生体内でのトランス脊髄直流刺激時の型同定されたラット脊髄モネニューロンの細胞内記録

要約

このプロトコルは、同時のトランス脊髄直流刺激を用いたラット腰椎モトニューロンの生体内細胞内記録について説明する。この方法により、膜の特性を測定し、脊髄のアノーダルまたは陰極分極化の前後にモトニューロンのリズミカルな発火を記録することができます。

要約

生体内の脊髄モトニューロンの細胞内記録は、無傷の脊髄ネットワークにおける細胞の電気生理学的特徴を決定するための「ゴールドスタンダード」を提供し、古典的なインビトロまたは細胞外記録技術に対して有意な利点を有する。生体内細胞内記録の利点は、完全に成熟した神経系を持つ成体動物に対してこの方法を行うことができることであり、したがって、多くの観察された生理学的メカニズムを実用的なアプリケーションに翻訳することができる。この方法論的論文では、この手順を、脊髄神経ネットワーク内で起こる偏光プロセスを模倣する外部応用定電流刺激と組み合わせて説明する。トランス脊髄直流刺激(tsDCS)は、様々な神経学的傷害の後のリハビリテーションにおける神経調節的介入として、またスポーツにおいてますます使用される革新的な方法である。tsDCSが神経系に及ぼす影響は未だに解明されておらず、その作用の背後にある生理学的メカニズムはほとんど知られていない。tsDCSを細胞内記録と同時に応用することで、脊髄神経回路網の分極化に応じて、モトニューロン膜の性質やリズミカルな発火の特性の変化を直接観察することができ、tsDCSの作用を理解するために重要です。さらに、提示されたプロトコルに、内在筋とその機能(屈筋対伸長器)に関するモトニューロンの同定と生理学的タイプ(速い対低速)が含まれる場合、分極によって異なる影響を受けると思われる脊髄回路の同定された成分に対するtsDCSの影響を選択的に調査する機会を提供する。提示された手順は、細胞内の記録のための外科的調製と、結果の調製の安定性と再現性を達成するために必要なステップに重点を置いて刺激に焦点を当てています。アノーダルまたは陰極tsDCSアプリケーションの方法論の詳細は、実用的かつ安全上の問題に注意を払いながら議論される。

概要

トランス脊髄直流刺激(tsDCS)は、健康と疾患^,1、2、32における脊髄回路興奮性を修飾する¹強力な方法として認識を得ている。³この技術では、選択した脊髄セグメントの上に位置する活性電極の間に一定の電流が渡され、参照電極は腹側またはより多くのロストレル⁴に位置する。いくつかの研究は、tsDCSが神経因性疼痛^5、痙攣^性6、脊髄損傷^7、またはリハビリテーションを促進するために、特定の病的状態の管理に使用できることを既に確認^している。研究者は、tsDCSが細胞膜を横切る細胞内および細胞外空間との間のイオン分布の変化を誘発することを示唆しており、これは現在の向き^{9、10、1110,}に⁹応じて神経活動を促進または阻害することができる。¹¹しかし、最近まで、モトニューロンに対するこの影響の直接的な確認は欠けていた。

ここでは、ニューロン脊髄ネットワークのアノダルまたは陰極偏光に応答してモトニューロン膜および発火特性の変化を観察するために、麻酔付きラットの腰椎脊髄モトニューロンからの電気電位の記録を生体内で行う詳細なプロトコルについて説明する。細胞内記録は、ニューロンの特性の調査のいくつかの領域を開き、以前に使用された細胞外技術^99、1212のために利用できない。例えば、tsDCSによって誘導される直接電流流れに対するモトニューロン膜電圧応答を正確に測定し、スパイク発生の電圧閾値を示したり、アクション電位パラメータを解析したりすることができる。また、この技術により、入力抵抗などのモトニューロン受動膜特性を判断し、細胞内刺激電流とモトニューロンのリズミカルな発火頻度との関係を観察することができます。記録されたモトニューロンの抗ドロミック同定は、機能的に同定された神経(すなわち、屈筋または伸長器にエフェレントを提供する神経)の刺激に基づいて、さらに内在性運動ユニットの種類(速い対低速)を同定することを可能にし、分極が成熟した脊髄神経系の個々の要素に異なる影響を与えるかどうかをテストする機会を与える。記録の安定性と信頼性に関する記録および高い要件に先行する広範な手術のために、この技術は非常に困難であるが、1つのモトニューロンの電気生理学的特性の直接的かつ長期的な評価を可能にする:tsDCSの適用前、適用中および適用後、その急性作用および持続効果の両方を決定するために重要である^13。モトニューロンが直接筋筋線維¹⁴を活性化し、筋収縮および発達力¹⁵のフィードバック制御に関与するように^、16は運動部または筋肉収縮特性に対するtsDCSの観察された影響は、モトニューロンの興奮性または発火特性の変調にリンクされ得る。^,

