В Vivo внутриклеточной записи тип-идентифицированных крыс спинного мотонейронов во время транс-спинного прямого тока стимуляции

Резюме

Этот протокол описывает внутриклеточную запись внутриклеточной записи крысиных поясничных мотонейронов с одновременным транс-спинномозговой стимуляцией прямого тока. Метод позволяет измерять мембранные свойства и записывать ритмическую стрельбу мотонейронов до, во время и после анодальной или катодальной поляризации спинного мозга.

Аннотация

Внутриклеточная запись спинномозговых мотонейронов in vivo обеспечивает «золотой стандарт» для определения электрофизиологических характеристик клеток в нетронутой спинальной сети и имеет значительные преимущества по сравнению с классическими методами экстракорпоральной или внеклеточной записи. Преимущество внутриклеточных записей in vivo заключается в том, что этот метод может быть выполнен на взрослых животных с полностью зрелой нервной системой, и поэтому многие наблюдаемые физиологические механизмы могут быть переведены на практическое применение. В этой методологической работе мы описываем эту процедуру в сочетании с внешне применяемой постоянной текущей стимуляцией, которая имитирует процессы поляризации, происходящие в спинномозговых нейронных сетях. Транс-спинальной стимуляции прямого тока (tsDCS) является инновационным методом все чаще используется в качестве нейромодуляторного вмешательства в реабилитации после различных неврологических травм, а также в спорте. Влияние tsDCS на нервную систему остается плохо понятым и физиологические механизмы, стоящие за его действиями, в значительной степени неизвестны. Применение tsDCS одновременно с внутриклеточными записями позволяет нам непосредственно наблюдать изменения свойств мотонейронной мембраны и характеристик ритмической стрельбы в ответ на поляризацию сети спинного нейрона, что имеет решающее значение для понимания действий цДЦ. Кроме того, когда представленный протокол включает в себя идентификацию мотонейрона в отношении иннерватной мышцы и ее функции (сгибатель против экстенсора), а также физиологический тип (быстрый и медленный), он дает возможность выборочно исследовать влияние tsDCS на выявленные компоненты спинномозговой цепи, которые, как представляется, по-разному зависит от поляризации. Представленная процедура посвящена хирургической подготовке к внутриклеточным записям и стимуляции с акцентом на шаги, необходимые для достижения стабильности подготовки и воспроизводимости результатов. Детали методологии анодального или катодального применения tsDCS обсуждаются, обращая внимание на практические вопросы и вопросы безопасности.

Введение

Транс-спинальной стимуляции прямого тока (tsDCS) получает признание в качестве мощного метода для изменения возбудимости спинномозговой цепи^{в здоровье и болезни 1,2,3}. В этом методе, постоянный ток передается между активным электродом, расположенным над выбранными сегментами позвоночника, со эталонным электродом, расположенным либо вентрально, либо более^{рострально 4.} Несколько исследований уже подтвердили, что tsDCS может быть использован в управлении определенными патологическими состояниями, такими как^{невропатическая боль 5,спастичность 6,}повреждение^{спинного мозга 7 или} для облегчения^{реабилитации 8}. Исследователи предполагают, что tsDCS вызывает изменения в распределении ионов между внутриклеточным и внеклеточным пространством через клеточную мембрану, и это может либо облегчить или ингибировать нейронной активности в зависимости от^{текущей ориентации 9,10,11}. Однако до недавнего времени прямого подтверждения этого влияния на мотонейроны не было.

