在跨脊柱直流刺激期间类型识别大鼠脊柱腺瘤的 Vivo 细胞内记录

摘要

该协议描述了大鼠腰椎瘤的体内细胞内记录，同时具有跨脊柱直电流刺激。该方法使我们能够测量膜特性，并记录脊髓的腺体或阴极化之前、期间和之后有节奏的分子发射。

摘要

体内脊髓腺细胞内记录为确定完整脊柱网络中的细胞电生理特征提供了"黄金标准"，与传统的体外或细胞外记录技术相比具有显著优势。体内细胞内记录的优点是，这种方法可以在神经系统完全成熟的成年动物身上进行，因此许多观察到的生理机制可以转化为实际应用。在本文中，我们描述了这个程序与外部应用的恒定电流刺激相结合，它模仿脊柱神经元网络内发生的极化过程。跨脊柱直流刺激（tsDCS）是一种创新的方法，越来越多地用作各种神经损伤后康复和运动的神经调节干预。tsDCS对神经系统的影响仍然不为人所知，其行动背后的生理机制在很大程度上未知。tsDCS 与细胞内记录同时应用使我们能够直接观察莫托龙膜特性的变化和节律激发的特征，以应对脊柱神经元网络的极化，这对理解 tsDCS 操作至关重要。此外，当提出的协议包括识别内侧肌肉及其功能（柔性与拉伸器）以及生理类型（快速与缓慢）的motoneuron时，它提供了一个机会，有选择地研究tsDCS对已识别的脊柱回路成分的影响，这些成分似乎受到极化的影响不同。所介绍的程序侧重于细胞内记录和刺激的手术准备，重点是实现制备稳定性和结果可重复性所必需的步骤。讨论了阴极或阴极 tsDCS 应用方法的细节，同时关注实际和安全问题。

引言

跨脊柱直流刺激（tsDCS）作为一种有效的方法，在健康和疾病^{1，2，3中改变2脊柱回路兴奋性， 正在得到认可}。¹在这项技术中，一个恒定电流在位于选定脊髓段上方的有源电极之间传递，参考电极位于呼吸口或更红^{润的 4}。几项研究已经证实，tsDCS可用于管理某些病理状况，如神经病变^疼痛5，痉挛^6，脊髓损伤⁷或促进康复^8。研究人员认为，tsDCS会唤起细胞内和细胞膜外空间之间离子分布的改变，根据当前方向^{,9、10、11，,10}这可促进或抑制神经元^活动。然而，直到最近，还缺乏对莫托龙这种影响的直接证实。

在这里，我们描述了一个详细的方案，用于在体内进行麻醉大鼠腰椎莫酮的电位记录，同时应用 tsDCS，以观察莫托内隆膜的变化和燃烧特性，以应对脊髓神经网络的腺癌或阴极化。细胞内记录打开神经元属性的几个区域调查，不适用于以前使用的细胞外技术^9,9，12。例如，可以精确测量由 tsDCS 诱导的莫托龙膜膜电压响应，以指示尖峰生成电压阈值，或分析作用电位参数。此外，该技术还使我们能够确定莫托龙无源膜特性，如输入电阻，并观察细胞内刺激电流与分子节律发射频率之间的关系。基于功能识别神经（即向屈曲器或挤出器提供发源的神经）的抗浪漫性识别，使我们能够进一步识别内向运动单元的类型（快与慢），从而有机会测试极化是否以不同的方式影响成熟的脊柱神经元系统的单个元素。由于在录音前进行了广泛的手术，并且对录音的稳定性和可靠性要求很高，这项技术极具挑战性，但允许对一个motoneuron的电生理特性进行直接和长期的评估:在tsDCS应用之前、期间和之后，这对于确定其急性作用和持续效应^{至关重要。}由于motoneuron直接激活外混肌^纤维14，并参与肌肉收缩的反馈控制，并发展力量^15，16任何观察到^15,的tsDCS对运动单元或肌肉收缩特性的影响可能与motoneuron兴奋性或燃烧特性的调制有关。