プロトコル

この議定書に関連するすべての手続きは、適切な当局(例えば、地域倫理委員会)によって受け入れられ、動物の福祉と管理に関する国内および国際的な規則に従っています。

注:手順に関与する各参加者は、基本的な外科的処置で適切に訓練され、動物実験を行うための有効なライセンスを持っている必要があります。

1. 麻酔と前投薬

1. ペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射でラットを麻酔する(体重400\u2012550gの6ヶ月齢のオスのウィスターラットの初期用量は60^mg·kg-1)。
   注:このプロトコルは、ラットの示された株、性別または年齢に限定されません。また、ケタミンキシラジンミックスなどの代替麻酔,α-クロラロースまたはフェンタニル+ミダゾラム+メデトミジンは、異なる研究目標に適している場合、または倫理委員会が要求する場合に使用することができます。
2. 約5分後、ラットの後肢のつま先を鈍い鉗子でつまんで麻酔の深さを確認します。反射アクションが見られない場合にのみ、プロトコルの次のステップを進めます。
3. 挿管後の粘液産生を減らすために、皮下に0.05 mLのアトロピンを注入する。
4. 4%グルコース溶液を含むリン酸緩衝液の皮下5mLを注入し、NaHCO3(1%)を含む₃ゼラチン(14%)と。このバッファーは、実験を通じて、皮の血管によって吸収され、流体のバランスを維持するのに役立ちます。
5. 手術を通して、定期的に動物に反射作用がないかをチェックし、必要に応じて麻酔を補う(ペントバルビタールナトリウムの10 mg·kg^-1·h-1)。

