In Vivo intrazelluläre Aufzeichnung von typidentifizierten Ratten-Spinal-Motoneuronen während der Trans-Spinal-Gleichstromstimulation

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die intrazelluläre In-vivo-Aufzeichnung von Rattenlenden-Motoneuronen mit gleichzeitiger transspinaler Gleichstromstimulation. Die Methode ermöglicht es uns, Membraneigenschaften zu messen und rhythmisches Abfeuern von Motoneuronen vor, während und nach der anodalen oder kathhodalen Polarisation des Rückenmarks aufzuzeichnen.

Zusammenfassung

Die intrazelluläre Aufzeichnung von Spinal-Motoneuronen in vivo bietet einen "Goldstandard" zur Bestimmung der elektrophysiologischen Eigenschaften der Zellen im intakten Wirbelsäulennetz und bietet erhebliche Vorteile gegenüber klassischen in vitro oder extrazellulären Aufzeichnungstechniken. Ein Vorteil von intrazellulären In-vivo-Aufnahmen ist, dass diese Methode an erwachsenen Tieren mit einem vollausgereiften Nervensystem durchgeführt werden kann, und daher können viele beobachtete physiologische Mechanismen in praktische Anwendungen übersetzt werden. In diesem methodischen Papier beschreiben wir dieses Verfahren in Kombination mit extern angewendeter konstanter Strömungsstimulation, die Polarisationsprozesse in spinalen neuronalen Netzwerken imitiert. Die transspinale Gleichstromstimulation (tsDCS) ist eine innovative Methode, die zunehmend als neuromodulatorische Intervention in der Rehabilitation nach verschiedenen neurologischen Verletzungen sowie im Sport eingesetzt wird. Der Einfluss von tsDCS auf das Nervensystem bleibt schlecht verstanden und die physiologischen Mechanismen hinter seinen Handlungen sind weitgehend unbekannt. Die gleichzeitige Anwendung des tsDCS mit intrazellulären Aufnahmen ermöglicht es uns, Veränderungen der Motoneuronmembraneigenschaften und Eigenschaften des rhythmischen Abfeuerns als Reaktion auf die Polarisation des spinalen neuronalen Netzwerks, die für das Verständnis von tsDCS-Aktionen entscheidend ist, direkt zu beobachten. Darüber hinaus bietet das vorgestellte Protokoll, wenn es die Identifizierung des Motoneurons in Bezug auf einen innervierten Muskel und seine Funktion (Flexor versus Extensor) sowie den physiologischen Typ (schnell versus langsam) umfasst, die Möglichkeit, den Einfluss von tsDCS auf identifizierte Komponenten der Wirbelsäulenschaltung, die von der Polarisation unterschiedlich beeinflusst zu sein scheinen, selektiv zu untersuchen. Das vorgestellte Verfahren konzentriert sich auf die chirurgische Vorbereitung auf intrazelluläre Aufnahmen und Stimulation mit Einem Schwerpunkt auf den Schritten, die notwendig sind, um Präparationsstabilität und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu erreichen. Die Einzelheiten der Methodik der anodalen oder kathhodalen tsDCS-Anwendung werden unter Berücksichtigung praktischer und sicherheitsgewisser informationen erörtert.

Einleitung

Transspinale Gleichstromstimulation (tsDCS) erhält Anerkennung als eine potente Methode zur Veränderung der Erregbarkeit des Spinalkreislaufs bei Gesundheit und Krankheit^1,2,3. Bei dieser Technik wird ein konstanter Strom zwischen einer aktiven Elektrode über ausgewählten Wirbelsäulensegmenten übergeben, wobei eine Referenzelektrode entweder ventral oder rostral⁴befindet. Mehrere Studien haben bereits bestätigt, dass tsDCS bei der Verwaltung bestimmter pathologischer Erkrankungen wie neuropathische Schmerzen⁵, Spastik⁶, Rückenmarksverletzung⁷ oder zur Erleichterung der Rehabilitation⁸. Die Forscher vermuten, dass tsDCS Veränderungen in der Ionenverteilung zwischen dem intrazellulären und dem extrazellulären Raum über die Zellmembran hervorruft, und dies kann entweder die neuronale Aktivität je nach aktueller Ausrichtung^9,10,11erleichtern oder hemmen. Bis vor kurzem fehlte jedoch eine direkte Bestätigung dieses Einflusses auf Motoneuronen.

