Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

توفر هذه المقالة منهجية مفصلة لتفكك الأنسجة ونهج التجزئة الخلوية التي تسمح بإثراء الخلايا الظهارية القابلة للحياة من المناطق القريبة والبعيدة من الرئة البشرية. هنا يتم تطبيق هذه الأساليب للتحليل الوظيفي للخلايا السلفية الظهارية الرئوية من خلال استخدام نماذج ثقافة العضوية 3D.

Abstract

تعمل النماذج العضوية الظهارية كأدوات قيمة لدراسة البيولوجيا الأساسية لنظام الأعضاء ونمذجة الأمراض. عندما تنمو كمواد عضوية ، يمكن للخلايا السلفية الظهارية أن تجدد نفسها وتولد ذرية متمايزة تظهر وظائف خلوية مشابهة لتلك الخاصة بنظيراتها في الجسم الحي . هنا نصف بروتوكول خطوة بخطوة لعزل الأسلاف الخاصة بالمنطقة عن الرئة البشرية وتوليد ثقافات عضوية 3D كأداة تجريبية والتحقق من الصحة. نحن نحدد المناطق القريبة والبعيدة من الرئة بهدف عزل الخلايا السلفية الخاصة بالمنطقة. استخدمنا مزيجا من التفكك الأنزيمي والميكانيكي لعزل الخلايا الكلية عن الرئة والقصبة الهوائية. ثم تم تقسيم خلايا السلف المحددة من الخلايا الأصلية القريبة أو البعيدة باستخدام فرز الخلايا المرتبطة بالتألق (FACS) استنادا إلى علامات السطح الخاصة بنوع الخلية ، مثل NGFR لفرز الخلايا القاعدية و HTII-280 لفرز الخلايا السنخية من النوع الثاني. تم استخدام السلف القاعدية أو السنخية المعزولة من النوع الثاني لتوليد ثقافات عضوية 3D. شكل كل من السلف البعيد والقريب عضويات ذات كفاءة تشكيل مستعمرة بنسبة 9-13٪ في المنطقة البعيدة و 7-10٪ في المنطقة القريبة عند طلاء 5000 خلية / بئر في اليوم 30. حافظت المواد العضوية البعيدة على خلايا HTII-280 + السنخية من النوع الثاني في الثقافة بينما تميزت المواد العضوية القريبة إلى خلايا هدبية وإفرازية بحلول اليوم 30. يمكن استخدام هذه الثقافات العضوية 3D كأداة تجريبية لدراسة بيولوجيا الخلية من ظهارة الرئة والتفاعلات الوسيطة الظهارية ، وكذلك لتطوير والتحقق من صحة الاستراتيجيات العلاجية التي تستهدف الخلل الظهاري في المرض.

Introduction

يمكن تقسيم المساحات الهوائية للجهاز التنفسي البشري على نطاق واسع إلى مناطق موصلة وتنفسية تتوسط في نقل الغازات وتبادلها اللاحق عبر الحاجز الظهاري الوعائي الدقيق ، على التوالي. تشمل الشعب الهوائية الموصلة القصبة الهوائية والشعب الهوائية والقصيبات الهوائية والقصيبات الطرفية ، في حين تشمل مجالات الهواء التنفسية القصيبات التنفسية والقنوات السنخية والحويصلات الهوائية. تتغير البطانة الظهارية لهذه المجالات الجوية في التركيب على طول المحور القريب والبعيد لاستيعاب المتطلبات الفريدة لكل منطقة متميزة وظيفيا. تتكون الظهارة الزائفة الطبقية للممرات الهوائية القصبية الهوائية من ثلاثة أنواع رئيسية من الخلايا ، القاعدية والإفرازية والهدبية ، بالإضافة إلى أنواع الخلايا الأقل وفرة بما في ذلك الفرشاة والغدد الصماء العصبية والخلايا الأيونية1،2،3. تؤوي الشعب الهوائية القصبية أنواعا من الخلايا الظهارية المتشابهة من الناحية المورفولوجية ، على الرغم من وجود فروق في وفرتها وخصائصها الوظيفية. على سبيل المثال ، الخلايا القاعدية أقل وفرة داخل الشعب الهوائية القصبية ، وتشمل الخلايا الإفرازية نسبة أكبر من خلايا النادي مقابل الخلايا المصلية والكأسية التي تسود في الشعب الهوائية القصبية الهوائية.  تشمل الخلايا الظهارية في المنطقة التنفسية نوعا من الخلايا المكعبة غير المحددة بشكل جيد في القصيبات التنفسية ، بالإضافة إلى الخلايا السنخية من النوع الأول (ATI) والنوع الثاني (ATII) من القنوات السنخية والحويصلات الهوائية 1,4.

