In Vivo Registrazione intracellulare di Motoneuroni Spinali Ratti Identificati dal Tipo durante la stimolazione a corrente diretta trans-spinale

Riepilogo

Questo protocollo descrive la registrazione intracellulare in vivo dei motoneuroni lombari con stimolazione simultanea della corrente diretta trans-spinale. Il metodo ci permette di misurare le proprietà della membrana e di registrare la cottura ritmica dei motoneuroni prima, durante e dopo la polarizzazione anodale o tadale del midollo spinale.

Abstract

La registrazione intracellulare dei motoneuroni spinali in vivo fornisce uno "standard d'oro" per determinare le caratteristiche elettrofisiologiche delle cellule nella rete spinale intatta e contiene vantaggi significativi rispetto alle tecniche classiche di registrazione in vitro o extracellulare. Un vantaggio delle registrazioni intracellulari in vivo è che questo metodo può essere eseguito su animali adulti con un sistema nervoso completamente maturo, e quindi molti meccanismi fisiologici osservati possono essere tradotti in applicazioni pratiche. In questo documento metodologico, descriviamo questa procedura combinata con la stimolazione a corrente costante applicata esternamente, che imita i processi di polarizzazione che si verificano all'interno delle reti neuronali spinali. La stimolazione trans-spinale a corrente diretta (tsDCS) è un metodo innovativo sempre più utilizzato come intervento neuromodulatore nella riabilitazione dopo varie lesioni neurologiche e nello sport. L'influenza di tsDCS sul sistema nervoso rimane poco compresa e i meccanismi fisiologici dietro le sue azioni sono in gran parte sconosciuti. L'applicazione del tsDCS contemporaneamente alle registrazioni intracellulari ci permette di osservare direttamente i cambiamenti delle proprietà della membrana del motoneurone e le caratteristiche della cottura ritmica in risposta alla polarizzazione della rete neuronale spinale, che è fondamentale per la comprensione delle azioni tsDCS. Inoltre, quando il protocollo presentato include l'identificazione del motoneurone rispetto a un muscolo innervato e la sua funzione (flessore contro estensore) così come il tipo fisiologico (veloce contro lento) offre l'opportunità di indagare selettivamente l'influenza del tsDCS sui componenti identificati dei circuiti spinali, che sembrano essere influenzati in modo diverso dalla polarizzazione. La procedura presentata si concentra sulla preparazione chirurgica per le registrazioni intracellulari e la stimolazione con un'enfasi sui passi necessari per ottenere la stabilità di preparazione e la riproducibilità dei risultati. I dettagli della metodologia dell'applicazione tsDCS anodale o catodale sono discussi prestando attenzione alle questioni pratiche e di sicurezza.

Introduzione

La stimolazione a corrente diretta trans spinale (tsDCS) sta guadagnando riconoscimento come metodo potente per modificare l'eccitabilità del circuito spinale in salute e^{malattia 1,2,3}. In questa tecnica, una corrente costante viene passata tra un elettrodo attivo situato sopra i segmenti spinali selezionati, con un elettrodo di riferimento situato sia ventralemente che più rostralmente⁴. Diversi studi hanno già confermato che il tsDCS può essere utilizzato nella gestione di determinate condizioni patologiche, come il dolore^{neuropatico 5}, la spasticità⁶, la lesione del midollo^{spinale 7} o per facilitare la riabilitazione⁸. I ricercatori suggeriscono che il tsDCS evoca alterazioni nella distribuzione degli ioni tra lo spazio intracellulare e lo spazio extracellulare attraverso la membrana cellulare, e questo può facilitare o inibire l'attività neuronale a seconda^{dell'orientamento corrente 9,10,11}. Tuttavia, fino a poco tempo fa, mancava una conferma diretta di questa influenza sui motoneuroni.