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur In-vivo-intrazellulären Aufzeichnung elektrischer Potentiale aus Lendenwirbelsäulen-Motoneuronen bei der anästhesierten Ratte bei gleichzeitiger Anwendung von tsDCS, um Veränderungen der Motoneuronmembran und feuerende Eigenschaften als Reaktion auf die anodale oder katahodale Polarisation des spinalen neuronalen Netzwerks zu beobachten. Intrazelluläre Aufnahmen öffnen mehrere Bereiche der Untersuchung von Neuroneneigenschaften, nicht verfügbar für zuvor verwendete extrazelluläre Techniken^9,12. Beispielsweise ist es möglich, die Motoneuron-Membranspannung auf den durch tsDCS induzierten Gleichstromfluss präzise zu messen, die Spannungsschwelle für die Spitzenerzeugung anzugeben oder Aktionspotenzialparameter zu analysieren. Darüber hinaus ermöglicht uns diese Technik, passive Membraneigenschaften von Motoneuron zu bestimmen, wie z. B. Eingangswiderstand, und den Zusammenhang zwischen intrazellulärem Stimulationsstrom und Häufigkeit des rhythmischen Abfeuerns von Motoneuronen zu beobachten. Die antidromische Identifizierung von aufgezeichnetem Motoneuron, basierend auf der Stimulation funktionell identifizierter Nerven (d.h. Nerven, die Flexoren oder Extensoren efferents liefern) ermöglicht es uns, zusätzlich Typen von innervierten Motoreinheiten (schnell versus langsam) zu identifizieren, was die Möglichkeit gibt zu testen, ob polarisation steile debeeinflusst einzelne Elemente des reifen spinalen neuronalen Systems. Aufgrund umfangreicher Operationen vor der Aufnahme und hohen Anforderungen an die Stabilität und Zuverlässigkeit von Aufnahmen ist diese Technik sehr anspruchsvoll, ermöglicht aber eine direkte und langfristige Beurteilung der elektrophysiologischen Eigenschaften eines Motoneurons: vor, während und nach der Anwendung von tsDCS, was entscheidend ist, um sowohl seine akute Wirkung als auch die anhaltende Wirkung zu bestimmen¹³. Als Motoneuron aktiviert direkt extrafusale Muskelfasern¹⁴ und nimmt an der Rückkopplungssteuerung einer Muskelkontraktion und entwickelter Kraft^15teil,16 jeder beobachtete Einfluss von tsDCS auf die Motoreinheit oder Muskelkontraktilen Eigenschaften kann mit Modulationen der Motoneuron Erregbarkeit oder Feuereigenschaften verbunden werden.

Protokoll

Alle mit diesem Protokoll verbundenen Verfahren wurden von den zuständigen Behörden (z. B. der lokalen Ethikkommission) akzeptiert und folgen den nationalen und internationalen Vorschriften über Tierschutz und Tierschutz.

HINWEIS: Jeder Teilnehmer, der an dem Eingriff beteiligt ist, muss in grundlegenden chirurgischen Eingriffen ordnungsgemäß geschult sein und über eine gültige Lizenz für die Durchführung von Tierversuchen verfügen.

1. Anästhesie und Prämedikation

1. Anästhetisieren Sie eine Ratte mit intraperitonealen Injektionen von Natriumpentobarbital (eine Anfangsdosis von 60^{mg-kg -1} für 6 Monate alte männliche Wistar-Ratten mit einem Gewicht von 400-u2012550g).
   HINWEIS: Dieses Protokoll ist nicht auf den angegebenen Stamm, das Geschlecht oder das Alter von Ratten beschränkt. Auch alternative Anästhesie wie Ketamin-Xylazin-Mischung, Alpha-Chloralose oder Fentanyl+Midazolam+Medetomidin kann verwendet werden, wenn besser geeignet für verschiedene Forschungsziele oder wenn von der Ethikkommission erforderlich.
2. Nach ca. 5 min, überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die Hinterbeine der Ratte mit stumpfer Zange kneifen. Fahren Sie nur dann mit den nächsten Schritten des Protokolls fort, wenn keine Reflexaktion beobachtet wird.
3. 0,05 ml Atropin subkutan injizieren, um die Schleimproduktion nach der Intubation zu reduzieren.
4. Subkutan 5 ml Phosphatpuffer mit 4% Glukoselösung, NaHCO₃ (1 %) injizieren gelatine (14%). Dieser Puffer wird während eines Experiments von den Hautgefäßen absorbiert und trägt zur Aufrechterhaltung des Flüssigkeitsgleichgewichts bei.
5. Während der gesamten Operation, überprüfen Sie das Tier regelmäßig auf Reflexaktionen und ergänzen Anästhesie bei Bedarf (10^{mg-kg -1-h -1}Natriumpentobarbital).

2. Chirurgie

1. Bereiten Sie das Tier für die chirurgische Behandlung vor, indem Sie Fell über den dorsalen Teil des linken Hinterbeins, vom Knöchel bis zur Hüfte, der Rückseite, vom Schwanz bis zu den hohen Brustsegmenten, die linke Seite der Brust und die ventrale Seite des Nackenbereichs über dem Brustbein
2. Platzierung der intravenösen Linie
   1. Legen Sie die Ratte auf den Rücken auf ein geschlossenes Heizkissen (und sichern Sie sie mit Gliedmaßenfixierungen).
   2. Mit einer 21 Klinge, machen Sie einen Längsschnitt durch die Haut von einem Brustbein zu einem Kinn.
   3. Halten Sie die Haut mit Zangen und trennen Sie sie vom darunter liegenden Gewebe.
   4. Mit stumpfen Seziertechniken entlarven die richtige Jugularvene. Sezieren Sie die Vene vorsichtig von umgebenden Geweben.
   5. Suchen Sie den Teil der Vene ohne Verzweigungspunkte, rutschen Sie zwei 4-0 Ligaturen darunter.
   6. Machen Sie einen losen Knoten am proximalen Ende des zuvor identifizierten nicht verzweigten Segments der Vene und einen losen Knoten am distalen Ende dieses Segments der Vene. Klemmen Sie die Vene proximal an das Herz, und dann ligate den distalen Teil der Vene.
   7. Mit Irisschere, machen Sie einen Schnitt zwischen der Klemme und entfernten Ligatur. Halten Sie eine Venesklappe und führen Sie einen vorgefüllten Katheter so ein, dass er durch die Klemme blockiert wird.
   8. Wenn Sie die Vene und den Katheter zusammen mit Zangen halten, entfernen Sie die Klemme und drücken Sie den Katheter mehrere Millimeter in die Vene. Sichern Sie beide Enden des Katheters an der Vene, und fügen Sie der Haut einen zusätzlichen Fixationspunkt hinzu.
3. Einführung des Trachealrohrs
   1. Mit stumpfer Zange trennen die beiden Unterkieferdrüsen, die die Sternohyoid-Muskeln bedecken. Trennen Sie die sternohyoiden Muskeln an der Mittellinie, um die Luftröhre freizulegen.
   2. Schieben Sie drei 4-0 Ligaturen unter die Luftröhre, dann machen Sie zwei Knoten unter der Trachealrohr-Einfügemarke und einen Knoten darüber.
   3. Suchen Sie den cricoiden Knorpel des Kehlkopfes und machen Sie einen Schnitt unterhalb des dritten Trachealknorpels.
   4. Legen Sie ein Luftröhrenrohr in die Luftröhre und sichern Sie das Rohr mit vorgefertigten Ligaturen an Ort und Stelle, dann fügen Sie der Haut eine zusätzliche Ligatur hinzu.
   5. Legen Sie ein kleines Stück Watte über die abgetrennten Muskeln und vernähen Sie die Haut über dem operierten Bereich.
4. Zerlegung der Hinterbeinen Nerven
   1. Mit 21 Klinge, machen Sie einen Längsschnitt auf der hinteren Seite der linken Hinterglied, von der Achillessehne bis zur Hüfte.
   2. Schnappen Sie sich die Haut mit Dereinsleinen, und mit stumpfen Seziertechniken trennen Sie die Haut von den zugrunde liegenden Muskeln auf beiden Seiten des Schnittes.
   3. Finden Sie die popliteale Fossa an der Rückseite des Kniegelenks, die von den Bizeps femoris Muskel bedeckt ist, und mit einer Schere machen einen Schnitt zwischen dem vorderen und hinteren Teil dieses Muskels.
   4. Bewegen nach oben schneiden zwei Köpfe des Bizeps femoris bis zur Hüfte, um den Ischiasnerv zu belichten. Cauterize nach Bedarf, um Blutungen zu verhindern.
   5. Identifizieren Sie die suralen, tibialen und häufigen peronealen Zweige des Ischiasnervs.
   6. Trennen Sie mit einer Schere den seitlichen vom medialen Kopf des Magen-Darm-Muskels, um den Tibianerv und seine Zweige freizulegen.
   7. Mit 55 Zangen greifen sie an das distale Ende des Suralnervs, schneiden sie distally und sezieren so weit wie möglich.
   8. Wiederholen Sie den Vorgang mit dem gemeinsamen Peronealnerv.
   9. Mit einer stumpfen Glasstange trennen Sie den Tibianerv von den umgebenden Geweben, wobei darauf geachtet wird, die Blutgefäße nicht zu beschädigen, und schneiden Sie ihn distally.
   10. Identifizieren Sie die medialen Gastrocnemius (MG) und die seitlichen Gastrocnemius- und Soleus-Nerven (LGS).
   11. Mit 55 Zangen, sezieren Sie sorgfältig die MG- und LGS-Nerven, trennen sie von umgebenden Geweben, aber ihre Verbindung zu den jeweiligen Muskeln.
   12. Legen Sie ein mit Einer Linie getränktes Stück Watte unter die exponierten Nerven.
   13. Schließen Sie die Haut über dem operierten Bereich.
5. Laminektomie
   1. Mit 21 Klinge machen einen Längsschnitt vom Kreuzbein bis zum Brustwirbel.
   2. Trennen Sie die Haut von den zugrunde liegenden Muskeln.
   3. Schneiden Sie den Longissimus-Muskel auf beiden Seiten der thorakalen und Lendenwirbelsäulenprozesse.
   4. Mit stumpfkantigem Skalpell ziehen Sie die Muskeln aus der Wirbelsäule zurück, um die Transversalprozesse jedes Wirbels freizulegen.
   5. Mit einer stumpfen Spitzenschere schneiden Sie die Sehnen der Muskeln, die mit den Querprozessen entlang der exponierten Wirbelsäule verbunden sind. Wenden Sie bei Bedarf hämostatische Mittel an.
   6. Identifizieren Sie den Th13-Wirbel als das niedrigste Brustsegment mit Rippeneinfügung und entfernen Sie mit feinen Rongeurs spinnöse Prozesse und Laminaen von Th13 bis L2-Wirbeln, um Lendensegmente des Rückenmarks freizulegen. Denken Sie daran, den L3-Spinnprozess, der als Fixierungspunkt für die Wirbelsäulenstabilisierung verwendet wird, nicht zu beschädigen.
   7. Entfernen Sie den Th12-Spinnprozess und glätten Sie die Wirbeldorsaloberfläche so weit wie möglich.
   8. Mit stumpfen Seziertechniken trennen Sie die Muskeln vom Th11-Wirbel, um Halter-Einfügepunkte zu erstellen.
   9. Legen Sie dünne, mit Wasserlinien getränkte Watte über die freiliegenden Rückenmarkssegmente.
   10. Bewegen Sie die Ratte auf den maßgeschneiderten Metallrahmen mit zwei parallelen Stangen und zwei verstellbaren Armen mit Klammern, um die Wirbelsäule zu stützen und zu stabilisieren.

3. Vorbereitung für die Aufnahme und Stimulation

1. Wirbelsäulenfixierung und Nervenanordnung
   1. Legen Sie die Ratte in den maßgefertigten Rahmen auf ein Heizkissen, das mit dem geschlossenen Heizsystem verbunden ist, um die Körpertemperatur des Tieres bei 37 °C bei 1°C zu halten.
   2. Legen Sie EKG-Elektroden unter die Haut und schließen Sie einen Verstärker zur Herzfrequenzüberwachung an.
   3. Mit den Hautklappen, bilden Sie einen tiefen Pool über dem exponierten Rückenmark.
   4. Mit Metallklemmen, fixieren Sie die Wirbelsäule, indem Sie Klemmen unter Th12 Querprozesse und bei L3 Spinnprozess.
   5. Stellen Sie sicher, dass die Wirbelsäule horizontal gesichert und angeordnet ist, und wenden Sie dann dorso-ventralen Druck auf beiden Seiten der Säule an, um die Muskeln zurückzuziehen.
   6. Füllen Sie den Pool mit warmem (37 °C) Mineralöl und halten Sie ihn bei dieser Temperatur.
   7. Fädeleine eine 4-0 Ligatur durch die Achillessehne, heben und dehnen Sie die operierte linke Hinterbeine, so dass der Knöchel mit der Hüfte nivelliert wird.
   8. Mit den Hautklappen machen einen tiefen Pool über die exponierten Tibial, MG und LGS Nerven.
   9. Füllen Sie den Pool mit warmem (37 °C) Mineralöl.
   10. Legen Sie MG- und LGS-Nerven auf bipolare Silberdraht-stimulierende Elektroden und verbinden Sie sie mit einem quadratischen Pulsstimulator. Verwenden Sie separate Stimulationskanäle für jeden Nerv.
2. Oberflächenelektrodenplatzierung
   1. Legen Sie eine silberne Kugelelektrode auf die linke Kaudalseite des freiliegenden Rückenmarks mit einer Referenzelektrode, die in die Rückenmuskulatur eingesetzt wird, und verbinden Sie beide Elektroden mit dem Differenz-DC-Verstärker. Die Oberflächenkugelelektrode wird verwendet, um afferent Volleys von Nerven aufzunehmen.
   2. Mit einem konstantstromigen Stimulator stimulieren Sie die MG- und LGS-Nerven mit quadratischen Impulsen von 0,1 ms Dauer, die bei einer Frequenz von 3 Hz wiederholt werden, und beobachten Sie affete Volleys.
   3. Bestimmen Sie den Schwellenwert (T) für die Nervenaktivierung, stimulieren Sie jeden Nerv bei ca. 3 T-Intensität und Rekord-Amplitude von afferent volley für jeden Nerv.
   4. Bewegen Sie die Oberflächenelektrode rostral und wiederholen Sie das Verfahren, um Wirbelsäulensegmente zu identifizieren, bei denen amplituden der Volleys für jeden Nerv am höchsten sind. Nach der Bestimmung der maximalen Volleyposition bewegen Sie die Oberflächenelektrode in einen sicheren Abstand vom Rückenmark.
3. Muskellähmung und Bildung eines Pneumothorax zur Reduzierung von Atembewegungen
   1. Die Ratte intravenös mit einem neuromuskulären Blocker lähmen und das Trachealrohr mit einem externen Beatmungsgerät in Übereinstimmung mit einem Nagetier-kompatiblen Capnometer (Pancuroniumbromid, bei einer Anfangsdosis von 0,4^{mg-kg -1}) verbinden, ergänzt alle 30 min in Dosen von 0,2^{mg-kg -1})
   2. Überwachen Sie die₂ Endgezeiten-CO2-Konzentration und halten Sie sie bei etwa 3 bis 20124 %, indem Sie die Lüftungsparameter (Frequenz, Luftdruck und Durchflussvolumen) anpassen.
   3. Machen Sie einen Längsschnitt in der Haut zwischen der 5. und 6. Rippe auf einer Seite der Aufnahme.
   4. Mit einer stumpfen Spitzenschere schneiden Sie die darüber liegenden Muskeln, um den interkostalen Raum zwischen den Rippen zu visualisieren.
   5. Mit einer kleinen scharfen Schere, machen Sie einen kleinen Schnitt in den interkostalen Muskeln und in der Pleura, dann legen Sie eine Spitze einer stumpfen Kante Zange in die Öffnung, achten Darauf, nicht auf die Lunge drücken.
   6. Lassen Sie Zangen erweitern oder setzen Sie ein kleines Rohr ein, um das Pneumothorax während des Experiments offen zu halten.
   7. Nach dem neuromuskulären Block, überwachen Anästhesie tiefe durch die Überprüfung der EKG-Frequenz, und ergänzen Sie das Anästhetikum, wenn die Herzfrequenz überschreitet 400 bpm. Muskellähmung und Bildung eines Pneumothorax zur Verringerung der Atembewegungen, die Aufnahmestabilität verbessern
4. Öffnen der Dura und Pia mater
   1. Mit #55 Zange, heben Sie die Dura mater vorsichtig an und schneiden Sie sie kauenal aus dem L5-Segment, rostral bis zum L4-Segment.
   2. Mit einem Paar ultradünner 5SF Zangen machen Sie ein kleines Pflaster in der Pia, das die Rückensäule zwischen den Blutgefäßen bedeckt, genau auf der Ebene des maximalen affetierenden Volleys aus dem MG- oder LGS-Nerven.
   3. Verwenden Sie kleine Stücke von salinegetränktem und getrocknetem Gelschaum, um Blutungen bei Bedarf zu blockieren.
5. tsDCS-Elektrodenplatzierung
   1. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Haut auf der ventralen Seite eines Rattenabdomens auf der rostro-kaudalen Ebene entsprechend der Lage der L4-L5-Spinalsegmente.
   2. Schnappen Sie sich die freiliegende Hautklappe mit einem Metallclip, der als Referenzelektrode dient.
   3. Legen Sie einen salzgetränkten Schwamm auf die Dorsalseite des Th12-Wirbels. Stellen Sie sicher, dass die Schwammgröße der einer aktiven tsDCS-Elektrode (kreisförmige Edelstahlplatte mit einem Durchmesser von 5 mm) entspricht.
   4. Drücken Sie mit einem feinen Manipulator den Schwamm mit einer aktiven tsDCS-Elektrode auf den Knochen und stellen Sie sicher, dass die gesamte Oberfläche der Elektrode gleichmäßig gepresst wird.
   5. Verbinden Sie sowohl Referenz- als auch aktive tsDCS-Elektroden mit einer Konstantstrom-Stimulatoreinheit, die einen kontinuierlichen Gleichstromfluss liefern kann.
6. Herstellung von Mikropipetten
   1. Mit einem Mikroelektroden-Zieher eine Mikroelektrode vorbereiten.
      HINWEIS: Es können sowohl Filament- als auch Nicht-Filamentelektroden verwendet werden, denken Sie jedoch daran, dass der Schaft der Elektrode lang genug sein muss, um das ventrale Horn zu erreichen, während sie dünn genug ist, um das Rückenmark beim Absteigen nicht zu komprimieren.
      1. Stellen Sie die Puller-Einstellung so ein, dass der Inpassus, der in das Rückenmark eindringt, ca. 3 mm lang ist, während die Spitze der Elektrode nicht mehr als 1,2222 m Durchmesser hat und der Mikroelektrodenwiderstand zwischen 10 und 20 M beträgt.
   2. Füllen Sie die Mikroelektroden mit 2M Kalium-Citrat-Elektrolyt.
   3. Montieren Sie die vorbereitete Mikroelektrode am Mikromanipulator, sodass eine Schrittbewegung und stereotaxic-Kalibrierung von 1-u20122m möglich ist.
   4. Schließen Sie die Mikroelektrode mit der Referenzelektrode an den intrazellulären Verstärker an, die in den Rückenmuskeln platziert ist.
7. Nach dem neuromuskulären Block, überwachen Anästhesie tiefe durch die Überprüfung der EKG-Frequenz, und ergänzen Sie das Anästhetikum, so dass die Rate der Ratte nicht mehr als 400 bpm.