يتم وصف هوية أنواع الخلايا الجذعية الظهارية والسلف التي تساهم في الحفاظ على الظهارة وتجديدها في كل منطقة بشكل غير كامل ويتم استنتاجها إلى حد كبير من الدراسات التي أجريت على النماذج الحيوانية5،6،7،8. أظهرت الدراسات التي أجريت على الفئران أن الخلايا القاعدية في الشعب الهوائية الزائفة ، أو الخلايا النادية للممرات الهوائية القصيبية أو خلايا ATII في الظهارة السنخية ، تعمل كخلايا جذعية ظهارية بناء على القدرة على التجديد الذاتي غير المحدود والتمايز متعدد القدرات 7,9,10,11,12 . على الرغم من عدم القدرة على إجراء دراسات تتبع النسب الوراثي لتقييم جذع أنواع الخلايا الظهارية الرئوية البشرية ، فإن توافر نماذج الثقافة العضوية لتقييم الإمكانات الوظيفية للخلايا الجذعية الظهارية والسلف يوفر أداة للدراسات المقارنة بين الفأر والإنسان13،14،15،16،17.

نحن نصف طرق عزل أنواع الخلايا الظهارية من مناطق مختلفة من الرئة البشرية وثقافتها باستخدام نظام عضوي 3D لتلخيص أنواع الخلايا الإقليمية. تم تطوير طرق مماثلة للتحليل الوظيفي ونمذجة الأمراض للخلايا الظهارية من أنظمة الأعضاء الأخرى18،19،20،21. توفر هذه الطرق منصة لتحديد الخلايا السلفية الظهارية الإقليمية ، لإجراء دراسات ميكانيكية تبحث في تنظيمها وبيئتها الدقيقة ، وتمكين نمذجة الأمراض واكتشاف الأدوية. على الرغم من أن الدراسات التي أجريت على الخلايا السلفية الظهارية الرئوية التي أجريت في النماذج الحيوانية يمكن أن تستفيد من التحليل ، سواء في الجسم الحي أو في المختبر ، إلا أن الأفكار حول هوية الخلايا السلفية الظهارية للرئة البشرية كانت تعتمد إلى حد كبير على الاستقراء من الكائنات الحية النموذجية. على هذا النحو ، توفر هذه الطرق جسرا لربط هوية وسلوك أنواع الخلايا الظهارية للرئة البشرية مع دراساتها التي تبحث في تنظيم الخلايا الجذعية / السلفية.

Protocol

تم الحصول على أنسجة الرئة البشرية من متبرعين متوفين بالأنسجة وفقا لإجراءات الموافقة التي طورها المعهد الدولي لتقدم الطب (IIAM) ووافق عليها مجلس المراجعة الداخلية لمركز Cedars-Sinai الطبي.

1. معالجة الأنسجة لعزل خلايا الرئة من مناطق القصبة الهوائية أو القصبات الهوائية الصغيرة / المتني (الشعب الهوائية الصغيرة والحويصلات الهوائية)

  1. إعداد وتعقيم جميع أدوات التشريح والأواني الزجاجية والحلول المناسبة قبل يوم واحد من عزل الخلايا.
  2. عند تلقي أنسجة الرئة ، حدد وفصل المناطق القريبة والبعيدة. تعتبر القصبة الهوائية والشعب الهوائية "قريبة". لأغراض هذا البروتوكول ، يتم فصل القصبة الهوائية والأجيال 2-3 الأولى من الشعب الهوائية واستخدامها لعزل ظهارة مجرى الهواء "القريبة". ولأغراض هذا البروتوكول، تعتبر الممرات الهوائية الصغيرة التي يبلغ قطرها 2 مم أو أقل والأنسجة المتنية المحيطة بها ظهارة رئوية "بعيدة" (الشكل 1 ألف).
    ملاحظة: ينبغي تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على معالجة أنسجة الرئة البشرية في خزانة السلامة الأحيائية باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة.

2. إثراء والإعداد الفرعي للمجرى الهوائي الصغير والخلايا السلفية الظهارية السنخية من أنسجة الرئة البعيدة