Здесь мы описываем подробный протокол для проведения внутриклеточной записи внутриклеточной записи электрических потенциалов поясничных позвоночных мотонейронов в анестезированной крысе с одновременным применением цДКС, для того, чтобы наблюдать изменения в мотонейронной мембране и огневых свойствах в ответ на анодальную или катодную поляризацию спинальной нейрональной сети. Внутриклеточные записи открывают несколько областей исследования свойств нейронов, недоступных для ранее использованных внеклеточных^{методов 9,,12.} Например, можно точно измерить реакцию напряжения мотонейроновой мембраны на прямой поток тока, индуцированный tsDCS, указать порог напряжения для генерации шипов или проанализировать потенциальные параметры действия. Кроме того, этот метод позволяет определить мотонейронные пассивные мембранные свойства, такие как входное сопротивление, и наблюдать связь между внутриклеточным тоном стимуляции и частотой ритмичной стрельбы мотонейронов. Антидромная идентификация записанного мотонейрона, основанная на стимуляции функционально идентифицированных нервов (т.е. нервов, обеспечивающих эфференты сгибателям или разгибателям), позволяет дополнительно определить типы иннерватных моторных агрегатов (быстрых и медленных), что дает возможность проверить, влияет ли поляризация по-разному на отдельные элементы зрелой спинномозговой нейронной системы. В связи с обширной хирургией, предшествующей записи, и высокими требованиями к стабильности и надежности записей, этот метод является весьма сложным, но позволяет проводить прямую и долгосрочную оценку электрофизиологических характеристик одного мотонейрона: до, во время и после применения tsDCS, что имеет решающее значение для определения как его острых действий, так и^{стойких эффектов 13}. Как motoneuron непосредственно активирует внефусальные мышечные^{волокна 14 и} принимает участие в контроле обратной связи сокращения мышц и развитой^{силы 15,16 любое} наблюдаемое влияние tsDCS на двигательный блок или мышечные контрактильные свойства могут быть связаны с модуляциями мотонейрона возбудимость или огневые характеристики.

протокол

Все процедуры, связанные с этим протоколом, были приняты соответствующими органами (например, местным комитетом по этике) и следуют национальным и международным правилам в области защиты животных и управления ими.

ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый участник, участвующий в процедуре, должен быть должным образом обучен основным хирургическим процедурам и иметь действительную лицензию на выполнение экспериментов на животных.

1. Анестезия и предустановка

1. Анестезировать крысу с внутриперитонеальными инъекциями пентобарбитала натрия (начальная доза 60^{мг/кг -1 для} 6-месячного самца крыс Wistar весом 400-u2012550g).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол не ограничивается указанным штаммом, полом или возрастом крыс. Кроме того, альтернативные анестезии, такие как кетамин-ксилазин смесь, альфа-хлоралоза или фентанил-мидазолам-медетомидин могут быть использованы, если больше подходит для различных целей исследования или при необходимости комитета по этике.
2. Примерно через 5 минут проверьте глубину анестезии, ущипнув крысиный задний конечность тупыми щипсями. Продолжить следующие шаги протокола только тогда, когда никаких рефлекторных действий не наблюдается.
3. Вводить 0,05 мл атропина подкожно, чтобы уменьшить выработку слизи после интубации.
4. Вводить подкожно 5 мл фосфатного буфера, содержащего 4% раствор глюкозы, NaHCO₃ (1 %) и желатин (14%). Этот буфер будет поглощаться каными сосудами на протяжении всего эксперимента и поможет поддерживать баланс жидкости.
5. На протяжении всей операции периодически проверяйте животное на наличие рефлекторных действий и при необходимости дополняйте анестезию^{(10 мг/кг -1ч -1}пентобарбитала натрия).