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研究方案

与本议定书有关的所有程序都已被有关当局（例如地方道德委员会）接受，并遵守关于动物福利和管理的国家和国际规则。

注:参与手术的每个参与者必须接受基本外科手术方面的训练，并且必须拥有进行动物实验的有效许可证。

1. 麻醉和预谋

1. 麻醉大鼠与内丙酮注射五巴比妥钠（初始剂量60毫克^+千克-1 为6个月大的雄性威斯塔大鼠体重400\u2012550g）。
   注:此协议不限于大鼠的分株、性别或年龄。此外，如果更适合不同的研究目标或伦理委员会的要求，可以使用替代麻醉，如氯胺酮-锡拉辛混合物、α-氯糖或芬太尼-米达佐兰®梅多米丁。
2. 大约 5 分钟后，通过用钝钳捏大鼠的后肢脚趾来检查麻醉深度。只有在未观察到反射操作时，才继续执行协议的下一步。
3. 注射0.05 mL的阿托平皮，以减少插管后粘液的产生。
4. 注射含有4%葡萄糖溶液的5 mL磷酸盐缓冲液，NaHCO₃ （1%）和明胶（14%）。这种缓冲液将被皮肤血管吸收，有助于保持流体平衡。
5. 在整个手术过程中，定期检查动物的反射动作，如果需要，补充麻醉（10mg=kg^-1+h-1五巴比妥钠）。

2. 手术

1. 通过剃毛在左后肢的背部，从脚踝到臀部，背面，从尾巴到高胸段，胸部左侧，以及胸骨上方颈部区域的腹侧，为动物进行手术治疗做好准备
2. 静脉注射线的放置
   1. 将大鼠放在其背部的闭环加热垫上（用肢体固定固定固定它）。
   2. 使用 21 刀片，将从胸骨到下巴的纵向切口穿过。
   3. 用钳子握住皮肤，把它从底层组织分离。
   4. 使用钝解剖技术暴露右血管。小心地从周围组织解剖静脉。
   5. 找到没有分支点的静脉部分，在静脉下方滑动两个 4-0 连字。
   6. 在先前识别的静脉非分支段的近端打一个松动结，在静脉的这一段的端端打一个松动结。将静脉紧拉至心脏，然后将静脉的端点夹住。
   7. 使用虹膜剪刀，在夹子和远处连结之间进行切口。握住静脉的活门，将预填充的导管引入被夹子阻挡的点。
   8. 将静脉和导管与钳子一起握住时，拆下夹子，将导管推入静脉几毫米。将导管的两端固定到静脉，并在皮肤上添加额外的固定点。
3. 气管的介绍
   1. 使用钝钳分离覆盖胸腺的两个腺体。分离中线的胸腺肌肉，露出气管。
   2. 在气管下方滑动三个 4-0 连结，然后在气管插入点下方打两节，在上面打一个结。
   3. 找到喉部软骨，并在第三气管软骨下方做一个切口。
   4. 将气管管插入气管下气管，然后用预先准备的连字固定管，然后向皮肤添加额外的连结。
   5. 将一小块棉布放在分离的肌肉上方，将皮肤缝合在手术区域上方。
4. 后肢神经的解剖
   1. 使用21刀片，在左后肢的后侧，从跟腱到臀部进行纵向切割。
   2. 用钳子抓取皮肤，并使用钝解剖技术将皮肤与切口两侧底层肌肉分开。
   3. 找到膝盖关节后部的罂粟花，这是覆盖的二头肌股骨肌肉，并使用剪刀在这个肌肉的前部和后部之间做一个切口。
   4. 向上移动切切两个头的二头肌股骨一路到臀部暴露坐骨神经。根据需要进行烧灼，以防止出血。
   5. 确定坐骨神经的骨、三分和常见的性各分枝。
   6. 使用剪刀将横向与胃神经肌肉的中脑头部分离，以暴露骨神经及其分支。
   7. 使用55钳子抓住神经的远端，切它，并尽可能解剖。
   8. 用常见的佩罗内神经重复手术。
   9. 使用钝玻璃棒将三维神经与周围组织分离，注意不要损伤血管，并切开。
   10. 确定中胃神经 （MG） 和横向胃和鞋底 （LGS） 神经。
   11. 使用55个钳子，仔细解剖MG和LGS神经，断开它们与周围组织，但保持它们与各自的肌肉的连接。
   12. 将一块盐水浸泡的棉布放在暴露的神经下。
   13. 关闭手术区域的皮肤。
5. 拉明切除术
   1. 使用21刀片做一个纵向切口从囊到胸椎。
   2. 将皮肤与底层肌肉分开。
   3. 切开胸椎和腰椎旋转过程的两侧的长肌。
   4. 使用钝刃手术刀从脊柱中缩回肌肉，以暴露每个椎骨的横向过程。
   5. 使用钝尖剪刀切割肌肉的肌腱，沿着暴露的脊柱与横向过程相连。如有必要，应用止血剂。
   6. 将 Th13 椎骨识别为带肋骨插入的最低胸段，并使用细的长颈去除从 Th13 到 L2 椎骨的旋转过程和层压，以暴露脊髓的腰部部分。请记住，不要损坏 L3 旋转过程，该过程将用作脊柱稳定固定点。
   7. 拆下 Th12 旋转过程，并尽可能平滑椎体后体表面。
   8. 使用钝解剖技术将肌肉与 Th11 椎骨分离，以创建支架插入点。
   9. 将细盐湿棉布放在裸露的脊髓部分上。
   10. 将大鼠移动到定制的金属框架，带两个平行杆和两个可调节臂，带夹子，以支持和稳定脊柱。