  1. إعداد الأنسجة البعيدة
    1. ضع أنسجة الرئة البعيدة في طبق بتري معقم (150 × 15 مم). نرد الأنسجة إلى ما يقرب من 1 سم3 قطع وتوضع في أنبوب نظيف 50 مل.
    2. اغسل المنديل 3x باستخدام HBSS المبرد ، وتخلص من غسل HBSS في كل مرة لإزالة الدم وسوائل البطانة الظهارية.
    3. ضع المنديل في طبق بتري جديد وجففه بمناديل معقمة مضادة للوبر. باستخدام الملقط والمقص ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من غشاء الجنب الحشوي (غشاء شفاف دقيق يغطي سطح الرئة).
    4. استخدم المقص لتقطيع الأنسجة إلى قطع قطرها حوالي 2 مم. انقل المناديل المفرومة إلى طبق بتري نظيف وقم بتقطيعها إلى حجم تقريبي يبلغ 1 مم باستخدام شفرة حلاقة معقمة من جانب واحد.
  2. هضم الإنزيم
    ملاحظة: محلول مخزون الليبراز هو 5 ملغ / مل (100x) ومخزون DNase هو 2.5 ملغ / مل (100x) (جدول المواد).
    1. أضف 50 ميكروغرام / مل ليبراز و 25 ميكروغرام / مل DNase إلى HBSS معقمة في أنبوب مخروطي 50 مل.
    2. انقل ما يقرب من 2-3 جم من الأنسجة المفرومة إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل مع 25 مل من HBSS ، يحتوي على Liberase و DNase. احتضن لمدة 40-60 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز مستمر باستخدام خلاط مضبوط عند 900 دورة في الدقيقة. بعد 30 دقيقة من الحضانة ، يتم هضم الأنسجة الثلاثية باستخدام حقنة سعة 30 مل بدون إبرة لتجنب تكوين كتل والاستمرار في الحضانة.
      ملاحظة: يمكن أن يختلف وقت الحضانة مع الإنزيمات اعتمادا على نوع أو حالة الأنسجة. على سبيل المثال ، يستغرق الهضم الأنزيمي للأنسجة الطبيعية حوالي 45 دقيقة. ومع ذلك ، يمكن أن تتطلب الأنسجة الليفية من عينات التليف الرئوي مجهول السبب وقت حضانة أطول يصل إلى 60 دقيقة. لذلك ، راقب الأنسجة بعناية خلال هذه الخطوة لمنع تلف علامات السطح ، وهو أمر بالغ الأهمية ل FACS.
  3. عزل خلية واحدة
    1. قم بمضاعفة الأنسجة عن طريق سحب 5x من خلال إبرة 16 G مثبتة على حقنة 30 مل. اسحب تعليق الأنسجة إلى ماصة واسعة التجويف ومر عبر سلسلة من مصافي الخلايا (500 ميكرومتر ، 300 ميكرومتر ، 100 ميكرومتر ، 70 ميكرومتر ، 40 ميكرومتر) تحت ضغط التفريغ. اغسل المصفاة ب 20 مل من المخزن المؤقت HBSS+ لجمع الخلايا المتبقية. يمكن العثور على وصفة المخزن المؤقت HBSS + في جدول المواد.
    2. أضف حجما متساويا من المخزن المؤقت HBSS+ ، بعد 45 دقيقة إلى الترشيح لمنع نشاط Liberase ومنع الإفراط في الهضم.
    3. تترشح أجهزة الطرد المركزي عند 500 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة والتخلص بعناية من supernatant. أضف 1 مل من المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء (RBC) إلى الكريات ، وهز الأنبوب بلطف لإزاحة الكريات واحتضنها على الثلج لمدة دقيقة واحدة.
      ملاحظة: يعتمد المقدار والوقت في محلول تحلل RBC على حجم الكرية. من المهم الحفاظ على الخلايا على الجليد ومراقبة الوقت في محلول تحلل RBC بعناية لمنع تحلل الخلايا المستهدفة. إذا كان تحلل RBC غير كاف، كرر الخطوة.
    4. أضف 10-20 مل من المخزن المؤقت HBSS+ لتحييد المخزن المؤقت لتحلل RBC. تترشح أجهزة الطرد المركزي عند 500 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    5. إذا كانت خلايا الدم الحمراء المحللة (خلايا الأشباح) تشكل طبقة غائمة فوق حبيبات الخلية ، فأعد تعليق الكريات في 10 مل من المخزن المؤقت HBSS + وقم بإجهاد التعليق من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر للقضاء على الخلايا الشبحية. قم بالطرد المركزي للترشيح عند 500 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتابع خطوات أخرى.