2. Хирургия

1. Подготовка животного к хирургическому лечению путем бритья меха над спинной частью левой задней части, от лодыжки до бедра, задней, от хвоста до высоких грудных сегментов, левая сторона груди, и брюшной стороне области шеи над грудиной
2. Размещение внутривенной линии
   1. Поместите крысу на спину на закрытую грелку (и закрените ее фиксациями конечностей).
   2. Используя 21 лезвие, сделайте продольный разрез через кожу от грудины до подбородка.
   3. Держите кожу с тисью и отделить его от основной ткани.
   4. Используя тупые методы вскрытия, выставляют правую яремную вену. Тщательно вскрыть вену из окружающих тканей.
   5. Найдите часть вены без точек ветвления, проскользнете под ней две лигатуры 4-0.
   6. Сделайте один свободный узел на проксимальной конце ранее выявленного не ветвясь сегмента вены и один свободный узел на дистальной конце этого сегмента вены. Зажим вены проксимальной для сердца, а затем ligate дистальной части вены.
   7. Используя ножницы радужной оболочки глаза, сделайте разрез между зажимом и далекой лигатурой. Держите лоскут вены, и ввести предварительно заполненный катетер до точки, где он заблокирован зажимом.
   8. Удерживая вену и катетер вместе с типсами, снимите зажим и надавлите катетер на несколько миллиметров в вену. Защитите оба конца катетера к вене, и добавьте дополнительную точку фиксации к коже.
3. Введение трахеальной трубки
   1. Использование тупых типсов отделяет две миндибулярные железы, покрывающие стернохиоидные мышцы. Отдельные стернохиоидные мышцы в средней линии, чтобы разоблачить трахею.
   2. Скольжение три 4-0 лигатуры под трахеей, а затем сделать два узла ниже точки вставки трахеи трубки и один узел выше.
   3. Найдите крикоидный хрящ гортани и сделайте разрез ниже третьего трахеального хряща.
   4. Вставьте трахею трубки вниз трахеи и обеспечить трубку на месте с заранее подготовленными лигатурами, а затем добавить дополнительную лигатуру на кожу.
   5. Поместите небольшой кусочек ваты над разделенными мышцами, и шов кожи над оперой области.
4. Рассечение нервов задних конечностей
   1. Используя 21 лезвие, сделайте продольный разрез на задней стороне левой задней конечности, от ахиллова сухожилия до бедра.
   2. Захватите кожу тисью и с помощью тупых методов вскрытия отделить кожу от основных мышц по обе стороны разреза.
   3. Найдите popliteal fossa в задней части коленного сустава, который покрыт мышцей бицепса бедренной кости, и с помощью ножниц сделать разрез между передней и задней части этой мышцы.
   4. Двигаясь вверх вырезать две головы бицепса femoris вся дорогу до бедра подвергать седалищного нерва. Прижигать по мере необходимости, чтобы предотвратить кровотечение.
   5. Определите sural, tibial и общие перонеальные ветви седалищного нерва.
   6. Используя ножницы, отделить боковой от медиальной головки мышцы гастрокнейма подвергать трибиального нерва и его ветвей.
   7. Используя 55 типсов захватить дистальный конец слухового нерва, сократить его дистально и вскрыть, насколько это возможно.
   8. Повторите процедуру с общим перонеальным нервом.
   9. Использование тупого стеклянного стержня отделяет тибиальный нерв от окружающих тканей, заботясь о том, чтобы не повредить кровеносные сосуды, и разрезает его в конце.
   10. Определите медиальный гастрокнеймиус (MG) и боковой гастрокнеймиус и soleus (LGS) нервы.
   11. Используя 55 типсов, тщательно рассекает нервы MG и LGS, отключая их от окружающих тканей, но поддерживая их связь с соответствующими мышцами.
   12. Поместите пропитанный раствором кусок ваты под открытые нервы.
   13. Закройте кожу над прооперовой областью.
5. Ламинэктомия
   1. С помощью 21 лезвия сделайте продольный разрез от крестца до грудных позвонков.
   2. Отделить кожу от основных мышц.
   3. Вырезать longissimus мышцы по обе стороны грудной и поясничной спинных процессов.
   4. Используя тупо краями скальпель втягивать мышцы из позвоночника подвергать поперечных процессов каждого позвонка.
   5. С помощью тупых ножниц кончика вырезать сухожилия мышц, связанных с поперечными процессами вдоль открытых позвоночника. При необходимости применять гемостатические агенты.
   6. Определите позвонок Th13 как самый низкий грудной сегмент с вставкой ребра и с помощью тонких rongeurs удалить спинные процессы и ламина от Th13 до L2 позвонков подвергать поясничных сегментов спинного мозга. Помните, чтобы не повредить L3 спинной процесс, который будет использоваться в качестве точки фиксации для стабилизации позвоночника.
   7. Удалите спинной процесс Th12 и сгладить спинную поверхность позвонка как можно больше.
   8. Использование тупых методов вскрытия отделяет мышцы от позвонка Th11 для создания точек вставки держателя.
   9. Поместите тонкую пропитанную раствором вату над открытыми сегментами спинного мозга.
   10. Перемести крысу на изготовленный на заказ металлический каркас с двумя параллельными прутьями и двумя регулируемыми руками с зажимами для поддержки и стабилизации позвоночника.