3. 记录和刺激的准备

1. 椎柱固定和神经排列
   1. 将大鼠放在加热垫上的定制框架中，连接到闭环加热系统，使动物体温保持 37 ± 1°C。
   2. 在皮肤下插入心电图电极，并连接到放大器进行心率监测。
   3. 使用皮肤皮瓣，在裸露的脊髓上形成一个深池。
   4. 使用金属夹，通过将夹放在 Th12 横向工艺下方和 L3 旋转工艺中固定椎柱。
   5. 确保椎柱固定并水平排列，然后在椎柱两侧施加多索-心室压力以收回肌肉。
   6. 向池中加注热 （37 °C） 矿物油，并在此温度下保持。
   7. 通过跟腱螺纹 4-0 连结，抬起并伸展操作的左后肢，使脚踝与臀部平起平平。
   8. 使用皮肤皮瓣使一个深池在暴露的三口， Mg 和 LGS 神经.
   9. 向池中加注热 （37 °C） 矿物油。
   10. 将MG和LGS神经放在双极银线刺激电极上，并将它们连接到方形脉冲刺激器。对每个神经使用单独的刺激通道。
2. 表面电极放置
   1. 将银球电极放在外露脊髓的左侧，将参考电极插入背部肌肉，将两个电极连接到差分直流放大器。表面球电极将用于记录来自神经的发量球。
   2. 使用常流刺激器，以 0.1 ms 持续时间的平方脉冲刺激 MG 和 LGS 神经，以 3 Hz 的频率重复，并观察发泡的排球。
   3. 确定神经活化的阈值 （T），在大约 3° 时刺激每个神经T 强度，并记录每个神经的发量振幅。
   4. 移动表面电极rostral并重复该过程，以确定脊柱段，其中排球的振幅是每个神经的最高。确定最大排球位置后，将表面电极移动到与脊髓的安全距离。
3. 肌肉麻痹，形成肺气管，以减少呼吸运动
   1. 用神经肌肉阻滞剂静脉麻痹大鼠，将气管连接到外部呼吸机，符合啮齿动物兼容的上限计（溴化铀的初始剂量为0.4mg=kg-1，每30分钟补充^-10.2mg=kg-1）^-1
   2. 通过调整通风参数（频率、气压_和 流量），监控端潮 CO 2 浓度并保持在 3+u20124% 左右。
   3. 在录音一侧的第 5 条肋骨和第 6 根肋骨之间的皮肤上进行纵向切口。
   4. 使用钝尖剪刀切割覆盖的肌肉，以可视化肋骨之间的成本间空间。
   5. 使用小锋利的剪刀，在间关节肌肉和胸膜中做一个小切口，然后插入钝边尖插入开口，注意不要按肺。
   6. 允许钳子展开或插入小管，以保持气管在整个实验中打开。
   7. 神经肌肉块后，通过检查心电图频率监测麻醉深度，如果心率超过400 bpm，补充麻醉剂。肌肉麻痹和形成肺气管，以减少呼吸运动，这将提高记录稳定性
4. 打开杜拉和皮娅母校
   1. 使用#55钳子，轻轻抬起 dura 母体，然后从 L5 段（玫瑰色）到 L4 段，将其切割。
   2. 使用一对超薄的5SF钳子在覆盖支骨柱的皮娅中，在血管之间，正好在MG或LGS神经的最大发泡水平。
   3. 如有必要，使用小块盐水浸泡和干燥的凝胶泡沫来止血。
5. tsDCS 电极放置
   1. 在大鼠腹部的腹侧皮肤上，在与L4-L5脊髓段位置相对应的腹侧进行小切口。
   2. 用金属夹抓住外露的皮肤皮瓣，作为参考电极。
   3. 将盐水浸泡的海绵放在 Th12 椎骨的后侧。确保海绵尺寸等于有源 tsDCS 电极（直径为 5 mm 的圆形不锈钢板）。
   4. 使用精细操纵器，用有源 tsDCS 电极将海绵按到骨骼上，并确保电极的整个表面均等地按下。
   5. 将参考和有源 tsDCS 电极连接到常电流刺激器单元，能够提供直流电流的连续流量。
6. 微管的制备
   1. 使用微电子拉拔器，准备微电子。
      注:可以使用灯丝和非灯丝电极，但是，请记住，电极的刀柄必须足够长，可以到达腹角，而薄到足以在下降时不压缩脊髓。
      1. 调整拉拔器设置，使进入脊髓的刀柄长约 3 mm，而电极尖端直径不超过 1μ u20122 μm，微电极电阻介于 10 至 20 MΩ 之间。
   2. 用2M钾柠檬酸电解质填充微电极。
   3. 将准备好的微电子支架安装在微操纵器上，允许 1μ u20122 μm 步进运动和立体轴校准。
   4. 将微电极连接到细胞内放大器，将参考电极放置在背部肌肉中。
7. 神经肌肉块后，通过检查心电图频率监测麻醉深度，并补充麻醉剂，使大鼠心率不超过400bpm。

4. 莫托纳龙跟踪和渗透

1. 将发声排球记录电极放回脊髓的背面，在 L6 段的水平上，将排答器记录电极固定到记录场的位置。
2. 以 3 Hz 的频率和 3T 强度的电 0.1 ms 脉冲刺激 MG 和 LGS 神经，激活选定神经内所有 α-motoneurons 的轴星。
3. 将微管驱动到 pia 中选定的贴片中，其平度角度为 15°u201220°（带横向倾斜的尖端）。
4. 降到地表以下后，校准微电位并补偿其电容和电压偏移，并在所有参数稳定时继续穿透脊髓。在刺激各神经时接近专用电机核时，微电极电压微量线将可见莫托龙池的抗浪漫场电位。
5. 以 1\u20122 μm 步数进行微电极穿透，并定期使用细胞内放大器的嗡嗡声功能清除电极尖端的任何残留物。
6. 观察莫托尼龙渗透，其特点是记录的电压痕迹突然超极化，并出现抗浪漫尖峰电位。

5. 记录莫托龙膜和燃烧特性

1. 在细胞内放大器的桥接模式下，通过刺激各自的神经分支，根据抗变色作用潜力的"全无"外观识别莫托龙。记录 20 个后续跟踪，以便以后平均。
2. 实施严格的包含标准，确保高质量数据:静膜电位幅度至少为-50 mV;动作电位振幅大于50 mV，正过冲;膜电位稳定至少5分钟，在记录前。
3. 在细胞内放大器的不连续电流夹紧模式（电流开关速率模式 4–8 kHz）中，使用 0.5 ms 细胞内去极化电流脉冲，在磁体中激发正交作用电位。重复至少 20 次脱机平均。
4. 刺激具有 40 个脉冲 （100 ms） 超极化电流 （1 nA） 的莫托尼龙，以计算细胞输入电阻。
5. 在增加振幅时刺激具有 50 ms 方波脉冲的 motoneuron，以确定 rheobase 值为引出单个峰值所需的极极化电流最小振幅。
6. 注入500ms平方波脉冲的去极化电流，在0.1~2 nA的步调中增加振幅，以唤起莫托龙的有节奏放电。

6. 跨脊柱直流刺激（tsDCS）

1. 在保持莫托龙稳定穿透的同时，通过直流反脊柱应用启动极化过程。根据实验设计调整当前强度和应用时间（例如，0.1 mA 为 15 分钟）。
2. 打开直流后，立即观察莫托龙膜电位。阳极化（有源电极作为阳极）应导致膜电位去极化，而阴极极化（有源电极作为阴极）应引起相反的效果。观察静膜电位对直流刺激的反应变化是否恒定，从而确保电场强度不受影响。
3. 在连续电流应用期间，每隔 5 分钟重复步骤 5.3+u20125.6。
4. 关闭 DC 并继续以 5 分钟间隔重复步骤 5.3+u20125.6，直到录制变得不稳定或包含条件受损。
5. 终止实验，使用静脉注射给药的致命剂量五巴比妥钠（180mg=kg-1^{）对动物实施安乐死}。