  4. استنزاف الخلايا المناعية والخلايا البطانية (خطوة اختيارية)
    1. استنزاف الخلايا البطانية CD31+ والخلايا المناعية CD45+ من مجموعة الخلايا الكلية باستخدام الميكروبيدات CD31 و CD45 المترافقة مع الأجسام المضادة CD31 و CD45 وحيدة النسيلة المضادة للإنسان (الماوس متساوي النمط IgG1) وأعمدة LS وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (جدول المواد).
    2. جمع التدفق من خلال، التي تتكون في المقام الأول من الخلايا الظهارية واللحمية ، في أنبوب معقم جديد وطرد مركزي في 500 × غرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإجراء عدد الخلايا للتأكد من إجمالي عدد الخلايا في التدفق من خلالها.
  5. تلطيخ سطح الخلية لفرز الخلايا المرتبطة بالتألق (FACS)
    1. أعد تعليق 1 × 107 خلايا لكل 1 مل من المخزن المؤقت HBSS+ . أضف الأجسام المضادة الأولية بالتركيز المطلوب واحتضن الخلايا لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام. في هذه الدراسة ، تم استخدام الأجسام المضادة الأولية المترافقة مع الفلوروفور ما لم ينص على خلاف ذلك. يتم وصف تفاصيل مصادر الأجسام المضادة والعيار في جدول المواد.
      ملاحظة: HTII-280 هو حاليا أفضل جسم مضاد تفاعلي سطحي يسمح بالإعداد الفرعي لخلايا الرئة البعيدة في مجرى الهواء في الغالب (HTII-280-) والسنخية من النوع 2 (HTII-280+) أجزاء الخلايا. تحذير من هذه الاستراتيجية هو أن خلايا AT1 ليست ملطخة باستخدام هذه الطريقة ويتم تمثيلها بشكل سيئ بسبب هشاشتها. ومع ذلك ، فإن خلايا AT1 ممثلة تمثيلا ضعيفا في تحضيرات الرئة البعيدة ، ويفترض أن يكون ذلك بسبب هشاشتها وفقدانها أثناء اختيار الخلايا القابلة للحياة بواسطة FACS ، وبالتالي لا تمثل سوى ملوث نادر لجزء خلية مجرى الهواء.
    2. اغسل الخلايا بإضافة 3 مل من المخزن المؤقت HBSS+ وأجهزة الطرد المركزي عند 500 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    3. في حالة استخدام أجسام مضادة أولية غير مقترنة ، أضف التركيز المطلوب من جسم مضاد ثانوي مترافق مع الفلوروفور مناسب واحتضانه لمدة 30 دقيقة على الجليد. اغسل الأجسام المضادة الثانوية الزائدة عن طريق إضافة 3 مل من المخزن المؤقت HBSS+ وأجهزة الطرد المركزي عند 500 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    4. تخلص من الخلايا الفائقة وأعد تعليقها في المخزن المؤقت HBSS+ لكل 1 × 107 خلايا/مل. قم بتصفية الخلايا إلى أنابيب بوليسترين سعة 5 مل من خلال غطاء مصفاة لضمان تكوين تعليق خلية واحدة. أضف DAPI (1 ميكروغرام / مل) إلى الخلايا الميتة (الميتة) القابلة للنفاذ.
      ملاحظة: من الضروري استخدام عناصر تحكم مناسبة أحادية اللون والتألق ناقص واحد (FMO) (أي كوكتيل تلطيخ الأجسام المضادة ناقص جسم مضاد واحد لكل منهما) ، لتقليل الإيجابيات الكاذبة أثناء FACS. في هذه الدراسة ، تم استخدام حبات الاختيار الإيجابية والسلبية للتعويض التجريبي عن تداخل أطياف الانبعاثات بين الفلوروفورات (جدول المواد). FACS إثراء أنواع الخلايا من الاهتمام. يتم إثراء الخلايا الظهارية القابلة للحياة بناء على النمط الظاهري لسطح الخلية السلبي CD45 و CD31 السلبي و CD236 الإيجابي وتلطيخ سلبي ل DAPI. يمكن إضافة جزء الخلية الظهارية هذا بناء على تلطيخ علامات السطح الخاصة بنوع الخلية ، مثل التلطيخ المحدد للخلايا الإيجابية HTII-280 التي يتم إثراؤها لخلايا AT2. في المقابل ، يسمح الاختيار السلبي ل HTII-280 بإثراء الخلايا الظهارية الصغيرة في مجرى الهواء مثل الخلايا الهربية والهدبية (الشكل 2).