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per condurre in vivo la registrazione intracellulare dei potenziali elettrici dai motoneuroni lombari spinali nel ratto anethetizzato con applicazione simultanea di tsDCS, al fine di osservare i cambiamenti nella membrana motoneurone e le proprietà di cottura in risposta alla polarizzazione anodale o cathodale della rete neuronale spinale. Le registrazioni intracellulari aprono diverse aree di indagine delle proprietà dei neuroni, non disponibili per le tecniche extracellulari utilizzate in^{precedenza 9,12}. Ad esempio, è possibile misurare con precisione la risposta di tensione della membrana del motoneurone al flusso di corrente diretta indotto da tsDCS, indicare la soglia di tensione per la generazione di picchi o analizzare i potenziali parametri di azione. Inoltre, questa tecnica ci permette di determinare le proprietà della membrana passiva del motoneurone, come la resistenza all'ingresso, e di osservare la relazione tra la corrente di stimolazione intracellulare e la frequenza di cottura ritmica dei motoneuroni. L'identificazione antidromica del motoneurone registrato, basata sulla stimolazione dei nervi identificati dal punto di vista funzionale (cioè i nervi che forniscono efferenti ai flessori o agli estensori) ci permette di identificare inoltre i tipi di unità motorie innervate (veloce o lento), il che offre l'opportunità di verificare se la polarizzazione influenza in modo diverso i singoli elementi del sistema neuronale spinale maturo. A causa di un'estesa chirurgia che precede la registrazione e di elevati requisiti di stabilità e affidabilità delle registrazioni, questa tecnica è altamente impegnativa ma consente una valutazione diretta e a lungo termine delle caratteristiche elettrofisiologiche di un motoneurone: prima, durante e dopo l'applicazione di tsDCS, che è fondamentale per determinare sia le sue azioni acute che gli effetti persistenti¹³. Come un motoneuron attiva direttamente le fibre muscolari extrafuso^{14 e} prende parte al controllo di feedback di una contrazione muscolare e sviluppato forza^15,16 qualsiasi influenza osservata di tsDCS sull'unità motoria o le proprietà contraili muscolari possono essere collegati a modulazioni di motoneurone eccitabilità o caratteristiche di cottura.

Protocollo

Tutte le procedure connesse al presente protocollo sono state accettate dalle autorità competenti (ad esempio, comitato etico locale) e seguono le norme nazionali e internazionali in materia di benessere e gestione degli animali.

NOTA: Ogni partecipante coinvolto nella procedura deve essere adeguatamente addestrato nelle procedure chirurgiche di base e deve avere una licenza valida per l'esecuzione di esperimenti sugli animali.

1. Anestesia e premedicazione

1. Anestesizzare un ratto con iniezioni intraperitoneali di pentobarbital di sodio (una dose iniziale di 60^{mg-kg -1} per i ratti Wistar maschi di 6 mesi del peso di 400-u2012550g).
   NOTA: Questo protocollo non è limitato al ceppo indicato, al sesso o all'età dei ratti. Inoltre, l'anestesia alternativa come il mix di ketamina-xylazina, l'alfa-cloalosa o il fentanil-midazolam-medetomidina può essere utilizzata se più adatta a diversi obiettivi di ricerca o quando richiesto dal comitato etico.
2. Dopo circa 5 minuti, controllare la profondità dell'anestesia pizzicando il dito dell'arto posteriore del ratto con pince smussate. Procedere con i passaggi successivi del protocollo solo quando non viene osservata alcuna azione riflessiva.
3. Iniettare 0,05 mL di atropina sottocutaneamente al fine di ridurre la produzione di muco dopo l'intubazione.
4. Iniettare sottocutaneamente 5 mL di tampone fosfato contenente 4% soluzione di glucosio, NaHCO₃ (1 %) e gelatina (14%). Questo buffer sarà assorbito dai vasi cutanei durante un esperimento e contribuirà a mantenere l'equilibrio dei fluidi.
5. Durante l'intervento, controllare periodicamente l'animale per le azioni di riflesso e integrare l'anestesia, se necessario (10^{mg-kg -1-1 -1}di pentobarbital di sodio).

