperpolarize akım (1 nA) ile bir motoneuron teşvik.
5. Tek bir başak ortaya çıkarmak için gerekli depolarize akımın minimum genliği olarak reobase değerini belirlemek için artan genlikleri 50 ms kare dalga darbeleri ile bir motoneuron teşvik.
6. Motoneuronların ritmik deşarjlarını uyandırmak için 0,1-2 nA'lık basamaklarda genlikleri artırarak depolarize akımın 500 ms kare dalga darbelerini enjekte edin.

6. Trans-spinal doğru akım stimülasyonu (tsDCS)

1. Motoneuron kararlı bir penetrasyon korurken, doğru akım trans-spinal uygulama ile polarizasyon prosedürü başlatmak. Geçerli yoğunluğu nu ve uygulama süresini deney tasarımına ayarlayın (örn. 15 dakika için 0,1 mA).
2. DC'yi geçtikten hemen sonra motonöron membran potansiyelini gözlemleyin. Anodal polarizasyon (anodu olarak aktif elektrot) membran potansiyelinin depolarizasyonuna neden olurken, katot polarizasyonu (katot olarak aktif elektrot) ters etki uyandırmalıdır. DC stimülasyonuna yanıt olarak istirahat membranı potansiyelindeki bir değişikliğin sabit olup olmadığını gözlemleyin, bu da elektriksel alan yoğunluğunun etkilenmemesini sağlar.
3. Sürekli akım uygulaması sırasında 5 dk aralıklarla 5.3\u20125.6 adımlarını tekrarlayın.
4. DC'yi kapatın ve kayıtlar kararsız hale gelene veya ekleme ölçütleri tehlikeye atAna kadar 5.3\u20125.6 adımlarını 5 dakika aralıklarla tekraretmeye devam edin.
5. Deneyi sonlandırın ve öldürücü dozda pentobarbital sodyum (180 mg·kg^-1)intravenöz uygulama kullanarak hayvanı ötenaziye edin.

Sonuçlar

Etki potansiyellerinin parametreleri ve çeşitli membran özellikleri, hücre penetrasyonunun istikrarlı koşulları sağlandığında hücre içi kayıtlar temelinde hesaplanabilir. Şekil 1A, hücre içi stimülasyonun uyardığı tipik bir ortopedik etki potansiyeli sunar ve bu da veri dahil etme için tüm kriterleri karşılar (en az -50 mV'lik istirahat membran potansiyeli ve 50 mV'den yüksek olan ani genlik, pozitif bir overshoot ile). Ani genlik, hiperpolarizasyon genliği veya hi...

Tartışmalar

Doğru yapılırsa, tanımlanan protokolün cerrahi kısmı yaklaşık üç saat içinde tamamlanmalıdır. Ameliyat sırasında bir hayvanın stabil fizyolojik durumunun korunmasına özellikle vücut ısısı ve anestezi derinliği ne kadar özen li olmak gerekir. Bariz etik hususlarDışında, uygun anestezi eksikliği sinir diseksiyonu veya laminektomi sırasında aşırı ekstremite hareketlerine neden olabilir ve hazırlık veya erken deney sonlandırma hasara yol açabilir. Bir hayvanı mikroelektrotla omuriliğe ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Durgs and solutions	-	-	-
Atropinum sulfuricum	Polfa Warszawa	-	-
Glucose	Merck	346351	-
NaHCO3	Merck	106329	-
Pancuronium Jelfa	PharmaSwiss/Valeant	-	Neuromuscular blocker
Pentobarbital sodium	Biowet Pu?awy Sp. z o.o	-	Main anesthetic agent
Pottasium citrate	Chempur	6100-05-06	-
Tetraspan	Braun	-	HES solution
Surgical equipment	-	-	-
21 Blade	FST	10021-00	Scalpel blade
Cauterizer	FST	18010-00	-
Chest Tubes	Mila	CT1215	-
Dumont #4 Forceps	FST	11241-30	Muscle forceps
Dumont #5 Forceps	FST	11254-20	Dura forceps
Dumont #5F Forceps	FST	11255-20	Nerve forceps
Dumont #5SF Forceps	FST	11252-00	Pia forceps
Forceps	FST	11008-13	Blunt forceps
Forceps	FST	11053-10	Skin forceps
Hemostat	FST	13013-14	-
Rongeur	FST	16021-14	For laminectomy
Scissors	FST	15000-08	Vein scissors
Scissors	FST	15002-08	Dura scissors
Scissors	FST	14184-09	For trachea cut
Scissors	FST	104075-11	Muscle scissors
Scissors	FST	14002-13	Skin scissors
Tracheal tube	-	-	Custom made
Vein catheter	Vygon	1261.201	-
Vessel cannulation forceps	FST	18403-11	-
Vessel clamp	FST	18320-11	For vein clamping
Vessel Dilating Probe	FST	10160-13	For vein dissection
Sugrgical materials	-	-	-
Gel foam	Pfizer	GTIN 00300090315085	Hemostatic agent
Silk suture 4.0	FST	18020-40	-
Silk suture 6.0	FST	18020-60	-
Equipment	-	-	-
Axoclamp 2B	Molecular devices	discontinued	Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A
CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor	CWE	11-10000	Gas analyzer
Grass S-88	A-M Systems	discontinued	Constant current stimulator
Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe	Harvard Apparatus	507222F	Heating system
ISO-DAM8A	WPI	74020	Extracellular amplifier
Microdrive	-	-	Custom made/replacement IVM/Scientifica
P-1000 Microelectrode puller	Sutter Instruments	P-1000	Microelectrode puller
SAR-830/AP Small Animal Ventilator	CWE	12-02100	Respirator
Support frame	-	-	Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting
Spinal clamps	-	-	Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting
TP-1 DC stimulator	WiNUE	-	tsDCS stimulator
Miscellaneous	-	-	-
1B150-4 glass capillaries	WPI	1B150-4	For microelectrodes production
Cotton wool	-	-	-
flexible tubing	-	-	For respirator and CO2 analyzer connection
MicroFil	WPI	MF28G67-5	For filling micropipettes
Silver wire	-	-	For nerve electrodes