3. Подготовка к записи и стимуляции

1. Фиксация позвоночных столбов и расположение нервов
   1. Поместите крысу в специально изготовленную рамку на грелку, подключенную к системе отопления замкнутой петли для поддержания температуры тела животного на уровне 37 градусов по Цельсию.
   2. Вставьте электроды ЭКГ под кожу и подключим к усилителю для мониторинга сердечного ритма.
   3. Используя лоскуты кожи, образуют глубокий бассейн над открытым спинным мозгом.
   4. Используя металлические зажимы, зафиксировать позвоночника, поставив зажимы ниже Th12 поперечных процессов и на L3 спинного процесса.
   5. Убедитесь, что позвонковая колонка защищена и расположена горизонтально, а затем применить спинно-вентральное давление по обе стороны колонны, чтобы втянуть мышцы.
   6. Заполните бассейн теплым (37 градусов по Цельсию) минеральным маслом и поддерживать его при такой температуре.
   7. Нить 4-0 лигатуры через ахиллово сухожилие, поднять и растянуть оперировали левой задней конечности так, что лодыжка выравнивается с бедром.
   8. Использование лоскутов кожи сделать глубокий бассейн над подвергаются тибиальной, MG и LGS нервов.
   9. Заполните бассейн теплым (37 градусов по Цельсию) минеральным маслом.
   10. Поместите MG и LGS нервы на биполярный серебряный провод стимулирующих электродов и подключить их к квадратному стимулятору импульса. Используйте отдельные каналы стимуляции для каждого нерва.
2. Размещение поверхностных электродов
   1. Поместите электрод серебряного шара на левой хвостовой стороне открытого спинного мозга, со эталонным электродом, вставленным в мышцы спины, и соедините оба электрода с дифференциальным усилителем постоянного тока. Электрод поверхностного шара будет использоваться для записи афферентных залпов из нервов.
   2. Используя стимулятор постоянного тока, стимулируйте нервы MG и LGS с квадратными импульсами продолжительностью 0,1 мс, повторяемые с частотой 3 Гц, и наблюдайте за афферентными залпами.
   3. Определите порог (T) для активации нерва, стимулировать каждый нерв примерно на 3 " T интенсивность, и запись амплитуды афферентного залпа для каждого нерва.
   4. Переместите поверхностный электрод ростральный и повторите процедуру определения сегментов позвоночника, при которых амплитуды залпов являются самыми высокими для каждого нерва. Определив максимальное местоположение залпа, перемести поверхностный электрод на безопасное расстояние от спинного мозга.
3. Мышечный паралич и формирование пневмоторакса для уменьшения дыхательных движений
   1. Парализуйте крысу внутривенно с помощью нервно-мышечного блокатора и подключите трахеевую трубку к внешнему аппарату искусственной вентиляции легких в соответствии с капнометром, совместимым с грызунами (бромид панкурония, при начальной дозе^{0,4 мг/кг -1}, дополняется каждые 30 мин в дозах 0,2^{мг кг -1)}
   2. Мониторинг концентрации СО_{2 в конце прилива} и поддержание его на уровне около 3-20124% за счет корректировки параметров вентиляции (частота, давление воздуха и объемы потока).
   3. Сделайте продольный разрез в коже между 5-м и 6-м ребром на стороне записи.
   4. Используя тупые ножницы кончика вырезать чрезмерно мышцы, чтобы визуализировать межреберной пространство между ребрами.
   5. Используя небольшие острые ножницы, сделайте небольшой разрез в межреберных мышцах и в плевре, затем вставьте кончик тупых миппов края в отверстие, заботясь о том, чтобы не давить на легкие.
   6. Разрешить типсы расширить или вставить небольшую трубку, чтобы сохранить пневмоторакс открытым на протяжении всего эксперимента.
   7. После нервно-мышечного блока, контролировать глубину анестезии, проверяя частоту ЭКГ, и дополнить обезболивающее средство, если частота сердечных сокращений превышает 400 bpm. Мышечный паралич и формирование пневмоторакса для уменьшения дыхательных движений, что улучшит стабильность записи
4. Открытие дуры и пиа-матер
   1. Используя #55 миппы, аккуратно поднимите dura mater и вырежьте его caudally от сегмента L5, рострально до сегмента L4.
   2. Используя пару ультратонких 5SF типсов сделать небольшой патч в пиа покрытие спинной колонны, между кровеносными сосудами, точно на уровне максимального афферентного залпа из MG или нерва LGS.
   3. Используйте небольшие кусочки пропитанной солевым раствором и высушенной гелевой пены, чтобы блокировать кровотечение, если это необходимо.
5. размещение электродов tsDCS
   1. Сделайте небольшой разрез в коже на брюшной полости крысы на ростро-каудальном уровне, соответствующем расположению сегментов позвоночника L4-L5.
   2. Захватите открытый лоскут кожи с металлическим зажимом, который будет служить эталонным электродом.
   3. Поместите пропитанную раствором губку на спинную сторону позвонка Th12. Убедитесь, что размер губки равен размеру активного электрода tsDCS (кругообразная пластина из нержавеющей стали диаметром 5 мм).
   4. Используя тонкий манипулятор, нажмите губку с активным электродом tsDCS к кости и убедитесь, что вся поверхность электрода нажата одинаково.
   5. Подключите как эталонные, так и активные электроды tsDCS к блоку стимуляторов постоянного тока, способного обеспечить непрерывный поток прямого тока.
6. Приготовление микропипет
   1. Используя шкив микроэлектрода, подготовь микроэлектрод.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оба нити и не-нити электроды могут быть использованы, однако, помните, что хвостовик электрода должно быть достаточно долго, чтобы достичь брюшного рога, будучи достаточно тонким, чтобы не сжимать спинной мозг во время спуска.
      1. Отрегулируйте настройку выдвижного хвостовика, чтобы хвостовик, поступающий в спинной мозг, был примерно 3 мм в длину, в то время как кончик электрода составляет не более 1 20122 мкм в диаметре, а сопротивление микроэлектроприемки составляет от 10 до 20 МЗ.
   2. Заполните микроэлектроды электролитом 2М калия-цитрата.
   3. Накрените подготовленный микроэлектрод на микроманипуляторе, позволяющий ступенчатое движение 1'u20122 и стереотаксисную калибровку.
   4. Подключите микроэлектрод к внутриклеточному усилителю со эталонным электродом, помещенным в мышцы спины.
7. После нервно-мышечного блока, контролировать глубину анестезии, проверяя частоту ЭКГ, и дополнить обезболивающее средство, так что частота сердечных сокращений крыс не превышает 400 bpm.