3. إثراء والإعداد الفرعي للخلايا السلفية الظهارية من الشعب الهوائية القصبية الهوائية

  1. تحضير الأنسجة
    1. تشريح الشعب الهوائية القريبة (القصبة الهوائية / الشعب الهوائية) من الرئتين. فتح الشعب الهوائية على طولها باستخدام مقص لفضح التجويف وإضافة 50 ميكروغرام / مل Liberase لتغطية الأنسجة بالكامل.
    2. احتضن لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز المستمر باستخدام خلاط حراري مضبوط على 900 دورة في الدقيقة.
    3. قم بإزالة مجرى الهواء القريب من أنبوب جهاز الطرد المركزي وضعه في طبق بتري معقم (150 × 15 مم). كشط سطح مجرى الهواء بلطف باستخدام مشرط لتجريد الخلايا الظهارية المضيئة تماما من الأنسجة.
    4. اغسل طبق بتري ب 5 مل من المخزن المؤقت المعقم HBSS+ لجمع جميع الخلايا الظهارية المضيئة التي تم إزاحتها ونقل الخلايا التي تم إزاحتها إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي 50 مل. قم بمضاعفة التعليق عن طريق سحب إبرة 5x من خلال 16 G وإبرة 18 G المثبتة على حقنة 10 مل للحصول على تعليق خلية واحدة.
    5. الطرد المركزي التعليق عند 500 × غرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق الكريات في مخزن HBSS+ العازل الطازج وقم بتخزين خلايا مجرى الهواء المضيئة هذه على الجليد ، جاهزة للدمج مع تعليق الخلية الواحدة المتولد من الشعب الهوائية القريبة المفرومة في الخطوات القادمة.
    6. باستخدام المقص ، قم بقطع أنسجة القصبة الهوائية والشعب الهوائية المتبقية على طول حلقاتها لتوليد شرائط صغيرة من الأنسجة ، ونقل الشرائط إلى طبق بتري طازج. قم بفرم شرائط الأنسجة باستخدام شفرة حلاقة أحادية الجانب لصنع قطع أصغر.
      ملاحظة: نظرا لأن الشعب الهوائية القريبة غضروفية ، فلا يمكن فرمها بدقة مثل أنسجة الرئة البعيدة.
    7. انقل الأنسجة المفرومة إلى الأنابيب C ، وأضف 2 مل من Liberase إلى الأنبوب لضمان غمر الأنسجة. قم بتحميل الأنبوب C على الفاصل الآلي وقم بتشغيل بروتوكول الرئة البشرية-2 لفصل الأنسجة ميكانيكيا بشكل أكبر.
      ملاحظة: يقدم جهاز التفكيك المستخدم في هذا البروتوكول برنامجا محسنا يسمى بروتوكول الرئة البشرية-2 لهذا التطبيق المحدد (انظر جدول المواد).
  2. هضم الإنزيم وعزل الخلية الواحدة
    1. انقل ما يقرب من 2 جم من الأنسجة القريبة المفرومة من الأنبوب C إلى كل أنبوب طرد مركزي مخروطي 50 مل وأضف 50 ميكروغرام / مل ليبراز و 25 ميكروغرام / مل من محلول DNase إلى كل أنبوب.
      ملاحظة: لضمان التفكك الفعال ، يجب عدم ملء الأنابيب بعد علامة 30 مل.
    2. احتضن الأنسجة المفرومة لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز المستمر باستخدام خلاط مضبوط بسرعة 900 دورة في الدقيقة.
    3. قم بتمرير تعليق الأنسجة المنفصل من خلال سلسلة من مصافي الخلايا (500 ميكرومتر ، 300 ميكرومتر ، 100 ميكرومتر ، 70 ميكرومتر ، 40 ميكرومتر) تحت ضغط فراغ كما ذكر أعلاه وجمع التدفق من خلاله. اغسل المصفاة ب 20 مل من المخزن المؤقت HBSS+ لجمع الخلايا المتبقية.
      ملاحظة: نظرا لأن الأنسجة القريبة غضروفية وضخمة مقارنة بالأنسجة البعيدة ، فهناك احتمال أكبر لانسداد المرشحات. يمكن أن يساعد استخدام قمع في منع فيضان السائل أثناء المرور عبر المصفاة.
    4. أضف حجما متساويا من المخزن المؤقت HBSS+ إلى الترشيح لمنع نشاط Liberase ومنع الإفراط في الهضم. أضف خلايا مجرى الهواء القريبة المضيئة المعزولة من 3.1.5 إلى تعليق الخلية في هذه الخطوة.
    5. جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية المدمجة عند 500 × g لمدة 10 دقائق. قم بإزالة السوبرناتانت وكرر غسل الخلايا في المخزن المؤقت HBSS +. قم بإجراء استنزاف الخلايا المناعية CD45 + والخلايا البطانية CD31 + كما هو مذكور أعلاه في 2.4 (خطوة اختيارية).
    6. تشبه طرق التلطيخ أنسجة الرئة البعيدة ، اتبع الخطوات الواردة في 2.5. إثراء الخلايا الظهارية القابلة للحياة على أساس CD45 السلبي ، CD31 السلبي ، CD236 إيجابية سطح الخلية الظاهري والتلطيخ السلبي ل DAPI.
    7. قم بتعيين جزء الخلية الظهارية بشكل فرعي إضافي بناء على تلطيخ علامات السطح الخاصة بنوع الخلية ، مثل NGFR ، مما يسمح بإثراء أنواع الخلايا القاعدية (NGFR الإيجابية) وغير القاعدية (NGFR السلبية ؛ الإفرازية ، الهدبية ، العصبية الصماوية) (الشكل 3).