2. 手術

1. 左後肢の背部、足首から股関節、後部、尾から高胸部、胸部の左側、胸骨の上の頸部領域の腹側まで、左後肢の背部に毛皮を剃って外科治療のために動物を準備する
2. 静脈内線の配置
   1. ラットを閉じたループ加熱パッドの背面に置きます(そして、四肢の固定で固定します)。
   2. 21枚の刃を使用して、胸骨から顎に皮膚を縦切りします。
   3. 鉗子で皮膚を保持し、下の組織から分離します。
   4. 鈍い解剖技術を使用して右頸静脈を露出させる。周囲の組織から静脈を慎重に解剖する。
   5. 分岐点のない静脈の部分を見つけ、その下に2つの4-0合字を滑らせる。
   6. 以前に同定された静脈の非分岐セグメントの近位端に1つの緩い結び目を作り、静脈のこのセグメントの遠位端に1つの緩い結び目を作ります。心臓に近位静脈をクランプし、静脈の遠位部分をリゲートします。
   7. アイリスハサミを使用して、クランプと遠い合字の間に切開を行います。静脈のフラップを保持し、クランプによってブロックされているポイントに事前に充填されたカテーテルを導入します。
   8. 静脈とカテーテルを鉗子と一緒に保持しながら、クランプを取り外し、カテーテルを数ミリメートル静脈に押し込みます。カテーテルの両端を静脈に固定し、皮膚に追加の固定点を追加します。
3. 気管管の導入
   1. 鈍い鉗子を使用して、ステルノイド筋肉を覆う2つの下顎腺を分離する。気管を露出させるために、中線でステルノヒロイドの筋肉を分離します。
   2. 気管の下に3つの4-0合字を滑らせ、気管チューブ挿入点の下に2つのノットを作り、上に1ノットを作ります。
   3. 喉頭の口蓋軟骨を見つけ、3番目の気管軟骨の下に切開を行います。
   4. 気管チューブを気管の下に挿入し、あらかじめ準備された合字でチューブを所定の位置に固定し、皮膚に追加の合字を追加します。
   5. 分離した筋肉の上に小さなコットンウールを置き、手術した領域の上に皮膚を縫合します。
4. 後肢神経の解剖
   1. 21ブレードを使用して、左後肢の後部側、アキレス腱から股関節まで縦切りします。
   2. 鉗子で皮膚をつかみ、鈍い解剖技術を使用して、切開の両側の下の筋肉から皮膚を分離する。
   3. 上腕二頭筋で覆われている膝関節の後ろのポピタル窩を見つけ、はさみを使用してこの筋肉の前部と後部の間を切り取ります。
   4. 上に移動すると、上腕二頭筋の2つの頭を股関節まで切り取り、坐骨神経を露出させる。出血を防ぐために必要に応じて焼灼します。
   5. 坐骨神経の腹膜、脛骨および一般的な腹膜の枝を特定する。
   6. はさみを使用して、腸神経とその枝を露出させるために胃頭の内側頭から横方向を分離する。
   7. 55鉗子を使用して、スラル神経の遠位端をつかみ、遠位に切り、可能な限り解剖する。
   8. 一般的な腹膜神経で手順を繰り返します。
   9. 鈍いガラス棒を使用して、脛骨神経を周囲の組織から分離し、血管に損傷を与えないように注意し、遠回りに切断する。
   10. 内側胃腸(MG)と、横胃腸およびソレウス(LGS)神経を特定する。
   11. 55鉗子を使用して、MGとLGS神経を慎重に解剖し、周囲の組織から切り離すが、それぞれの筋肉との接続を維持する。
   12. 露出した神経の下に生理に浸した綿毛を置きます。
   13. 操作領域の上に皮膚を閉じます。
5. ラミネ切れ
   1. 21枚刃を使用して、仙骨から胸椎までの縦切開を行います。
   2. 根底にある筋肉から皮膚を分離します。
   3. 胸部および腰椎の棘の両側の長軸筋を切る。
   4. 鈍いエッジのメスを使用して、各椎骨の横方向のプロセスを露出させるために脊柱から筋肉を引き込みます。
   5. 鈍い先端のはさみを使用して、露出した脊柱に沿って横方向のプロセスに接続された筋肉の腱を切断する。必要に応じて止血剤を塗布します。
   6. 胸椎を最も低い胸部セグメントとして識別し、細かい回転器を使用すると、脊髄の腰部セグメントを露出させるためにTh13からL2椎骨までの棘プロセスとラミナエを除去します。脊椎安定化の固定点として使用されるL3棘プロセスを損傷しないように注意してください。
   7. Th12の棘のプロセスを取り除き、脊椎の裏面を可能な限り滑らかにします。
   8. 鈍い解剖技術を使用して、ホルダー挿入ポイントを作成するために、Th11椎骨から筋肉を分離します。
   9. 露出した脊髄セグメントの上に薄い生理液浸しのコットンウールを置きます。
   10. 2つの平行な棒と2つの調節可能な腕と2つの調節可能な腕が付いているカスタムメイドの金属フレームにラットを動かして、背骨を支え、安定させる。