2. Chirurgia

1. Preparare l'animale per il trattamento chirurgico radendo la pelliccia sulla parte dorsale dell'hindlimb sinistro, dalla caviglia all'anca, dalla parte posteriore, dalla coda ai segmenti toracci alti, il lato sinistro del torace e il lato ventrale della zona del collo sopra lo sterno
2. Posizionamento della linea endovenosa
   1. Posizionare il ratto sulla schiena su un tampone riscaldante ad anello chiuso (e fissarlo con fissazioni degli arti).
   2. Utilizzando una lama 21, fare un taglio longitudinale attraverso la pelle da uno sterno a un mento.
   3. Tenere la pelle con le finte e separarla dal tessuto sottostante.
   4. Utilizzando tecniche di dissezione smussate espongono la vena giugulare destra. Sezionare attentamente la vena dai tessuti circostanti.
   5. Individuare la parte della vena senza punti di diramazione, scivolare due legature 4-0 sotto di esso.
   6. Fare un nodo sciolto sull'estremità prossimale del segmento non ramificante precedentemente identificato della vena e un nodo sciolto sull'estremità distale di questo segmento della vena. Bloccare la vena prossimale al cuore, e poi liga la parte distale della vena.
   7. Utilizzando le forbici dell'iride, fare un'incisione tra il morsetto e la legatura distante. Tenere un lembo della vena e introdurre un catetere pre-riempito fino al punto in cui è bloccato dal morsetto.
   8. Tenendo la vena e il catetere insieme con le forcetti, rimuovere il morsetto e spingere il catetere diversi millimetri nella vena. Fissare entrambe le estremità del catetere alla vena e aggiungere un ulteriore punto di fissazione alla pelle.
3. Introduzione del tubo tracheale
   1. Utilizzando le forcezze smussate separano le due ghiandole mandibolari che coprono i muscoli sternohyoidi. Separare i muscoli sternoid alla linea mediana per esporre la trachea.
   2. Scivolare tre legature 4-0 sotto la trachea, quindi fare due nodi sotto il punto di inserimento del tubo tracheale e un nodo sopra.
   3. Individuare la cartilagine cricoide della la renace e fare un'incisione sotto la terza cartilagine tracheale.
   4. Inserire un tubo tracheale lungo la trachea e fissare il tubo in posizione con legature pre-preparate, quindi aggiungere un'ulteriore legatura alla pelle.
   5. Posizionare un piccolo pezzo di cotone sopra i muscoli separati e suturare la pelle sopra l'area azionata.
4. Dissezione dei nervi degli arti posteriori
   1. Utilizzando 21 lama, fare un taglio longitudinale sul lato posteriore dell'arto posteriore sinistro, dal tendine d'Achille all'anca.
   2. Afferrare la pelle con le finzioni, e utilizzando tecniche di dissezione smussata separare la pelle dai muscoli sottostanti su entrambi i lati dell'incisione.
   3. Individuare la fossa popliteale nella parte posteriore dell'articolazione del ginocchio, che è coperto dal muscolo femoris bicipite, e utilizzando le forbici fare un taglio tra la parte anteriore e posteriore di questo muscolo.
   4. Muovendosi verso l'alto tagliare due teste del bicipite femoris tutta la strada fino all'anca per esporre il nervo sciatico. Cauterizzare come necessario per prevenire il sanguinamento.
   5. Identificare i rami surali, tibiali e comuni peroneali del nervo sciatico.
   6. Utilizzando le forbici, separare la testa laterale dalla testa mediale del muscolo gastrocnemio per esporre il nervo tibiale e i suoi rami.
   7. Utilizzando 55 forceps afferrare l'estremità distale del nervo surale, tagliarlo distaamente e sezionare il più possibile.
   8. Ripetere la procedura con il nervo peroneale comune.
   9. Utilizzando un'asta di vetro smussata separare il nervo tibiale dai tessuti circostanti, facendo attenzione a non danneggiare i vasi sanguigni, e tagliarlo distally.
   10. Identificare il gastrocnemius mediale (MG) e i nervi a gastrocnemius e soleus (LGS) laterale.
   11. Utilizzando 55 forcelle, sezionare attentamente i nervi MG e LGS, scollegandoli dai tessuti circostanti, ma mantenendo la loro connessione ai rispettivi muscoli.
   12. Mettere un pezzo di cotone imbevuto di salina sotto i nervi esposti.
   13. Chiudere la pelle sopra l'area azionata.
5. Laminectomy
   1. Utilizzando 21 lama fare un'incisione longitudinale dal sacro fino alle vertebre toracica.
   2. Separare la pelle dai muscoli sottostanti.
   3. Tagliare il muscolo longissimus su entrambi i lati dei processi toracica e lombare spinosa.
   4. Utilizzando bisturi dai bordi smussati ritraggono i muscoli dalla colonna vertebrale per esporre i processi trasversali di ogni vertebra.
   5. Utilizzando forbici punta smussata tagliare i tendini dei muscoli collegati ai processi trasversali lungo la colonna vertebrale esposta. Se necessario, applicare agenti emostatici.
   6. Identificare la vertebra Th13 come il segmento toracico più basso con inserimento delle costole e utilizzando rongeurs fini rimuovere i processi spinosi e laminae da Th13 a L2 vertebre per esporre segmenti lombari del midollo spinale. Ricordarsi di non danneggiare il processo spinoso L3 che verrà utilizzato come punto di fissazione per la stabilizzazione della colonna vertebrale.
   7. Rimuovere il processo spinoso Th12 e lisciare la superficie dorsale vertebra il più possibile.
   8. Utilizzando tecniche di dissezione smussate separano i muscoli dalla vertebra Th11 per creare punti di inserimento del supporto.
   9. Posizionare il sottile batuffolo di cotone saline sopra i segmenti del midollo spinale esposti.
   10. Spostare il ratto sul telaio metallico su misura con due barre parallele e due bracci regolabili con morsetti per sostenere e stabilizzare la colonna vertebrale.