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结果

当确保细胞穿透条件稳定时，可以在细胞内记录的基础上计算作用电位参数和若干膜特性。 图1A 提供了细胞内刺激引起的典型正交作用潜力，它符合数据包含的所有标准（至少为-50 mV的静膜电位，峰值振幅高于50 mV，具有正过冲）。可测量动作电位参数，如尖峰振幅、后白化幅度或后白化半衰减时间（AHP-HDT）。大鼠莫托龙中后一个参数的值是区分快速和慢莫托龙（AHP-HDT > 20...

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讨论

如果执行正确，所述方案的手术部分应在大约三小时内完成。在手术过程中，应特别注意保持动物的生理状况，特别是体温和麻醉深度。除了明显的伦理考虑外，缺乏适当的麻醉可能导致神经解剖或拉明切除术期间肢体过度运动，并导致制剂损伤或实验终止。在用微电子穿透脊髓之前使动物瘫痪后，监测麻醉深度和心率以及应用基于动物体重和肺活量的适当通气参数至关重要。任何偏离所需生理?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Durgs and solutions	-	-	-
Atropinum sulfuricum	Polfa Warszawa	-	-
Glucose	Merck	346351	-
NaHCO3	Merck	106329	-
Pancuronium Jelfa	PharmaSwiss/Valeant	-	Neuromuscular blocker
Pentobarbital sodium	Biowet Pu?awy Sp. z o.o	-	Main anesthetic agent
Pottasium citrate	Chempur	6100-05-06	-
Tetraspan	Braun	-	HES solution
Surgical equipment	-	-	-
21 Blade	FST	10021-00	Scalpel blade
Cauterizer	FST	18010-00	-
Chest Tubes	Mila	CT1215	-
Dumont #4 Forceps	FST	11241-30	Muscle forceps
Dumont #5 Forceps	FST	11254-20	Dura forceps
Dumont #5F Forceps	FST	11255-20	Nerve forceps
Dumont #5SF Forceps	FST	11252-00	Pia forceps
Forceps	FST	11008-13	Blunt forceps
Forceps	FST	11053-10	Skin forceps
Hemostat	FST	13013-14	-
Rongeur	FST	16021-14	For laminectomy
Scissors	FST	15000-08	Vein scissors
Scissors	FST	15002-08	Dura scissors
Scissors	FST	14184-09	For trachea cut
Scissors	FST	104075-11	Muscle scissors
Scissors	FST	14002-13	Skin scissors
Tracheal tube	-	-	Custom made
Vein catheter	Vygon	1261.201	-
Vessel cannulation forceps	FST	18403-11	-
Vessel clamp	FST	18320-11	For vein clamping
Vessel Dilating Probe	FST	10160-13	For vein dissection
Sugrgical materials	-	-	-
Gel foam	Pfizer	GTIN 00300090315085	Hemostatic agent
Silk suture 4.0	FST	18020-40	-
Silk suture 6.0	FST	18020-60	-
Equipment	-	-	-
Axoclamp 2B	Molecular devices	discontinued	Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A
CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor	CWE	11-10000	Gas analyzer
Grass S-88	A-M Systems	discontinued	Constant current stimulator
Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe	Harvard Apparatus	507222F	Heating system
ISO-DAM8A	WPI	74020	Extracellular amplifier
Microdrive	-	-	Custom made/replacement IVM/Scientifica
P-1000 Microelectrode puller	Sutter Instruments	P-1000	Microelectrode puller
SAR-830/AP Small Animal Ventilator	CWE	12-02100	Respirator
Support frame	-	-	Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting
Spinal clamps	-	-	Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting
TP-1 DC stimulator	WiNUE	-	tsDCS stimulator
Miscellaneous	-	-	-
1B150-4 glass capillaries	WPI	1B150-4	For microelectrodes production
Cotton wool	-	-	-
flexible tubing	-	-	For respirator and CO2 analyzer connection
MicroFil	WPI	MF28G67-5	For filling micropipettes
Silver wire	-	-	For nerve electrodes