3. 記録と刺激の準備

1. 椎骨カラム固定と神経配置
   1. ラットをカスタムメイドのフレームに加熱パッドに入れ、閉ループ加熱システムに接続して、動物の体温を37±1°Cに維持します。
   2. 皮膚の下に心電図電極を挿入し、心拍数の監視のためのアンプに接続します。
   3. 皮膚フラップを使用して、露出した脊髄の上に深いプールを形成する。
   4. 金属クランプを使用して、Th12横方向プロセスの下およびL3のスピンプロセスでクランプを置くことによって、椎骨柱を固定します。
   5. 椎骨柱が固定され、水平に配置されていることを確認し、その後、筋肉を引っ込めるために列の両側に背部腹側の圧力を適用します。
   6. プールに温かい(37°C)の鉱油を充填し、この温度で維持します。
   7. アキレス腱を通して4-0の合字を通し、足首が股関節で平準化されるように、操作された左後肢を持ち上げて伸ばします。
   8. 皮膚フラップを使用すると、露出した脛部、MGおよびLGS神経の上に深いプールを作る。
   9. プールに温かい(37°C)のミネラルオイルを入れます。
   10. MGとLGSの神経をバイポーラシルバーワイヤー刺激電極に配置し、正方形のパルス刺激装置に接続します。各神経に対して別々の刺激チャネルを使用します。
2. 表面電極配置
   1. 露出した脊髄の左側の帯側に銀色のボール電極を配置し、後ろの筋肉に参照電極を挿入し、両方の電極を差動DCアンプに接続します。表面ボール電極は、神経からの発泡ボレーを記録するために使用されます。
   2. 定電流刺激器を使用して、0.1 msの秒間隔の正方形のパルスでMGとLGS神経を刺激し、3Hzの周波数で繰り返し、そして、アフェレントなボレーを観察する。
   3. 神経活性化の閾値(T)を決定し、各神経を約3・2002で刺激するT強度、および各神経のためのアフェレントボレーの振幅を記録する。
   4. 表面電極のrostralを動かし、各神経のバレーの振幅が最も高い脊髄セグメントを識別する手順を繰り返します。最大ボレー位置を決定した後、表面電極を脊髄から安全な距離に移動します。
3. 呼吸運動を軽減するために、筋肉麻痺と気胸を形成する
   1. ラットを神経筋遮断薬で静脈内に麻痺させ、げっ歯類適合性のカプノメーターに沿って気管チューブを外部人工呼吸器に接続する(臭化パンクロニウム、初期用量0.4^mg·kg-1で、0.2 mg·kg-1の用量で30分ごとに補う)^-1
   2. 終潮_CO2 濃度を監視し、換気パラメータ(周波数、空気圧、流量)を調整することで、約3\u20124%で維持します。
   3. 録音の側面にある5番目と6番目の肋骨の間の皮膚に縦切開を行います。
   4. 鈍い先端のはさみを使用して、肋骨間の肋間空間を視覚化するために上の筋肉をカットします。
   5. 小さな鋭いはさみを使用して、肋間筋と胸膜に小さな切開を行い、その後、肺を押さないように注意して、鈍いエッジ鉗子の先端を開口部に挿入します。
   6. 鉗子が実験を通して気胸を開いたままにするために小さい管を伸びるか、または挿入することを許可する。
   7. 神経筋ブロック後、心電図周波数を確認して麻酔深度を監視し、心拍数が400bpmを超える場合は麻酔剤を補う。筋肉麻痺と気胸を形成して呼吸の動きを減らし、記録安定性を向上させる
4. デュラとピアマーターを開く
   1. #55鉗子を使用して、硬膜をそっと持ち上げ、L5セグメントからL4セグメントまでロストラリーにカットします。
   2. 超薄型5SF鉗子のペアを使用すると、MGまたはLGS神経からの最大アフェレントボレーのレベルで、血管間の、後列を覆うピアに小さなパッチを作ります。
   3. 必要に応じて出血をブロックするために生理焼け入れと乾燥ゲルフォームの小片を使用してください。
5. tsDCS電極配置
   1. L4-L5脊髄セグメントの位置に対応するロストロ・コーダルレベルで、ラット腹部の腹側の皮膚に小さな切開を行います。
   2. 参照電極として機能する金属クリップで露出した皮膚フラップをつかみます。
   3. Th12椎骨の裏側に生理焼けしたスポンジを置きます。スポンジのサイズがアクティブtsDCS電極(直径5mmの円形のステンレス鋼板)のサイズと等しいことを確認してください。
   4. 細かいマニピュレータを使用して、アクティブなtsDCS電極を使用してスポンジを骨に押し付け、電極の表面全体が等しく押されていることを確認します。
   5. 参照およびアクティブtsDCS電極を一定電流刺激装置ユニットに接続し、連続的な直流流を供給することができます。
6. マイクロピペットの調製
   1. マイクロ電極プーラーを使用して、マイクロ電極を準備する。
      注:フィラメント電極と非フィラメント電極の両方を使用できますが、電極のシャンクは、下降中に脊髄を圧縮しないように十分な薄さである一方で、腹側ホーンに到達するのに十分な長さでなければならないことを覚えておいてください。
      1. 脊髄に入るシャンクが約3mm長く、電極の先端が直径1\u2012 μm以下で、微小電極抵抗が10~20MΩになるように、引き手の設定を調整します。
   2. 2Mのカリウムクエン酸電解質でマイクロ電極を充填します。
   3. 1\u20122 μmのステップ移動と立体キャリブレーションを可能にするマイクロマニピュレータに準備されたマイクロ電極を取り付ける。
   4. マイクロ電極を細胞内アンプに接続し、後ろの筋肉に配置された参照電極を使用します。
7. 神経筋ブロック後、ECG周波数をチェックして麻酔深度を監視し、ラットの心拍数が400bpmを超えないように麻酔剤を補う。

4. モトニューロンの追跡と浸透

1. アフェレント・ボレー記録電極を脊髄の背部表面に戻し、記録部位の位置まで、L6セグメントのレベルに置く。
2. 3 Hzの周波数で0.1 msの電気パルスと3T強度でMGとLGS神経を刺激し、選択した神経内のα-モトニューロンのすべての軸索を活性化します。
3. マイクロピペットを15\u201220°のメロディー角でPIA内の選択したパッチに駆動します(先端が横方向に向けられています)。
4. 表面下に降下した後、マイクロ電極を較正し、そのキャパシタンスと電圧オフセットを補償し、すべてのパラメータが安定している場合は脊髄の浸透を継続します。モトニューロンプールの抗ドロミック場電位は、それぞれの神経の刺激中に専用の運動核に近づくと、マイクロ電極電圧トレースで見える。
5. 1\u20122 μmステップでマイクロ電極を貫通し、細胞内アンプのバズ機能を定期的に使用して、任意の残留物から電極先端をクリアします。
6. 記録された電圧トレースの突然の超分極化とアンチドロミックスパイク電位の出現によって特徴づけられるモトニューロンの浸透を観察する。

5. モトニューロン膜と焼成特性の記録

1. 細胞内増幅器のブリッジモードでは、それぞれの神経枝を刺激することによって、抗ドロミック作用の可能性の「オールまたはナッシング」の出現に基づいてモトニューロンを同定する。後で平均化するために、20 の後続トレースを記録します。
2. 厳密な包含基準を実施して、高い品質データを確保する:少なくとも-50 mVの可静時の膜電位を振幅で行う。50 mV を超えるアクション電位振幅、ポジティブオーバーシュート。記録前に少なくとも5分間安定した膜電位。
3. 細胞内増幅器の不連続電流クランプモード(電流スイッチレートモード4~8 kHz)では、0.5msの細胞内脱分極電流パルスを用いたニューロンの正交性アクションポテンシャルを呼び起こす。オフライン平均化のために、少なくとも 20 回繰り返します。
4. 細胞入力抵抗を計算するために、過分極電流(1nA)の40の短いパルス(100 ms)でモトニューロンを刺激します。
5. 振幅を増加させると50ミリ秒の方形波パルスでモトニューロンを刺激し、単一のスパイクを引き出すために必要な脱分極電流の最小振幅としてレオベース値を決定します。
6. モトニューロンのリズミカルな放電を呼び起こすために0.1-2 nAのステップで振幅を増加させると、脱分極電流の500 msの方角波パルスを注入します。

6. トランス脊髄直流刺激(tsDCS)

1. モトニューロンの安定した浸透を維持しながら、直流のトランス脊髄適用により分極化手順を開始する。現在の強度と適用時間を実験計画に合わせて調整します(例えば、15分間の0.1 mA)。
2. DCをオンにした直後に、モトニューロン膜電位を観察します。アノーダル偏光(陽極としての活性電極)は膜電位の脱分極をもたらす必要があり、カソーダル偏光(カソードとしての活性電極)は逆の効果を呼び起こすはずです。DC刺激に応答して安静膜電位の変化が一定であるかどうかを観察し、電界強度が影響を受けないようにします。
3. 現在の連続アプリケーションの間に、5 分間隔で手順 5.3\u20125.6 を繰り返します。
4. DC の電源を切り、記録が不安定になるか、または包含条件が危険になるまで、手順 5.3\u20125.6 を 5 分間隔で繰り返し続けます。
5. 実験を終了し、ペントバルビタールナトリウム(180mg·kg-1)の致死量の静脈内投与を使用して動物^-1を安楽死させる。