3. Preparazione per la registrazione e la stimolazione

1. Fissazione della colonna vertebrale e disposizione del nervo
   1. Posizionare il ratto nel telaio su misura su una pastiglie riscaldante, collegato al sistema di riscaldamento a circuito chiuso per mantenere la temperatura corporea dell'animale a 37 x 1oC.
   2. Inserire elettrodi ECG sotto la pelle e collegarsi a un amplificatore per il monitoraggio della frequenza cardiaca.
   3. Utilizzando i lembi della pelle, formare una piscina profonda sul midollo spinale esposto.
   4. Utilizzando morsetti metallici, fissare la colonna vertebrale mettendo morsetti sotto i processi trasversali Th12 e al processo spinoso L3.
   5. Assicurarsi che la colonna vertebrale sia fissata e disposta orizzontalmente, quindi applicare la pressione dorso-ventrale su entrambi i lati della colonna per ritrarre i muscoli.
   6. Riempire la piscina con olio minerale caldo (37 gradi centigradi) e mantenerla a questa temperatura.
   7. Infilare una legatura 4-0 attraverso il tendine d'Achille, sollevare e allungare l'arto posteriore sinistro operato in modo che la caviglia sia livellata con l'anca.
   8. Utilizzando i lembi della pelle fare una piscina profonda sopra il tibial esposto, mg e nervi LGS.
   9. Riempire la piscina con olio minerale caldo (37 gradi centigradi).
   10. Posizionare i nervi MG e LGS su elettrodi stimolanti bipolari filo d'argento e collegarli a uno stimolatore a impulsi quadrati. Utilizzare canali di stimolazione separati per ogni nervo.
2. Posizionamento degli elettrodi superficiali
   1. Posizionare un elettrodo a sfera d'argento sul lato caudal sinistro del midollo spinale esposto, con un elettrodo di riferimento inserito nei muscoli della schiena, e collegare entrambi gli elettrodi all'amplificatore MDD differenziale. L'elettrodo della sfera di superficie sarà utilizzato per registrare raffiche afferenti dai nervi.
   2. Utilizzando uno stimolatore a corrente costante, stimolare i nervi MG e LGS con impulsi quadrati di durata di 0,1 ms, ripetuti a una frequenza di 3 Hz, e osservare raffiche afferenti.
   3. Determinare la soglia (T) per l'attivazione del nervo, stimolare ogni nervo a circa 3 Intensità T, e registrare l'ampiezza di afferente volley per ogni nervo.
   4. Spostare l'elettrodo superficiale rostrale e ripetere la procedura per identificare i segmenti spinali in cui le ampiezze delle raffiche sono le più alte per ogni nervo. Dopo aver determinato la posizione massima della raffica, spostare l'elettrodo di superficie a una distanza di sicurezza dal midollo spinale.
3. Paralisi muscolare e formazione di uno pneumotorace al fine di ridurre i movimenti respiratori
   1. Paralizzare il ratto per via endovenosa con un bloccante neuromuscolare e collegare il tubo tracheale ad un ventilatore esterno in linea con un capnometro compatibile con i roditori (bromuro di pancuronio, ad una dose iniziale di 0,4^{mg-kg -1}, integrato ogni 30 min in dosi di 0,2^{mg-kg -1})
   2. Monitorare la concentrazione di CO₂ di marea finale e mantenerla a circa il 3-u20124% regolando i parametri di ventilazione (frequenza, pressione dell'aria e volumi di flusso).
   3. Fare un'incisione longitudinale nella pelle tra la 5a e la 6a costola su un lato della registrazione.
   4. Utilizzando forbici a punta smussata tagliare i muscoli sovrasto per visualizzare lo spazio intercostale tra le costole.