4. الثقافة العضوية

  1. أضف 5000 (يمكن تعديل هذا الرقم لإنتاج الكثافة المطلوبة من المواد العضوية الظهارية) فرز الخلايا الظهارية القريبة أو البعيدة إلى أنبوب معقم 1.5 مل جنبا إلى جنب مع 7.5 × 104 خلايا MRC-5 (خط الخلايا الليفية الرئوية البشرية). التفاعلات الظهارية الوسيطة ضرورية لتوسيع الخلايا السلفية.
  2. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: من المهم التأكد يدويا من عدد الخلايا الذي تم الحصول عليه من جهاز الفرز من أجل ضمان دقة كفاءة تشكيل المستعمرة العضوية.
  3. قم بإزالة والتخلص بعناية من supernatant وإعادة تعليق بيليه الخلية في 50 ميكرولتر من الوسائط الباردة المكملة بالمضادات الحيوية. حافظ على تعليق الخلية على الجليد.
  4. أضف 50 ميكرولتر من الجليد البارد 1x عامل نمو مستنفد مصفوفة الغشاء السفلي المتوسطة إلى القارورة وماصة بلطف التعليق على الجليد للخلط.
    ملاحظة: من المهم استخدام وسائط الثلج الباردة والحفاظ على الخلايا على الجليد لتجنب البلمرة المبكرة لوسط مصفوفة الغشاء السفلي.
  5. انقل تعليق الخلية إلى مزرعة خلايا بحجم 0.4 ميكرومتر بحجم المسام في صفيحة بئر 24 (1.4 × 104 خلايا / سم2) ، مع الحرص على تجنب إدخال فقاعات الهواء.
  6. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30-45 دقيقة للسماح للمصفوفة بالتصلب.
  7. أضف 600 ميكرولتر من وسط النمو المسخن مسبقا إلى البئر.
    ملاحظة: تم استكمال الوسائط بعوامل مضادة للفطريات (0.4٪) وبكتيريا القلم العقدي (1٪) لأول 24 ساعة بعد البذر ومثبط 10 ميكرومتر Rho kinase لأول 72 ساعة.
  8. الثقافة عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ لمدة 30 يوما ، وخلال هذه الفترة يجب تغيير الوسائط كل 48 ساعة.
    ملاحظة: يمكن تغيير مدة الثقافة بناء على الغرض من التجربة. تستخدم نقاط النهاية الأطول لدراسة التمايز في حين يمكن استخدام نقاط النهاية الأقصر من 7 أيام و 14 يوما وما إلى ذلك إذا لم يكن الغرض من التجربة هو تحقيق التمايز الكامل.
  9. أضف مثبط 10 μM TGFβ إلى وسائط الثقافة لمدة 15 يوما للحفاظ على الخلايا في مرحلة التكاثر وقمع فرط نمو الخلايا الليفية.
    ملاحظة: تختلف النتائج وفقا لوسيط الثقافة المستخدم في الفحص. على سبيل المثال ، تم إنشاء النتائج الموضحة هنا باستخدام Pneumacult-ALI Medium ، مما يؤدي إلى توليد عضويات كبيرة من الرئة البعيدة ، وعضويات متمايزة جيدا وأكبر من الرئة القريبة.

5. تلطيخ العضوية

  1. تثبيت وتضمين المواد العضوية
    1. شفط الوسائط من كل من الغرف العلوية والسفلية عبر الغشاء إدراج وشطفها مرة واحدة مع PBS الدافئة.
    2. إصلاح الثقافات عن طريق وضع 300 ميكرولتر من PFA (2٪ w / v) في الإدراج و 500 ميكرولتر في البئر لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. قم بإزالة المثبت وشطفه باستخدام PBS الدافئ مع الحرص على عدم إزاحة قابس مصفوفة غشاء basememt.
      ملاحظة: يمكن تخزين المواد العضوية الثابتة مغمورة في PBS عند 4 درجات مئوية لمدة أسبوع إلى أسبوعين قبل البدء في خطوات أخرى.
    3. شفط PBS ، عكس الإدراج وقطع غشاء الإدراج بعناية حول محيطه. باستخدام ملقط ، قم بإزالة غشاء transwell ، مع الحرص على عدم إزعاج قابس المصفوفة.
    4. في طبق بتري، اضغط على الإدراج لاستعادة قابس المصفوفة.
    5. أضف قطرة من جل معالجة العينات مثل Histogel (يتم الحفاظ عليه عند 37 درجة مئوية) إلى قابس المصفوفة واحتفظ به عند 4 درجات مئوية حتى يتصلب الهلام.
    6. انقل القابس إلى كاسيت مضمن ، وجفف من خلال زيادة تركيزات الإيثانول (70 و 90 و 100٪) ، واضحة في الزيلين ومضمنة في شمع البارافين.
    7. قطع مقاطع 7 ميكرومتر على ميكروتوم وجمعها على شرائح مشحونة إيجابيا.
  2. تلطيخ التألق المناعي للعضويات
    1. ضع الشرائح على درجة حرارة 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لإزالة الشمع.
    2. قم بإزالة البارافين من الأقسام عن طريق الغمر في الزيلين وإعادة الترطيب من خلال تقليل تركيزات الإيثانول.
    3. قم بإجراء استرجاع المستضد عالي الحرارة في محلول كشف المستضد ، قاعدة حامض الستريك باستخدام مسترد متاح تجاريا عن طريق غمس الشرائح في المحلول لمدة 15 دقيقة (جدول المواد).
    4. أحط الأنسجة بحاجز مسعور باستخدام قلم عنق الرحم.
    5. منع التلطيخ غير المحدد بين الأجسام المضادة الأولية والأنسجة، عن طريق الحضانة في المخزن المؤقت للحجب.
    6. احتضان الأقسام في التركيز المناسب للأجسام المضادة الأولية المخففة في محلول الحضانة بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية في غرفة رطبة.
    7. شطف الأقسام 3x في درجة حرارة الغرفة مع مخزن مؤقت للغسيل.
    8. احتضان في التركيز المناسب من الأجسام المضادة الثانوية المقترنة بالفلوروكروم لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    9. شطف الأقسام 3x في درجة حرارة الغرفة مع 0.1٪ Tween 20-TBS. احتضان الأقسام لمدة 5 دقائق في DAPI (1 ميكروغرام / مل). اشطف المقاطع مرة واحدة في TBS (محلول ملحي مخزن مؤقتا ب Tris) بنسبة 0.1٪ Tween 20 ، وجففه وقم بتركيبه في محلول تركيب (الشكل 4 والشكل 5).
      ملاحظة: يتم تضمين المصدر والتخفيف الأمثل للعمل للأجسام المضادة الأولية والثانوية المستخدمة في تلطيخ التألق المناعي في جدول المواد.