結果

細胞浸透の安定した条件が確保された場合、作用電位およびいくつかの膜特性のパラメータは、細胞内記録に基づいて計算することができる。 図1Aは 、細胞内刺激によって誘発される典型的な正交性作用電位を示し、データ包含のすべての基準(少なくとも-50 mVの静止膜電位、および50mVより高いスパイク振幅、陽性のオーバーシュート)を満たす。スパイク振幅、後偏波...

ディスカッション

正しく行われれば、記載されたプロトコルの外科部分は約3時間以内に完了するべきである。手術中の動物の安定した生理的状態、特に体温や麻酔の深さを維持する上で特に注意する必要があります。明らかな倫理的配慮とは別に、適切な麻酔の欠如は、神経解剖または解剖の間に過度の四肢の動きを引き起こし、準備または早期実験終了の損傷につながる可能性があります。脊髄を微小電極...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Durgs and solutions	-	-	-
Atropinum sulfuricum	Polfa Warszawa	-	-
Glucose	Merck	346351	-
NaHCO3	Merck	106329	-
Pancuronium Jelfa	PharmaSwiss/Valeant	-	Neuromuscular blocker
Pentobarbital sodium	Biowet Pu?awy Sp. z o.o	-	Main anesthetic agent
Pottasium citrate	Chempur	6100-05-06	-
Tetraspan	Braun	-	HES solution
Surgical equipment	-	-	-
21 Blade	FST	10021-00	Scalpel blade
Cauterizer	FST	18010-00	-
Chest Tubes	Mila	CT1215	-
Dumont #4 Forceps	FST	11241-30	Muscle forceps
Dumont #5 Forceps	FST	11254-20	Dura forceps
Dumont #5F Forceps	FST	11255-20	Nerve forceps
Dumont #5SF Forceps	FST	11252-00	Pia forceps
Forceps	FST	11008-13	Blunt forceps
Forceps	FST	11053-10	Skin forceps
Hemostat	FST	13013-14	-
Rongeur	FST	16021-14	For laminectomy
Scissors	FST	15000-08	Vein scissors
Scissors	FST	15002-08	Dura scissors
Scissors	FST	14184-09	For trachea cut
Scissors	FST	104075-11	Muscle scissors
Scissors	FST	14002-13	Skin scissors
Tracheal tube	-	-	Custom made
Vein catheter	Vygon	1261.201	-
Vessel cannulation forceps	FST	18403-11	-
Vessel clamp	FST	18320-11	For vein clamping
Vessel Dilating Probe	FST	10160-13	For vein dissection
Sugrgical materials	-	-	-
Gel foam	Pfizer	GTIN 00300090315085	Hemostatic agent
Silk suture 4.0	FST	18020-40	-
Silk suture 6.0	FST	18020-60	-
Equipment	-	-	-
Axoclamp 2B	Molecular devices	discontinued	Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A
CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor	CWE	11-10000	Gas analyzer
Grass S-88	A-M Systems	discontinued	Constant current stimulator
Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe	Harvard Apparatus	507222F	Heating system
ISO-DAM8A	WPI	74020	Extracellular amplifier
Microdrive	-	-	Custom made/replacement IVM/Scientifica
P-1000 Microelectrode puller	Sutter Instruments	P-1000	Microelectrode puller
SAR-830/AP Small Animal Ventilator	CWE	12-02100	Respirator
Support frame	-	-	Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting
Spinal clamps	-	-	Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting
TP-1 DC stimulator	WiNUE	-	tsDCS stimulator
Miscellaneous	-	-	-
1B150-4 glass capillaries	WPI	1B150-4	For microelectrodes production
Cotton wool	-	-	-
flexible tubing	-	-	For respirator and CO2 analyzer connection
MicroFil	WPI	MF28G67-5	For filling micropipettes
Silver wire	-	-	For nerve electrodes