   5. Utilizzando piccole forbici affilate, fare una piccola incisione nei muscoli intercostali e nella pleura, quindi inserire una punta di un bordo smussato forza nell'apertura, facendo attenzione a non premere sui polmoni.
   6. Consentire alle forcep di espandersi o inserire un piccolo tubo per mantenere lo pneumotorace aperto per tutta l'esperimento.
   7. Dopo il blocco neuromuscolare, monitorare la profondità dell'anestesia controllando la frequenza ECG e integrare l'agente anestetico se la frequenza cardiaca supera i 400 bpm. Paralisi muscolare e formazione di uno pneumotorace al fine di ridurre i movimenti respiratori, che migliorerà la stabilità di registrazione
4. Apertura della dura e pia mater
   1. Utilizzando #55, sollevare delicatamente la dura mater, e tagliarla caudally dal segmento L5, rostralmente fino al segmento L4.
   2. Utilizzando un paio di forceppa 5SF ultra-sottili fare un piccolo cerotto nella pia che copre la colonna dorsale, tra i vasi sanguigni, esattamente al livello della massima afferente volley dal mg o il nervo LGS.
   3. Utilizzare piccoli pezzi di schiuma di gel salina imbevuta e secca per bloccare il sanguinamento, se necessario.
5. Posizionamento degli elettrodi tsDCS
   1. Fare una piccola incisione nella pelle sul lato ventrale di un addome del ratto a livello rostro-caudal corrispondente alla posizione dei segmenti spinali L4-L5.
   2. Afferra il lembo di pelle esposto con una clip metallica che servirà come elettrodo di riferimento.
   3. Posizionare una spugna imbevuta di salina sul lato dorsale della vertebra Th12. Assicurarsi che la dimensione della spugna sia uguale a quella di un elettrodo tsDCS attivo (piastra in acciaio inossidabile a forma di cerchio di 5 mm di diametro).
   4. Utilizzando un manipolatore fine, premere la spugna con un elettrodo tsDCS attivo all'osso e assicurarsi che l'intera superficie dell'elettrodo sia premuta allo stesso modo.
   5. Collegare sia gli elettrodi tsDCS di riferimento che attivi a un'unità stimolatore a corrente costante, in grado di fornire un flusso continuo di corrente diretta.
6. Preparazione delle micropipette
   1. Utilizzando un puller microelettrodo, preparare un microelettrode.
      NOTA: Sia gli elettrodi filamentali che gli elettrodi non filamentali possono essere utilizzati, tuttavia, ricordate che il gambo dell'elettrodo deve essere abbastanza lungo da raggiungere il corno ventrale pur essendo abbastanza sottile da non comprimere il midollo spinale durante la discesa.
      1. Regolare l'impostazione dell'e tiratore in modo che il gambo che entra nel midollo spinale sia lungo circa 3 mm, mentre la punta dell'elettrodo non è superiore a 1,20122 m di diametro e la resistenza ai microelettrodi è compresa tra 10 e 20 MΩ.
   2. Riempire i microelettrodi con 2M elettrolita di citrato di potassio.
   3. Montare il microelettrode preparato sul micromanipatore, consentendo il movimento di stepping di 1,20122 m e la calibrazione stereotassica.
   4. Collegare il microelettrodo all'amplificatore intracellulare con l'elettrodo di riferimento posto nei muscoli della schiena.
7. Dopo il blocco neuromuscolare, monitorare la profondità dell'anestesia controllando la frequenza ECG e integrare l'agente anestetico in modo che la frequenza cardiaca del ratto non superi i 400 bpm.