4. Motoneuron Verfolgung und Penetration

1. Legen Sie die afferent volley Aufnahmeelektrode wieder auf die Rückenmarksoberfläche, kausal an die Position der Aufnahmestelle, auf Höhe des L6-Segments.
2. Stimulieren Sie die MG- und LGS-Nerven mit elektrischen 0,1 ms Impulsen bei einer Frequenz von 3 Hz und 3T-Intensität, um alle Axone von Alpha-Motoneuronen innerhalb eines ausgewählten Nervs zu aktivieren.
3. Fahren Sie die Micropipette in einen ausgewählten Patch in der Pia mit einem medio-lateralen Winkel von 15-u201220° (mit einer spitze seitlich gerichteten Spitze).
4. Nach dem Abstieg unter die Oberfläche, kalibrieren Sie die Mikroelektrode und kompensieren ihre Kapazität und Spannungsversatz, und setzen Sie das Eindringen des Rückenmarks fort, wenn alle Parameter stabil sind. Ein antidromisches Feldpotential des Motoneuronbeckens wird an der Mikroelektrodenspannungsspur sichtbar sein, während man sich während der Stimulation des jeweiligen Nervs einem dedizierten Motorkern nähert.
5. Führen Sie die Penetration mit der Mikroelektrode bei Schritten von 1,20122 m durch und nutzen Sie regelmäßig die Buzz-Funktion des intrazellulären Verstärkers, um die Elektrodenspitze von Rückständen zu befreien.
6. Beobachten Sie die Motoneuron-Penetration, die durch eine plötzliche Hyperpolarisation der aufgezeichneten Spannungsspur und das Auftreten eines antidromischen Spitzenpotentials gekennzeichnet ist.

5. Aufnahme von Motoneuron-Membran und Brenneigenschaften

1. Identifizieren Sie im Brückenmodus des intrazellulären Verstärkers das Motoneuron anhand des "Alles-oder-Nichts"-Erscheinungsbildes des antidromischen Wirkungspotentials durch Stimulierung der jeweiligen Nervenzweige. Zeichnen Sie 20 nachfolgende Spuren für die spätere Mittelung auf.
2. Implementierung eines strengen Einschlusskriteriums, um qualitativ hochwertige Daten zu gewährleisten: ruhendes Membranpotenzial von mindestens -50 mV in Amplitude; Aktionspotenzial-Amplituden von mehr als 50 mV mit positiver Überschreitung; Membranpotenzial stabil für mindestens 5 min vor der Aufnahme.
3. In einem diskontinuierlichen Strom-Clamp-Modus (Strom-Schaltrate-Modus 4–8 kHz) des intrazellulären Verstärkers, evozieren ein orthodromisches Aktionspotential in einem Motoneuron mit 0,5 ms intrazellulären depolarisierenden Stromimpulsen. Wiederholen Sie den Vorgang mindestens 20 Mal für die Offline-Mittelung.
4. Stimulieren Sie ein Motoneuron mit 40 kurzen Impulsen (100 ms) hyperpolarisierenden Strom (1 nA), um den Zelleingangswiderstand zu berechnen.
5. Stimulieren Sie ein Motoneuron mit 50 ms quadratischen Wellenimpulsen bei steigenden Amplituden, um den Rheobase-Wert als minimale Amplitude des depolarisierenden Stroms zu bestimmen, der erforderlich ist, um eine einzelne Spitze auszulösen.
6. Injizieren Sie 500 ms rechteckige Impulse des depolarisierenden Stroms, bei zunehmenden Amplituden in Schritten von 0,1–2 nA, um rhythmische Entladungen von Motoneuronen zu evozieren.

6. Transspinale Gleichstromstimulation (tsDCS)

1. Unter Beibehaltung einer stabilen Penetration des Motoneurons, starten Sie das Polarisationsverfahren durch transspinale Anwendung von Gleichstrom. Passen Sie die aktuelle Intensität und Anwendungszeit an das Versuchsdesign an (z. B. 0,1 mA für 15 min).
2. Beobachten Sie unmittelbar nach dem Einschalten des Gleichstroms das Motoneuron-Membranpotential. Die anodale Polarisation (die aktive Elektrode als Anode) sollte zu einer Depolarisation des Membranpotentials führen, während die kathadale Polarisation (die aktive Elektrode als Kathode) einen gegenteiligen Effekt hervorrufen sollte. Beobachten Sie, ob eine Änderung des ruhenden Membranpotentials als Reaktion auf die DC-Stimulation konstant ist, wodurch sichergestellt wird, dass die elektrische Feldintensität nicht beeinträchtigt wird.
3. Wiederholen Sie bei kontinuierlicher Stromanwendung die Schritte 5.3-u20125.6 in 5-min-Intervallen.
4. Schalten Sie den Domänencontroller aus, und wiederholen Sie die Schritte 5.3-u20125.6 in 5-min-Intervallen, bis Aufzeichnungen instabil werden oder Aufnahmekriterien kompromittiert werden.
5. Beenden Sie das Experiment und einschläfern Sie das Tier mit intravenöser Verabreichung einer tödlichen Dosis Pentobarbital-Natrium (180^{mg-kg -1}).

Ergebnisse

Parameter von Aktionspotentialen und mehrere Membraneigenschaften können auf der Grundlage intrazellulärer Aufzeichnungen berechnet werden, wenn stabile Bedingungen der Zelldurchdringung gewährleistet sind. Abbildung 1A zeigt ein typisches orthodromisches Aktionspotential, das durch intrazelluläre Stimulation evoziert wird und alle Kriterien für die Dateneinschlusse erfüllt (das Ruhende Membranpotential von mindestens -50 mV und die Spikeamplitude über 50 mV mit einer positiven Übers...

Diskussion

Bei korrekter Durchgeführtkeit sollte der chirurgische Teil des beschriebenen Protokolls innerhalb von etwa drei Stunden abgeschlossen sein. Besonders vorsichtig ist es, während der Operation stabile physiologische Bedingungen eines Tieres, insbesondere körperintheischer Temperatur und Tiefe der Anästhesie, aufrechtzuerhalten. Abgesehen von offensichtlichen ethischen Erwägungen kann ein Mangel an richtiger Anästhesie zu übermäßigen Gliedmaßenbewegungen während der Nervensektion oder Laminektomie führen und zu...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Durgs and solutions	-	-	-
Atropinum sulfuricum	Polfa Warszawa	-	-
Glucose	Merck	346351	-
NaHCO3	Merck	106329	-
Pancuronium Jelfa	PharmaSwiss/Valeant	-	Neuromuscular blocker
Pentobarbital sodium	Biowet Pu?awy Sp. z o.o	-	Main anesthetic agent
Pottasium citrate	Chempur	6100-05-06	-
Tetraspan	Braun	-	HES solution
Surgical equipment	-	-	-
21 Blade	FST	10021-00	Scalpel blade
Cauterizer	FST	18010-00	-
Chest Tubes	Mila	CT1215	-
Dumont #4 Forceps	FST	11241-30	Muscle forceps
Dumont #5 Forceps	FST	11254-20	Dura forceps
Dumont #5F Forceps	FST	11255-20	Nerve forceps
Dumont #5SF Forceps	FST	11252-00	Pia forceps
Forceps	FST	11008-13	Blunt forceps
Forceps	FST	11053-10	Skin forceps
Hemostat	FST	13013-14	-
Rongeur	FST	16021-14	For laminectomy
Scissors	FST	15000-08	Vein scissors
Scissors	FST	15002-08	Dura scissors
Scissors	FST	14184-09	For trachea cut
Scissors	FST	104075-11	Muscle scissors
Scissors	FST	14002-13	Skin scissors
Tracheal tube	-	-	Custom made
Vein catheter	Vygon	1261.201	-
Vessel cannulation forceps	FST	18403-11	-
Vessel clamp	FST	18320-11	For vein clamping
Vessel Dilating Probe	FST	10160-13	For vein dissection
Sugrgical materials	-	-	-
Gel foam	Pfizer	GTIN 00300090315085	Hemostatic agent
Silk suture 4.0	FST	18020-40	-
Silk suture 6.0	FST	18020-60	-
Equipment	-	-	-
Axoclamp 2B	Molecular devices	discontinued	Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A
CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor	CWE	11-10000	Gas analyzer
Grass S-88	A-M Systems	discontinued	Constant current stimulator
Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe	Harvard Apparatus	507222F	Heating system
ISO-DAM8A	WPI	74020	Extracellular amplifier
Microdrive	-	-	Custom made/replacement IVM/Scientifica
P-1000 Microelectrode puller	Sutter Instruments	P-1000	Microelectrode puller
SAR-830/AP Small Animal Ventilator	CWE	12-02100	Respirator
Support frame	-	-	Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting
Spinal clamps	-	-	Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting
TP-1 DC stimulator	WiNUE	-	tsDCS stimulator
Miscellaneous	-	-	-
1B150-4 glass capillaries	WPI	1B150-4	For microelectrodes production
Cotton wool	-	-	-
flexible tubing	-	-	For respirator and CO2 analyzer connection
MicroFil	WPI	MF28G67-5	For filling micropipettes
Silver wire	-	-	For nerve electrodes