النتائج

مصدر أنسجة الرئة
تم استخدام القصبة الهوائية والقصبات الهوائية خارج الرئة (الشكل 1A) كنسيج مصدر لعزل الخلايا الظهارية في مجرى الهواء القريب والجيل اللاحق من المواد العضوية القريبة. تم استخدام أنسجة الرئة البعيدة التي تشمل كل من الحمة والممرات الهوائية الصغيرة ال...

Discussion

نحن نصف طريقة موثوقة لعزل مجموعات فرعية محددة من خلايا الرئة عن أنسجة الرئة البشرية إما للتحليل الجزيئي أو الوظيفي ونمذجة الأمراض. وتشمل العناصر الحاسمة للطرق القدرة على تحقيق تفكك الأنسجة مع الحفاظ على الظهارات السطحية، والتي تسمح بالإثراء بوساطة الأجسام المضادة للخلايا المعزولة حديث?...

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

نحن نقدر الدعم المقدم من ميزونو تاكاكو لمؤسسة التمويل الدولية و H و E تلطيخ ، فانيسا غارسيا لتقسيم الأنسجة و Anika S Chandrasekaran للمساعدة في إعداد المخطوطات. يتم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (5RO1HL135163-04 ، PO1HL108793-08) واتحاد Celgene IDEAL.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell Isolation
10 mL Sterile syringes, Luer-Lok TipFisher scientificBD 309646
30 mL Sterile syringes, Luer-Lok TipVWRBD302832
Biohazard bagsVWR89495-440
Biohazard bagsVWR89495-440
connecting ringPluriselect41-50000-03
Deoxyribonuclease (lot#SLBF7798V)sigma AldrichDN25-1G
Disposable Petri dishesCorning/Falcon25373-187
FunnelPluriselect42-50000
HBSSCorning21-023
Liberase TM Research Gradesigma Aldrich5401127001
needle 16GVWR305198
needle 18GVWR305199
PluriStrainer 100 µm (Cell Strainer)Pluriselect43-50100-51
PluriStrainer 300 µm (Cell Strainer)Pluriselect43-50300-03
PluriStrainer 40 µm (Cell Strainer)Pluriselect43-50040-51
PluriStrainer 500 µm (Cell Strainer)Pluriselect43-50500-03
PluriStrainer 70 µm (Cell Strainer)Pluriselect43-50070-51
Razor bladesVWR55411-050
Red Blood Cell lysis buffereBioscience00-4333-57
Equipment’s
GentleMACS C TubesMACS Miltenyi Biotec130-096-334
GentleMACS Octo DissociatorMACS Miltenyi Biotec130-095-937
Leica ASP 300s Tissue processor
LS ColumnsMACS Miltenyi Biotec130-042-401
MACS MultiStand**Miltenyi Biotech130-042-303
ThermomixerEppendorf05-412-503
ThermomixerEppendorf05-412-503
HBSS+ Buffer
Amphotericin BThermo fisher scientific152900182ml
EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-freeThermo fisher scientificAM9260G500µl
Fetal Bovine SerumGemini Bio-Products100-10610ml
HBSS Hank's Balanced Salt Solution 1X 500 mlVWR45000-456500ml bottle
HEPES (1 M)Thermo fisher scientific156300805ml
Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic MixtureThermo fisher scientific156400555ml
List of antibodies for FACS
Alexa Fluor 647 anti-human CD326 (EpCAM) AntibodyBioLegend3698201:50
BD CompBead Anti-Mouse Ig, K/ Negative control particles setFisher ScientificBDB552843
CD31 MicroBead Kit, humanMiltenyi Biotec130-091-93520µl/ 107 total cells
CD45 MicroBeads, humanMiltenyi Biotec130-045-80120µl/ 107 total cells
DAPISigma AldrichD9542-10MG1:10000
FITC anti-human CD235aBioLegend3491041:100
FITC anti-human CD31BioLegend3031041:100
FITC anti-human CD45BioLegend3040541:100
FITC anti-mouse IgM AntibodyBioLegend4065061:500
Mouse IgM anti human HT2-280Terrace BiotechTB-27AHT2-2801:300
PE anti-human CD271(NGFR)BioLegend3451061:50
Composition of Organoid Culture mediums
MRC-5ATCCCCL-171
PneumaCult -ALI MediumStemcell Technologies5001
Small Airway Epithelial Cell Growth MediumPromoCellC-21170
ThinCert Tissue Culture Inserts, SterileGreiner Bio-One662641
Y-27632 (ROCK inhibitor) 100mM stock (1000x)Stemcell Technologies72302
Mouse Basal medium:
Amphotericin BThermo fisher scientific1529001850 µl
DMEM/F-12, HEPESThermoFisher scientific1133003250 ml
Fetal Bovine SerumGemini Bio-Products100-1065 ml
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100X)ThermoFisher scientific41400045500 µl
Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic MixtureThermo fisher scientific15640055500 µl
SB431542 TGF-β pathway inhibitor (stock 100 mM)Stem cell722345 µl
List of antibodies for Immunohistochemistry
Antigen unmasking solution, citric acid basedVectorH-3300937 µl in 100ml water
HistogelThermo ScientificHG-4000-012
Primary Antibodies
Anti HT2-280TerracebiotechTB-27AHT2-2801:500
FOXJ1 Monoclonal Antibody (2A5)Thermo Fisher Scientific14-9965-821:300
Human Uteroglobin/SCGB1A1 AntibodyR and D systemsMAB42181:300
Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified [Poly9059]Biolegend9059011:500
MUC5AC Monoclonal Antibody (45M1)Thermo Fisher ScientificMA5-121781:300
PDPN / Podoplanin Antibody (clone 8.1.1)LifeSpan BiosciencesLS-C143022-1001:300
Purified Mouse Anti-E-CadherinBD biosciences6101821:1000
Sox-2 AntibodySanta Cruz biotechnologiessc-3659641:300
Secondary Antibodies
Donkey anti-rabbit lgG, 488Thermo Fisher ScientificA-212061:500
FITC anti-mouse IgM AntibodyBioLegend4065061:500
Goat anti-Hamster IgG (H+L), Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA-211131:500
Goat anti-Mouse IgG1 Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-211211:500
Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-211311:500
Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA-211341:500
Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA-211441:500
Buffers
Immunohistochemistry Blocking Solution3% BSA, o.4% Triton-x100 in TBS (Tris based saline)
Immunohistochemistry Incubation Solution3% BSA, ).1% Triton-X100 in TBS
Immunohistochemistry Washing SolutionTBS with 0.1% Tween 20