4. Tracciamento e penetrazione Motoneuron

1. Posizionare l'elettrodo di registrazione della raffica afferente sulla superficie dorsale del midollo spinale, caudally alla posizione del sito di registrazione, al livello del segmento L6.
2. Stimolare i nervi MG e LGS con impulsi elettrici di 0,1 ms ad una frequenza di 3 Hz e intensità 3T, per attivare tutti gli assoni di alfa-motoneuroni all'interno di un nervo selezionato.
3. Guidare la micropipetta in una patch selezionata nel pia con un angolo medio-laterale di 15-u201220 (con una punta diretta lateralmente).
4. Dopo essere sceso sotto la superficie, calibrare il microelettrode e compensare la sua capacità e l'offset di tensione, e continuare la penetrazione del midollo spinale quando tutti i parametri sono stabili. Un potenziale di campo antidromico della piscina motoneurone sarà visibile alla traccia di tensione microelettrode mentre si avvicina un nucleo motore dedicato durante la stimolazione del rispettivo nervo.
5. Procedere alla penetrazione con il microelettrode a 1,20122 gradini di m e utilizzare periodicamente la funzione di ronzio dell'amplificatore intracellulare per eliminare la punta dell'elettrodo da qualsiasi residuo.
6. Osservare la penetrazione del motoneurone che sarà caratterizzata da un'improvvisa iperpolarizzazione della traccia di tensione registrata e dalla comparsa di un potenziale di picco antidromatico.

5. Registrazione della membrana del motoneurone e delle proprietà di cottura

1. In una modalità ponte dell'amplificatore intracellulare, identificare il motoneurone sulla base dell'aspetto "tutto o niente" del potenziale di azione antidromica stimolando i rispettivi rami nervosi. Registrare 20 tracce successive per una media successiva.
2. implementare un rigoroso criterio di inclusione per garantire dati di alta qualità: potenziale di membrana a riposo di almeno -50 mV in ampiezza; l'ampiezza potenziale dell'azione superiore a 50 mV, con un superamento positivo; potenziale di membrana stabile per almeno 5 minuti prima della registrazione.
3. In una modalità discontinua di corrente (modalità di commutazione corrente 4-8 kHz) dell'amplificatore intracellulare, evoca un potenziale di azione ortodromica in un motoneurone utilizzando impulsi di corrente depolarizzazione intracellulare di 0,5 ms. Ripetere almeno 20 volte per la media offline.
4. Stimolare un motoneurone con 40 impulsi brevi (100 ms) di corrente iperpolare (1 nA) al fine di calcolare la resistenza all'ingresso cellulare.
5. Stimolare un motoneurone con impulsi di onde quadrate di 50 ms a quantità crescenti per determinare il valore di reobase come l'ampiezza minima della corrente di depolarizzazione necessaria per suscitare un singolo picco.
6. Iniettare 500 ms impulsi ad onda quadra di corrente depolarizzazione, ad amplificazione crescente in gradini di 0,1–2 nA per evocare scariche ritmiche di motoneuroni.

6. Stimolazione a corrente diretta trans spinale (tsDCS)

1. Pur mantenendo una penetrazione stabile del motoneurone, avviare la procedura di polarizzazione mediante l'applicazione trans-spinale della corrente diretta. Regolare l'intensità corrente e il tempo di applicazione al progetto dell'esperimento (ad esempio, 0,1 mA per 15 min).
2. Subito dopo l'accensione del DC, osservare il potenziale della membrana del motoneurone. La polarizzazione anodale (l'elettrodo attivo come anodo) dovrebbe portare alla depolarizzazione del potenziale della membrana, mentre la polarizzazione cathodale (l'elettrodo attivo come un catodo) dovrebbe evocare un effetto opposto. Osservare se un cambiamento nel potenziale di membrana a riposo in risposta alla stimolazione DC è costante, il che assicura che l'intensità del campo elettrico non sia influenzata.
3. Durante l'applicazione a corrente continua, ripetere i passaggi 5.3-u20125.6 in intervalli di 5 minuti.
4. Spegnere il controller di dominio e continuare a ripetere i passaggi 5.3-u20125.6 in intervalli di 5 minuti fino a quando le registrazioni diventano instabili o i criteri di inclusione vengono compromessi.
5. Terminare l'esperimento ed eutanasializzare l'animale utilizzando la somministrazione endovenosa di una dose letale di sodio pentobarbitale (180^{mg-kg -1}).

Risultati

I parametri dei potenziali di azione e diverse proprietà della membrana possono essere calcolati sulla base di registrazioni intracellulari quando sono garantite condizioni stabili di penetrazione cellulare. La figura 1A presenta un tipico potenziale di azione ortodromica evocato dalla stimolazione intracellulare, che soddisfa tutti i criteri per l'inclusione dei dati (il potenziale di membrana a riposo di almeno -50 mV e un'ampiezza di picco superiore a 50 mV, con un superamento positivo)....

Discussione

Se eseguita correttamente, la parte chirurgica del protocollo descritto deve essere completata entro circa tre ore. Si dovrebbe fare particolare attenzione nel mantenere condizioni fisiologiche stabili di un animale durante l'intervento chirurgico, in particolare la temperatura corporea e la profondità dell'anestesia. A parte ovvie considerazioni etiche, la mancanza di un'anestesia adeguata può provocare eccessivi movimenti degli arti durante la dissezione nervosa o la laminectomia e portare a danni alla preparazione o...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Durgs and solutions	-	-	-
Atropinum sulfuricum	Polfa Warszawa	-	-
Glucose	Merck	346351	-
NaHCO3	Merck	106329	-
Pancuronium Jelfa	PharmaSwiss/Valeant	-	Neuromuscular blocker
Pentobarbital sodium	Biowet Pu?awy Sp. z o.o	-	Main anesthetic agent
Pottasium citrate	Chempur	6100-05-06	-
Tetraspan	Braun	-	HES solution
Surgical equipment	-	-	-
21 Blade	FST	10021-00	Scalpel blade
Cauterizer	FST	18010-00	-
Chest Tubes	Mila	CT1215	-
Dumont #4 Forceps	FST	11241-30	Muscle forceps
Dumont #5 Forceps	FST	11254-20	Dura forceps
Dumont #5F Forceps	FST	11255-20	Nerve forceps
Dumont #5SF Forceps	FST	11252-00	Pia forceps
Forceps	FST	11008-13	Blunt forceps
Forceps	FST	11053-10	Skin forceps
Hemostat	FST	13013-14	-
Rongeur	FST	16021-14	For laminectomy
Scissors	FST	15000-08	Vein scissors
Scissors	FST	15002-08	Dura scissors
Scissors	FST	14184-09	For trachea cut
Scissors	FST	104075-11	Muscle scissors
Scissors	FST	14002-13	Skin scissors
Tracheal tube	-	-	Custom made
Vein catheter	Vygon	1261.201	-
Vessel cannulation forceps	FST	18403-11	-
Vessel clamp	FST	18320-11	For vein clamping
Vessel Dilating Probe	FST	10160-13	For vein dissection
Sugrgical materials	-	-	-
Gel foam	Pfizer	GTIN 00300090315085	Hemostatic agent
Silk suture 4.0	FST	18020-40	-
Silk suture 6.0	FST	18020-60	-
Equipment	-	-	-
Axoclamp 2B	Molecular devices	discontinued	Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A
CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor	CWE	11-10000	Gas analyzer
Grass S-88	A-M Systems	discontinued	Constant current stimulator
Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe	Harvard Apparatus	507222F	Heating system
ISO-DAM8A	WPI	74020	Extracellular amplifier
Microdrive	-	-	Custom made/replacement IVM/Scientifica
P-1000 Microelectrode puller	Sutter Instruments	P-1000	Microelectrode puller
SAR-830/AP Small Animal Ventilator	CWE	12-02100	Respirator
Support frame	-	-	Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting
Spinal clamps	-	-	Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting
TP-1 DC stimulator	WiNUE	-	tsDCS stimulator
Miscellaneous	-	-	-
1B150-4 glass capillaries	WPI	1B150-4	For microelectrodes production
Cotton wool	-	-	-
flexible tubing	-	-	For respirator and CO2 analyzer connection
MicroFil	WPI	MF28G67-5	For filling micropipettes
Silver wire	-	-	For nerve electrodes