4. Мотонейрон отслеживания и проникновения

1. Поместите афферентный залп записи электрода обратно на спинной поверхности спинного мозга, caudally к месту записи сайта, на уровне сегмента L6.
2. Стимулируя нервы MG и LGS электрическими импульсами 0,1 мс с частотой 3 Гц и интенсивностью 3Т, чтобы активировать все аксоны альфа-мотонейронов в пределах выбранного нерва.
3. Привод micropipette в выбранный патч в пиа с медио-боковой угол 15'u201220 "(с наконечником направлены боково).
4. После спуска под поверхностью откалибровать микроэлектрод и компенсировать его способность и напряжение смещения, и продолжить проникновение спинного мозга, когда все параметры стабильны. Антидромный полевой потенциал мотонейронового бассейна будет виден на микроэлектроном следе напряжения при приближении к специальному моторному ядру во время стимуляции соответствующего нерва.
5. Продолжить проникновение с микроэлектрода на 1'u20122 мкм шаги, и периодически использовать функцию buzz внутриклеточного усилителя, чтобы очистить кончик электрода от любых остатков.
6. Наблюдайте проникновение мотонейрона, которое будет характеризоваться внезапной гиперполяризацией записанного следа напряжения и появлением антидромного всплеска потенциала.

5. Запись мотонейроновой мембраны и огневых свойств

1. В мостовом режиме внутриклеточного усилителя определите мотонейрон на основе «все-или-ничего» появления антидромного потенциала действия путем стимулирования соответствующих нервных ветвей. Запись 20 последующих следов для последующего усреднения.
2. Внедрение строгого критерия включения для обеспечения высококачественных данных: потенциал мембраны отдыха не менее -50 мВ при амплитуде; потенциальные амплитуды действия, более 50 мВ, с положительным превышением; мембранный потенциал стабилен в течение не менее 5 минут до записи.
3. В режиме прерывания тока (текущий режим скорости переключения 4-8 кГц) внутриклеточного усилителя, вызывают ортодромный потенциал действия в мотонейроне с использованием 0,5 мс внутриклеточного деполяризации текущих импульсов. Повторите по крайней мере 20 раз для автономного усреднения.
4. Стимулировать мотонейрон с 40 короткими импульсами (100 мс) гиперполяризирующего тока (1 nA) для расчета сопротивления входных данных клеток.
5. Стимулировать мотонейрон с 50 мс квадратных волн импульсов при увеличении амплитуды, чтобы определить значение реобазы, как минимальная амплитуда деполяризации тока, необходимого для получения одного всплеска.
6. Ввилите 500 мс квадратных волновых импульсов деполяризации тока, при увеличении амплитуды в шагах 0,1-2 нА, чтобы вызвать ритмические разряды мотонейронов.

6. Транскондальная стимуляция прямого тока (tsDCS)

1. Сохраняя стабильное проникновение мотонейрона, начните процедуру поляризации путем трансколонного применения прямого тока. Отрегулируйте текущую интенсивность и время применения к конструкции эксперимента (например, 0,1 мА за 15 мин).
2. Сразу после включаемый ДК, наблюдайте за потенциалом мембраны мотонейрона. Анодальная поляризация (активный электрод как анод) должна привести к деполяризации мембранного потенциала, в то время как катодальная поляризация (активный электрод как катод) должна вызывать обратный эффект. Наблюдайте, является ли изменение потенциала мембраны отдыха в ответ на стимуляцию постоянного ДК, что гарантирует, что интенсивность электрического поля не влияет.
3. Во время непрерывного текущего применения повторите шаги 5.3'u20125.6 с интервалом в 5 минут.
4. Выключите DC и продолжайте повторять шаги 5.3'u20125.6 с интервалом в 5 минут до тех пор, пока записи не станут нестабильными или критерии включения не будут скомпрометированы.
5. Прекратите эксперимент и усыпляйте животное с помощью внутривенного введения смертельной дозы пентобарбитального натрия (180 мг^{кг -1).}

Результаты

Параметры действия потенциалов и нескольких мембранных свойств могут быть рассчитаны на основе внутриклеточных записей при условии стабильных условий проникновения клеток. Рисунок 1A представляет собой типичный потенциал ортодромного действия, вызванный внутриклет?...

Обсуждение

При правильной работе хирургическая часть описанного протокола должна быть завершена в течение примерно трех часов. Особо следует позаботиться о поддержании стабильных физиологических условий животного во время операции, в частности температуры тела и глубины анестезии. Помимо очев...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Durgs and solutions	-	-	-
Atropinum sulfuricum	Polfa Warszawa	-	-
Glucose	Merck	346351	-
NaHCO3	Merck	106329	-
Pancuronium Jelfa	PharmaSwiss/Valeant	-	Neuromuscular blocker
Pentobarbital sodium	Biowet Pu?awy Sp. z o.o	-	Main anesthetic agent
Pottasium citrate	Chempur	6100-05-06	-
Tetraspan	Braun	-	HES solution
Surgical equipment	-	-	-
21 Blade	FST	10021-00	Scalpel blade
Cauterizer	FST	18010-00	-
Chest Tubes	Mila	CT1215	-
Dumont #4 Forceps	FST	11241-30	Muscle forceps
Dumont #5 Forceps	FST	11254-20	Dura forceps
Dumont #5F Forceps	FST	11255-20	Nerve forceps
Dumont #5SF Forceps	FST	11252-00	Pia forceps
Forceps	FST	11008-13	Blunt forceps
Forceps	FST	11053-10	Skin forceps
Hemostat	FST	13013-14	-
Rongeur	FST	16021-14	For laminectomy
Scissors	FST	15000-08	Vein scissors
Scissors	FST	15002-08	Dura scissors
Scissors	FST	14184-09	For trachea cut
Scissors	FST	104075-11	Muscle scissors
Scissors	FST	14002-13	Skin scissors
Tracheal tube	-	-	Custom made
Vein catheter	Vygon	1261.201	-
Vessel cannulation forceps	FST	18403-11	-
Vessel clamp	FST	18320-11	For vein clamping
Vessel Dilating Probe	FST	10160-13	For vein dissection
Sugrgical materials	-	-	-
Gel foam	Pfizer	GTIN 00300090315085	Hemostatic agent
Silk suture 4.0	FST	18020-40	-
Silk suture 6.0	FST	18020-60	-
Equipment	-	-	-
Axoclamp 2B	Molecular devices	discontinued	Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A
CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor	CWE	11-10000	Gas analyzer
Grass S-88	A-M Systems	discontinued	Constant current stimulator
Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe	Harvard Apparatus	507222F	Heating system
ISO-DAM8A	WPI	74020	Extracellular amplifier
Microdrive	-	-	Custom made/replacement IVM/Scientifica
P-1000 Microelectrode puller	Sutter Instruments	P-1000	Microelectrode puller
SAR-830/AP Small Animal Ventilator	CWE	12-02100	Respirator
Support frame	-	-	Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting
Spinal clamps	-	-	Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting
TP-1 DC stimulator	WiNUE	-	tsDCS stimulator
Miscellaneous	-	-	-
1B150-4 glass capillaries	WPI	1B150-4	For microelectrodes production
Cotton wool	-	-	-
flexible tubing	-	-	For respirator and CO2 analyzer connection
MicroFil	WPI	MF28G67-5	For filling micropipettes
Silver wire	-	-	For nerve electrodes