References

  1. Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
  2. Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
  3. Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
  4. Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
  5. Barkauskas, C. E., et al. Lung organoids: current uses and future promise. Development. 144 (6), 986-997 (2017).
  6. Leeman, K. T., Fillmore, C. M., Kim, C. F. Lung Stem and Progenitor Cells in Tissue Homeostasis and Disease. Stem Cells in Development and Disease. 107, 207-233 (2014).
  7. Rawlins, E. L., et al. The Role of Scgb1a1(+) Clara Cells in the Long-Term Maintenance and Repair of Lung Airway but Not Alveolar, Epithelium. Cell Stem Cell. 4 (6), 525-534 (2009).
  8. Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
  9. Chang, W. I., et al. Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements. Plos Genetics. 4 (4), 1000050 (2008).
  10. McQualter, J. L., Bertoncello, I. Concise Review: Deconstructing the Lung to Reveal Its Regenerative Potential. Stem Cells. 30 (5), 811-816 (2012).
  11. Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a Biomarker Specific to the Apical Plasma Membrane of Human Lung Alveolar Type II Cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58 (10), 891-901 (2010).
  12. Rock, J. R., et al. Notch-Dependent Differentiation of Adult Airway Basal Stem Cells. Cell Stem Cell. 8 (6), 639-648 (2011).
  13. Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond. Cell and Tissue Research. 352 (1), 123-131 (2013).
  14. Hynds, R. E., Giangreco, A. Concise Review: The Relevance of Human Stem Cell-Derived Organoid Models for Epithelial Translational Medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
  15. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), (2014).
  16. Weber, C. Organoids test drug response. Nature Cell Biology. 20 (6), 634 (2018).
  17. Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
  18. Nikolic, M. Z., Rawlins, E. L. Lung Organoids and Their Use To Study Cell-Cell Interaction. Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).
  19. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  20. Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nature Methods. 2 (5), 333-336 (2005).
  21. Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-961 (2014).
  22. Teisanu, R. M., et al. Functional analysis of two distinct bronchiolar progenitors during lung injury and repair. American Journal of Respiratory and Cellular Molecular Biology. 44 (6), 794-803 (2011).
  23. Chen, H., et al. Airway epithelial progenitors are region specific and show differential responses to bleomycin-induced lung injury. Stem Cells. 30 (9), 1948-1960 (2012).
  24. Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
  25. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  26. Jain, A., et al. Primary Human Lung Alveolus-on-a-chip Model of Intravascular Thrombosis for Assessment of Therapeutics. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).
  27. Mulay, A., et al. SARS-CoV-2 infection of primary human lung epithelium for COVID-19 modeling and drug discovery. bioRxiv. , (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

161 FACS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved